Name: real-time in vitro monitoring of odorant receptor activation by an odorant in the vapor phase
Uploaded: 2019-04-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase at JoVE.com

وأيد هذا العمل المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (DC014423 و DC016224) والدفاع المتقدم المشروع وكالة ريلنوسي المشروع البحثي. يلافن بقي في جامعة ديوك بدعم مالي من برنامج JSPS "النهوض بالشبكات الدولية الاستراتيجية" للتعجيل "تداول الباحثين الموهوبين" (R2801). ونشكر كليم سهر على تحرير المخطوطة.

1-Hana3A خلايا الثقافة
<ol><li>إعداد M10 (الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (MEM) زائد 10% v/v مصل الدم البقري الجنين (FBS)) و M10PSF (M10 بالإضافة إلى 100 ميكروغرام/مل البنسلين-ستربتوميسين و 1.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين ب).</li>
	<li>ثقافة الخلايا في 10 مل M10PSF في صحن ثقافة خلية 100 ملم في حاضنة في غاز ثاني أكسيد الكربون (CO<su...

الإحساس برائحة تعتمد اعتماداً أساسيا على التفعيل لأملاح الإماهة الفموية. ونتيجة لذلك، فهم وظيفة كل منها مطلوب للقضاء الآليات المعقدة التي تستخدم الدماغ لإدراك بيئتها الكيميائية المتطايرة. ومع ذلك، قد أعاق فهم هذه العملية الصعوبات في إنشاء وسيلة قوية الشاشة أو مرجع للحصول على وظائف ضد أو...

حاسة الشم يسمح الحيوانات البرية للتفاعل مع بيئتها الكيميائية المتطايرة للسلوكيات محرك الأقراص والعواطف. وتبدأ عملية الكشف عن رائحة أساسا، مع تفاعل جزيئات الرائحة الأولى مع نظام حاسة الشم، على مستوى الرائحة مستقبلات (أملاح الإماهة الفموية)1. في الثدييات، وأملاح الإماهة الفموية فردياً يعبر عن حاسة الشم العصبية الحسية (أوسنس) تقع في حاسة الشم ظهارة2. أنها تنتمي لعائلة مستقبلات (GPCR) مقترنة بالبروتين ز وأكثر دقة للأسرة الفرعية مثل رودوبسين (وتسمى أيضا الفئة A). زوجين أملاح الإماهة الفموية وتنشيطية ز البروتين زجبهة تحرير أورومو التنشيط الذي يؤدي إلى إنتاج المخيم متبوعاً بفتح قنوات دوري النوكليوتيدات بوابات وتوليد إمكانات العمل. من المسلم به أن الإدراك رائحة يعتمد على نمط محدد من أملاح الإماهة الفموية المنشط3،4 ويترتب على ذلك الاعتراف برائحة مخطط ترميز اندماجي، حيث يمكن تفعيلها أو واحد من مجموعة من أودورانتس والرائحة واحدة يمكن تنشيط مزيج من أملاح الإماهة الفموية. ومن خلال هذا الترميز اندماجي، افترض أن الكائنات الحية يمكن الكشف عن وأن تميز بين عدد وافر جزيئات رائحة متقلبة. واحد من مفاتيح لفهم كيف تعتبر الروائح أن نفهم كيف والذي يتم تنشيط أملاح الإماهة الفموية من رائحة معينة.
في محاولة لتوضيح الرائحة-أو التفاعلات، في المختبر فحوصات فنية لعبت دوراً أساسيا. تم تحديد مؤثر يغاندس معطر لليتيم أملاح الإماهة الفموية (أو دي أورفانيزيشن) حقل نشط جداً طوال السنوات العشرين الماضية، من خلال استخدام مختلف في المختبر، السابقين فيفو والاختبارات الوظيفية المجراة في5،6،7 ،،من89،10،11،،من1213،14،15،16، 17.
نظم الفحص في المختبر الأنسب لتوصيف وظيفي مفصل من أملاح الإماهة الفموية، بما في ذلك تحديد مجالات وظيفية والبقايا الحرجة من أملاح الإماهة الفموية، فضلا عن التطبيقات الهندسية المحتملة. ومع ذلك، كذلك تطوير نظم القيم في المختبر لأملاح الإماهة الفموية قد تحديا، ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة مع أوسنس تثقيف والتعبير الوظيفي من أملاح الإماهة الفموية في خلايا مغايرة. وكان التحدي الأول وضع البروتوكولات التي تسمح بالتعبير الخلية السطحية من أملاح الإماهة الفموية الفنية في رسم خرائط للرائحة-أو التفاعلات. وقد استخدمت عددا من المجموعات المستقلة مختلف النهج5،6،،من78،9،10،11،12، 14،18،،من1920. أحد إنجازات أقرب كان أدلى بها كروتوورست et al في المعلمة N-المحطة من أملاح الإماهة الفموية مع تسلسل تقصير من رهودوبسن (رو-العلامة) ولاحظ تعبير سطحية محسنة في خلايا الكلي الجنينية البشرية (HEK)13. الاختلافات إلى علامة تعلق على التسلسل أو لا يزال مسار البحث لتحسين أو التعبير ووظائف19،21. سايتو et al. ثم حدد نقل مستقبلات البروتين 1 (RTP1) و RTP2 التي تيسر أو الاتجار. 22 نسخة أقصر من RTP1، يسمى RTP1S، كما تبين أن يكون أكثر فعالية من البروتين الأصلي23. تطوير خط الخلية (Hana3A) الذي يعرب ستابلي زجبهة تحرير أورومو، REEP1، RTP1، و RTP2 24، مقترنة باستخدام الصحفيين دوري الادينوسين الأدينوزين (معسكر) قد مكن تحديد الرائحة-أو التفاعلات. ما زال يتعين تحديد الآلية التي تعزز الأسرة RTP البروتينات التعبير الخلية السطحية من أملاح الإماهة الفموية.
التحذير واحد من هذه الأساليب المتبعة أنها تعتمد على تحفيز الرائحة في الطور السائل، بمعنى أن أودورانتس تذاب مسبقاً إلى وسيلة تحفيز وتنشيط الخلايا بالاستعاضة عن المتوسط. هذا متميز جداً من الظروف الفسيولوجية حيث يصل إلى ظهارة حاسة الشم في مرحلة البخار جزيئات الرائحة وتنشيط أملاح الإماهة الفموية بانحلال في الغشاء المخاطي الأنفي. أكثر شبهاً التعرض الحوافز ذات الصلة الفيزيولوجية، اقترح سانز et al.20 مقايسة استناداً إلى تحفيز البخار بتطبيق قطره حل الرائحة معطلاً تحت الوجه الداخلي للفيلم البلاستيك توضع على رأس الخلية الآبار. أنها سجلت الردود الكالسيوم عن طريق رصد كثافة الأسفار. هذا الأسلوب كان الأول من استخدم الهواء-المرحلة الرائحة التحفيز، ولكن لم تسمح بفرز كبيرة للتنشيط أو.
وهنا، قمنا بتطوير أسلوب جديد يتيح للرصد في الوقت الحقيقي في المختبر أو التنشيط عن طريق حفز الرائحة مرحلة البخار بمقايسة جلوسينسور (الشكل 1). وقد استخدمت هذه المقايسة سابقا في سياق الرائحة السائل التحفيز18،19،25،26،27،،من2829، 30 , 31-قاعة الرصد لومينوميتير هو اكويليبراتيد أولاً مع الرائحة يتبخر قبل لوحة القراءة (الشكل 1أ). جزيئات الرائحة، ثم ومذاوبة إلى المخزن المؤقت، والاستحمام الخلايا Hana3A التعبير عن أو الفائدة، RTP1S والبروتينات جلوسينسور (الشكل 1ب). إذا كانت الرائحة مؤثر أو، أو سوف التبديل إلى تكيف المنشط وربط مجموعةجبهة تحرير أورومو، تفعيل adenylyl cyclase (AC)، وتسبب في نهاية المطاف إلى ارتفاع مستويات المخيم. سيتم ربط هذا المخيم ارتفاع وتنشيط البروتين جلوسينسور لتوليد التﻷلؤ تحفيز لوسيفرين. ثم يتم تسجيلها لومينوميتير هذا التﻷلؤ ويتيح رصد أو التنشيط. هذا الأسلوب لفائدة عالية في سياق ديورفانيزيشن أو أنه يجلب في المختبر أنظمة أقرب إلى تصور الطبيعية من الروائح الكريهة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:867px;" width="866">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">0.05 % trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:93px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td style="width:449px;">0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm cell culture dish&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm x 20 mm cell culture dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 mL tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352099</td>
			<td style="width:449px;">17 mm x 120 mm conical tubes</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">96-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3843</td>
			<td style="width:449px;">96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Amphotericin</td>
			<td style="width:93px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15290-018</td>
			<td style="width:449px;">Amphotericin B 250 &#181;g/mL - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuge machine</td>
			<td>Jouan</td>
			<td>C312</td>
			<td style="width:449px;">Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Class II Type A/B3 fumehood</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU-407-500</td>
			<td style="width:449px;">fumehood for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">FBS</td>
			<td style="width:93px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000-044</td>
			<td style="width:449px;">Fetal Bovine Serum - store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">GloSensor cAMP Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E1290</td>
			<td style="width:449px;">GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Incubator 37 &#176;C; 5 % CO2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-604</td>
			<td style="width:449px;">Incubator for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td style="width:449px;">Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luminometer POLARstar OPTIMA</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>discontinued</td>
			<td style="width:449px;">96 well plate reader for luminescence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:205px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410</td>
			<td style="width:449px;">Solvent for odorants - store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:205px;">Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td style="width:449px;">Minimum Essential Medium Eagle with Earle&#8217;s salts &#38; L-glutamine - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:205px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:449px;">Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:205px;">pGlosensor</td>
			<td style="width:93px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2301</td>
			<td style="width:449px;">pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">phase contrast microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>090-131.001</td>
			<td style="width:449px;">phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:205px;">RTP1S</td>
			<td style="width:93px;">H. Matsunami lab</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:449px;">100 ng/&#181;L plasmid - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time in vitro monitoring of odorant receptor activation by an odorant in the vapor phase

تصور حاسة الشم تبدأ مع تفاعل أودورانتس مع مستقبلات الرائحة (أو) أعرب عن طريق الخلايا العصبية الحسية حاسة الشم (OSN). ويتبع الاعتراف برائحة مخطط ترميز اندماجي، حيث يمكن تفعيلها أو واحد من مجموعة من أودورانتس والرائحة واحدة يمكن تنشيط مزيج من أملاح الإماهة الفموية. من خلال هذا الترميز اندماجي، يمكن الكشف عن الكائنات الحية وتميز بين عدد وافر جزيئات رائحة متقلبة. وهكذا، يمكن وصف رائحة بتركيز معين عن طريق نمط تنشيط من أملاح الإماهة الفموية، ومحددة لكل رائحة. وبهذا المعني، تكسير الآليات التي يستخدمها الدماغ لإدراك رائحة يتطلب الرائحة فهم-أو التفاعلات. هذا السبب في أن المجتمع أولفاكتيون ملتزمة "دي أورفانيزي" هذه المستقبلات. نظم في المختبر التقليدية المستخدمة لتحديد الرائحة-أو التفاعلات استخدمت تحضين خلية الإعلام مع الرائحة، الذي يختلف عن كشف الروائح عن طريق حل أودورانتس البخار الطبيعي في الغشاء المخاطي للأنف قبل التفاعل مع أملاح الإماهة الفموية. هنا، يمكننا وصف أسلوب جديد يسمح للرصد في الوقت الحقيقي للتنشيط أو عبر مرحلة البخار odorants. لدينا أسلوب يعتمد على قياس الإفراج عن المخيم التﻷلؤ استخدام الإنزيم جلوسينسور. أنه يسد الثغرات الحالية بين النهج المجراة في وفي المختبر، ويوفر أساسا لاستشعار المحاكاة البيولوجية كيميائية المتطايرة.

نحن فحص الاستجابة لثلاثة من الماوس أملاح الإماهة الفموية و Olfr746 و Olfr124 و Olfr1093 باستخدام سينمالدهيد بخار التحفيز (الشكل 3). في نفس الوقت، كنا ناقلات فارغة (رو-pCI) لضمان أن الأنشطة المستحثة بالرائحة من أملاح الإماهة الفموية اختبارها كانت محددة (الشكل 3أ)....

Watch this Scientific Journal Video about Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase at JoVE.com

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

فسيولوجيا، يتم تنشيط مستقبلات الرائحة من جزيئات الرائحة المستنشقة في مرحلة البخار. ومع ذلك، استخدام معظم النظم في المختبر التحفيز الرائحة الطور السائل. نقدم هنا، أسلوب الذي يسمح للرصد في الوقت الحقيقي في المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة عند التحفيز الرائحة في مرحلة البخار.

في الوقت الحقيقي رصد المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة بالرائحة في مرحلة البخار

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

بروتوكول لدينا تمكن من قياس الكشف عن والتمييز من الروائح المتقلبة مع لوحة من مستقبلات الرائحة. هذه الطريقة تفتح إمكانية تطوير biosensors القائمة على مستقبلات الرائحة. هذه التقنية تسمح في الوقت الحقيقي في المختبر الرصد من تنشيط مستقبلات الرائحة على جزيئات ذات رائحة في مرحلة البخار.أنه يسد الفجوة بين في المختبر وفي في النهج. يمكن استخدام هذه الطريقة لفهم حركية الأحداث التي تؤدي إلى إدراك الرائحة ، بما في ذلك دور الإنزيمات الأيضية المخاطية. للبدء، قم بإعداد M10 و M10 PSF وفقًا للمخطوطة.وتزرع الخلايا في 10 ملليلتر من M10 PSF في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. مراقبة طبق الثقافة تحت مجهر النقيض مرحلة. عندما تصل إلى 100٪ التقاء، وتقسيم الخلايا إلى تركيز أقل عن طريق التعرق وسائل الإعلام وغسل الخلايا بلطف مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.ثم التعرق في برنامج تلفزيوني وإضافة ثلاثة ملليلترات من التربسين EDTA. السماح لها تتفاعل لمدة دقيقة واحدة تقريبا حتى الخلايا تنفصل عن الطبق. إضافة خمسة ملليلتر من M10 إلى تعطيل التربسين، وماصة صعودا وهبوطا لفصل الخلايا المرفقة إلى الطبق.نقل ثمانية ملليلتر من تعليق الخلية من الطبق إلى أنبوب 15 ملليلتر، والطرد المركزي الأنبوب في 200-G لمدة خمس دقائق. التعرق وssuspend الخلايا في خمسة ملليلتر من PSF M10 عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا لتفريق أي كتلة الخلية. تجنب خلق فقاعات في أنبوب.للحصول على التقاء 20٪ من الخلايا، أضف تسعة ملليلترات من M10 PSF في طبق جديد لثقافة الخلايا 1، 000 ملليمتر، ونقل ملليلتر واحد من محلول الخلية resuspended. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. هذا الطبق، يجلس في التقاء 20٪، وسوف تصل إلى 100٪ التقاء في 48 ساعة.ضع الطبق تحت مجهر النقيض من المرحلة لمراقبة. اتخاذ 1/10 من 100٪ طبق ثقافة التقاء الخلية. التعرق وسائل الإعلام وغسل الخلايا بلطف مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.ثم تعامل الخلايا مع التربسين-EDTA وM10، والطرد المركزي، وعلاج مرة أخرى مع M10 PSF كما أجريت سابقا. لتحقيق واحد 96 جيدا لوحة، إضافة 500 ميكرولترات من خمسة ملليلتر من الخلايا resuspended إلى 5.5 ملليلتر من M10 PSF الطازجة. مزيج الخلايا وM10 PSF دون توليد فقاعات الهواء.Pipette 50 ميكرولترات من الخلايا المعلقة المخففة في كل بئر من لوحة 96-جيدا باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أولاً، ضع لوحة 96 بئرًا مثقفة بين عشية وضحاها تحت مجهر تباين المرحلة، وارصد التقاء الخلايا، وتأكد من أنها بين 30٪ و50٪ أعد مزيجًا أولًا من عملية نقل في أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على البلازميدات الشائعة في اللوحة بأكملها وفقًا للمخطوطة.Rho-pCi هو تحكم سلبي فارغ ناقل، وOlfr1377 هو عنصر تحكم إيجابي معروف للاستجابة إلى الأستوبينون المُختبر. تقسيم المزيج إلى اثنين من يمزج transfection التي تحتوي على واحد من plasmids التحكم. إعداد مزيج الثانية transfection تحتوي على 500 ميكرولترات من MEM و 20 ميكرولترات من يبوفكتامين 2000 كاشف.إضافة نصف المزيج الثاني إلى كل خزان جيدا ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. احتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة خمسة ملليلتر من M10 لطبقة واحدة 96-well.إضافة 2.5 ملليلتر في كل خزان جيدا ويخلط بلطف. استبدل M10 PSF في اللوحة ذات الـ96 بئرًا المطلية سابقًا بـ 50 ميكرولترات من وسائط النقل النهائية. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.ثم افتح باب المضيء وأدخل الأنبوب المتصل بمضخة الفراغ. فراغ غرفة من المضيء بين عشية وضحاها. بعد transfection، لاحظ لوحة 96-جيدا تحت المجهر النقيض مرحلة لضمان التقاء الخلايا بين 60٪ و 100٪ إعداد حل التحفيز من حل الملح المتوازن هانك التي تحتوي على 10 ملليمولار من HEPES وخمسة ملليمولار من د-جلوكوز.إزالة المتوسطة transfection من لوحة 96-جيدا وغسل الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولترات من محلول التحفيز الطازج لكل بئر. لتخفيف محلول كاشف cAMP GloSensor، فإن ماصة 2.75 ملليلتر من محلول التحفيز إلى أنبوب من خمسة ملليلتر وإضافة 75 ميكرولترات من محلول الكواشف cAMP. إزالة حل التحفيز من الآبار، وإضافة 25 ميكرولترات من محلول كاشف cAMP المخفف لكل بئر.احتضان لوحة 96-well في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة وخالية من الرائحة لمدة ساعتين. أولاً، تمييع الأسيتوبينون المُعَد إلى 1٪ في 10 ملليلترات من الزيت المعدني وسقف الأنبوب. قبل نهاية وقت الحضانة cAMP، إضافة 25 ميكرولترات من الحل رائحة لكل بئر في لوحة جديدة 96-جيدا.ثم ضع هذه اللوحة ذات الرائحة في غرفة المضيء لمدة خمس دقائق لتكبيل الغرفة بجزيئات ذات رائحة متطايرة. تعيين مضيئة لتسجيل الإنارة مع ثواني الصفر من التأخير خلال 20 دورة من قياس لوحة 90 ثانية، مع 0.7 ثانية من الفاصل بين الدورات. الحق قبل قراءة لوحة، وإزالة لوحة رائحة من الغرفة.في لوحة 96-well التي تحتوي على الخلايا المصابة، إضافة 25 ميكرولترات من رائحة في الفضاء بين الآبار، وسرعان ما وضع لوحة مرة أخرى إلى الغرفة. ابدأ قياس الإنارة لجميع الآبار لمدة 20 دورة في غضون 30 دقيقة. بعد قياس الإضاءة، قم بإزالة الرائحة المتبقية داخل المضيء عن طريق كنس الروائح في غرفة القراءة على نطاق واسع لمدة ساعتين على الأقل.استبدال مع الهواء النقي عن طريق إرسال الهواء المضغوط لمدة خمس دقائق قبل احتضان رائحة المقبل لتجنب التلوث المتبادل من المواد المتطايرة رائحة. لبدء تحليل البيانات، قم بتصدير البيانات من برنامج المضيءميتر. متوسط النسخ المتماثلة لنفس أو لكل وقت تسجيل.لحساب استجابة OR التي تم تسويتها إلى أي عنصر تحكم في نهاية المطاف، قم بتقسيم قيمة متوسطة المتجهات الفارغة إلى قيمة OR-averaged في كل وقت تسجيل. تطبيع كل استجابة OR إلى النشاط القاعدي عن طريق تقسيم متوسط أو استجابة في صفر ثانية لكل رد وقت التسجيل. للحصول على قيمة استجابة OR واحدة لمنحنى كل أو، قم بتلخيص كافة قيم الإضاءة لكل وقت تسجيل لكل أو لكي تحصل على المساحة تحت المنحنى.في هذه التجربة، تم رصد التنشيط في الوقت الحقيقي من الفئران ORs على حافز بخار الرائحة أكثر من 20 دورات القياس. واستُخدمت مكافحة ناقلات فارغة لضمان أن الأنشطة التي يسببها الروائح التي تُجرى في الموارد الخارجية التي تم اختبارها محددة. تم أولاً تطبيع البيانات لكل بئر إلى قيمة معدل معدل مكافحة النواقل الفارغة لكل دورة.ثم، لمقارنة ردود ORs',مختلفة، تم تطبيع البيانات إلى مستويات OR النشاط القاعدي في هذا الفحص. وقد حسبت قيم التفعيل الواحد لكل وحدة من الفئات عن طريق حساب المساحة تحت المنحنى لكل أو من هذه العمليات عن طريق جمع قيم الانبعاثات في جميع دورات القياس. بالإضافة إلى ذلك, يمكن قياس الاستجابات تعتمد على الجرعة باستخدام جرعات ذات رائحة متزايدة.تم تسجيل استجابة Olfr1377 لتحفيز الأسيتوفينون في خمسة تركيزات. فقط التركيزات الثلاثة الأعلى كانت قادرة على تنشيط Olfr1377. يظهر التحفيز المركب النقي ميلًا إلى تقليل استجابة OR بمرور الوقت ، على الأرجح بسبب سمية الخلية.خلال هذه الخطوة، يجب إضافة رائحة المخفف بين البئر، وتكون على استعداد للبدء بسرعة تسجيل لوحة. وينبغي التقليل من الوقت بين إضافة الرائحة والرصد وثابت بين تجربتين. في الخلايا الأذينة هي المواد الحية الخطر، لذلك أذكر للتخلص من الخلايا في المستوصفات المناسبة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

الرائحة التي يسببها الردود المسجلة من الخلايا العصبية مستقبلات الشم باستخدام تقنية شفط الماصة

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

رصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وفعالية متشابك في الرخويات<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

بروتوكول "الإدارة في الوقت الحقيقي" في الرنين المغناطيسي الوظيفي Neurofeedback التدريب

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

فحص لقياس نوكلوسيتوبلاسميك النقل في الوقت الحقيقي داخل موتور الخلايا العصبية مثل نسك-34 الخلايا

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

خلية يعيش "قياس الرائحة مستقبلات التنشيط باستخدام" مقايسة مخيم في الوقت الحقيقي

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

توطين الجينات مستقبلات أودورانت في هوائيات الجراد بواسطة الحمض النووي الريبي<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

الكينماتيكا العين التي تقاس في المختبر حفز الأعصاب في السلحفاة

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...