Name: real-time in vitro monitoring of odorant receptor activation by an odorant in the vapor phase
Uploaded: 2019-04-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom NIH (DC014423 und DC016224) und der Defense Advanced Research Agentur RealNose Projekt unterstützt. YF blieb an der Duke University mit finanzieller Unterstützung von JSPS Programm zur Förderung der strategischen internationale Netzwerke, die Zirkulation der talentierte Forscher (R2801) zu beschleunigen. Sahar Kaleem danken wir für die Bearbeitung des Manuskripts.

(1) Hana3A Zellen Kultur
<ol><li>Bereiten Sie M10 (Minimum wesentliches Medium (MEM) zuzüglich 10 % V/V fetalen bovine Serum (FBS)) und M10PSF (M10 plus 100 µg/mL Penicillin-Streptomycin und 1,25 µg/mL Amphotericin B).</li>
	<li>Kulturzellen Sie in 10 mL M10PSF in der Kulturschale 100 mm Zelle in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % Kohlendioxid (CO2) festgelegt.</li>
	<li>Alle 2 Tage bei einem Verhältnis von 20 % der Zellen zu teilen: Wenn 100 % Zusammenfluss von Zellen (ca. 1,1 x 107 Zellen) ...

Die Wahrnehmung der Geruch ist wesentlich abhängig von der Aktivierung der Regionen in äußerster Randlage. Infolgedessen ist Verständnis ihrer Funktionalität erforderlich, um die komplexen Mechanismen, mit denen das Gehirn seine flüchtige chemische Umgebung wahrnehmen zu knacken. Jedoch wurde das Verständnis dieses Prozesses durch die Schwierigkeiten bei der Einrichtung einer robusten Methode der OR-Repertoire für Funktionalität gegen Riechstoffe in-vitro-. auf dem Bildschirm behindert Zelle Oberfläche...

Der Geruchssinn ermöglicht terrestrischen Tieren interagieren mit ihren flüchtigen chemischen Umgebung Laufwerk Verhalten und Emotionen. Grundsätzlich beginnt die Geruch-Erkennung mit dem allerersten Zusammenspiel von Geruchsstoff Moleküle mit dem olfaktorischen System auf der Ebene der Geruchsstoff Rezeptoren (ORs)1. Bei Säugetieren sind individuell olfaktorischen sensorischen Neuronen (Korrelationsmöglichkeiten) befindet sich in der olfaktorischen Epithel2Regionen in äußerster Randlage zum Ausdruck gebracht. Sie gehören zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) Familie und genauer auf die Rhodopsin-ähnliche Unterfamilie (auch als Klasse A). Regionen in äußerster Randlage paar mit der stimulierende G Protein GOlf deren Aktivierung zu Lager Produktion, gefolgt von der Eröffnung der zyklische Nukleotid geschlossene Kanäle und die Erzeugung von Aktionspotentialen führt. Es wird angenommen, dass ein Geruch der Wahrnehmung stützt sich auf ein bestimmtes Muster von aktivierten ORs3,4 und deshalb Geruch Anerkennung folgt eine kombinatorische Codierschema, wo ein OR kann durch eine Reihe von Geruchsstoffen aktiviert werden und ein Geruchsstoff aktivieren kann ein Kombination von Regionen in äußerster Randlage. Und durch solche kombinatorische Codierung wird postuliert, daß Organismen erkennen und unterscheiden können zwischen einer Vielzahl von flüchtigen Geruchsmoleküle. Ist einer der Schlüssel zum Verständnis, wie Gerüche wahrgenommen werden, zu verstehen wie und die Regionen in äußerster Randlage sind durch einen bestimmten Geruch aktiviert.
In einem Versuch, Geruchsstoff aufzuklären- oder Wechselwirkungen, in-vitro-funktionelle Untersuchungen eine wesentliche Rolle gespielt haben. Die Identifizierung der Agonist duftende Liganden für Waise ORs (OR de Orphanization) ist seit den letzten zwanzig Jahren durch den Einsatz von verschiedenen in-vitro-, ex-Vivo- und in-vivo funktionelle Assays5,6,7 ein sehr aktives Feld ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.
In-vitro-Test-Systeme eignen sich am besten für die detaillierte funktionelle Charakterisierung der Regionen in äußerster Randlage, einschließlich Ermittlung der Funktionsbereiche und kritische Rückstände von Regionen in äußerster Randlage sowie mögliche technische Anwendungen. Jedoch hat weitere wertvolle in-vitro-Systeme für Regionen in äußerster Randlage eine Herausforderung, im Teil wegen Schwierigkeiten mit der Kultivierung Korrelationsmöglichkeiten und funktionelle Expression von ORs in heterologen Zellen entwickelt. Die erste Herausforderung gewesen, Protokolle zu etablieren, die für die Zelle Oberflächenexpression von funktionalen ORs in der Zuordnung der Geruchsstoff erlaubt-OR-Interaktionen. Eine Reihe von unabhängigen Gruppen haben verschiedene Ansätze5,6,7,8,9,10,11,12genutzt, 14,18,19,20. Eine der frühesten Errungenschaften wurde von Krautwurst Et Al. in der N-Terminus von Regionen in äußerster Randlage mit einem verkürzten Abfolge von Rhodopsin (Rho-Tag) markiert und eine verbesserte Oberflächenexpression in menschlichen embryonalen Niere (HEK) Zellen13beobachtet. Variationen gemacht, um den Tag angebracht, die OR-Sequenz ist immer noch ein Weg zur Verbesserung der OR Ausdruck und Funktionalität19,21erkundet. Saito Et Al. dann Rezeptor-der Transport von Protein 1 (RTP1) identifiziert und RTP2 die OR Handel erleichtern. 22 eine kürzere Version des RTP1, genannt RTP1S, hat auch gezeigt, sogar wirksamer als die ursprüngliche Protein23sein. Die Entwicklung einer Zelllinie (Hana3A), stabil GOlfausdrückt, REEP1, RTP1 und RTP2 24, gepaart mit dem Einsatz der zyklischen Adenosin Monophosphate (cAMP) Reporter ermöglichte Identifizierung der Duftstoff-OR-Interaktionen. Der Mechanismus, durch die die RTP-Familie von Proteinen fördert die Zelle Oberflächenexpression von Regionen in äußerster Randlage bleibt bestimmt werden.
Ein Nachteil dieser etablierten Methoden ist, dass sie verlassen sich auf Geruchsstoff Stimulation in der flüssigen Phase, d.h. Geruchsstoffe werden vorab in einer Stimulation Medium aufgelöst und stimulieren Zellen durch das Medium zu ersetzen. Dies unterscheidet sich sehr von den physiologischen Bedingungen wo Geruchsstoff Moleküle erreichen das Riechepithel in der Dampfphase und ORs durch Auflösung in der Nasenschleimhaut zu aktivieren. Um mehr physiologisch relevanten Reiz Belichtung ähneln, schlug Sanz Et Al.20 einen Assay basierend auf Dampf Stimulation durch die Anwendung eines Tropfen Duftstoff Lösung hängen unter der Innenfläche aus einer Kunststofffolie auf Zelle Brunnen gelegt. Sie nahmen die Kalzium-Reaktionen durch die Überwachung der Fluoreszenzintensität. Diese Methode war die erste Luft-Phase Geruchsstoff Stimulation verwenden, aber es war es nicht möglich eine große Vorführung der OR-Aktivierung.
Hier entwickelten wir eine neue Methode, die es ermöglicht Echtzeit-Überwachung von in-vitro-OR-Aktivierung über Dampf Phase Geruchsstoff Stimulation durch die Glosensor-Assay (Abbildung 1). Dieser Test hat früher im Zusammenhang mit der flüssigen Duftstoff Stimulation18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. Überwachung Handelskammer die Luminometer ist zunächst equilibriert mit verdampftem Geruchsstoff vor der Platte lesen (Abb. 1A). Duftstoff-Moleküle sind dann solvatisierte in den Puffer, Baden Hana3A Zellen mit dem Ausdruck oder der Zinsen, RTP1S und die Glosensor Proteine (Abbildung 1B). Wenn der Geruchsstoff ein Agonist des OPS ist, wird OP wechseln Sie zu einer aktivierten Konformation GOlf, Aktivierung der Adenylyl-Cyclase (AC) zu binden und letztlich dazu führen, dass cAMP Stufen zu steigen. Diese steigende Campingplätze zu binden und aktivieren das Glosensor Protein um Lumineszenz katalysieren Luciferin zu generieren. Diese Lumineszenz wird dann durch die Luminometer aufgezeichnet und OR Aktivierung Überwachung ermöglicht. Diese Methode ist von großem Interesse im Rahmen der OR Deorphanization, da es die natürliche Wahrnehmung von Gerüchen in-vitro-Systeme näher bringt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:867px;" width="866">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">0.05 % trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:93px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td style="width:449px;">0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm cell culture dish&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm x 20 mm cell culture dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 mL tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352099</td>
			<td style="width:449px;">17 mm x 120 mm conical tubes</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">96-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3843</td>
			<td style="width:449px;">96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Amphotericin</td>
			<td style="width:93px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15290-018</td>
			<td style="width:449px;">Amphotericin B 250 &#181;g/mL - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuge machine</td>
			<td>Jouan</td>
			<td>C312</td>
			<td style="width:449px;">Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Class II Type A/B3 fumehood</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU-407-500</td>
			<td style="width:449px;">fumehood for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">FBS</td>
			<td style="width:93px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000-044</td>
			<td style="width:449px;">Fetal Bovine Serum - store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">GloSensor cAMP Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E1290</td>
			<td style="width:449px;">GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Incubator 37 &#176;C; 5 % CO2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-604</td>
			<td style="width:449px;">Incubator for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td style="width:449px;">Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luminometer POLARstar OPTIMA</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>discontinued</td>
			<td style="width:449px;">96 well plate reader for luminescence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:205px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410</td>
			<td style="width:449px;">Solvent for odorants - store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:205px;">Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td style="width:449px;">Minimum Essential Medium Eagle with Earle&#8217;s salts &#38; L-glutamine - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:205px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:449px;">Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:205px;">pGlosensor</td>
			<td style="width:93px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2301</td>
			<td style="width:449px;">pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">phase contrast microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>090-131.001</td>
			<td style="width:449px;">phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:205px;">RTP1S</td>
			<td style="width:93px;">H. Matsunami lab</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:449px;">100 ng/&#181;L plasmid - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time in vitro monitoring of odorant receptor activation by an odorant in the vapor phase

Olfaktorischen Wahrnehmung beginnt mit dem Zusammenspiel von Riechstoffen mit Duftstoff-Rezeptoren (oder) durch olfaktorischen sensorischen Neuronen (OSN) ausgedrückt. Geruch-Anerkennung folgt eine kombinatorische Codierschema, wo ein OR kann durch eine Reihe von Geruchsstoffen aktiviert werden und ein Geruchsstoff kann eine Kombination von Regionen in äußerster Randlage zu aktivieren. Organismen können durch solche kombinatorische Codierung erkennen und unterscheiden können zwischen einer Vielzahl von flüchtigen Geruchsmoleküle. So kann ein Geruch in einer bestimmten Konzentration beschrieben werden durch ein Aktivierungsmuster von Regionen in äußerster Randlage, die ist spezifisch für jeden Geruch. In diesem Sinne knacken die Mechanismen, die das Gehirn benutzt, um Geruch erfordert Verständnis Geruchsstoff wahrnehmen-OR-Interaktionen. Deshalb die Geruchssinn Gemeinschaft verpflichtet "diese Rezeptoren de-orphanize" ist. Konventionellen in-vitro-Systeme zur Identifizierung von Duftstoff- oder Wechselwirkungen verwendet haben Inkubation Zelle Medien mit Duftstoff, die unterscheidet sich von der natürlichen Erkennung von Gerüchen über Dampf Geruchsstoffe Auflösung in Nasenschleimhaut vor Interaktion mit ORs. Hier beschreiben wir eine neue Methode, die ermöglicht die Echtzeitüberwachung der OR-Aktivierung per Dampfphase Geruchsstoffe. Unsere Methode basiert auf Messung cAMP Freigabe durch Lumineszenz unter Verwendung der Glosensor-Assay. Es überbrückt Lücken zwischen in vivo und in-vitro-Ansätzen und bildet die Grundlage für eine biomimetische flüchtiger chemischer Sensor.

Wir sehen die Reaktion der drei Maus ORs, Olfr746, Olfr124 und Olfr1093 mit Zimtaldehyd Dampf Stimulation (Abbildung 3). Gleichzeitig verwendet wir eine leere Vektorregelung (Rho-pCI) um sicherzustellen, dass die Duftstoff-induzierten Aktivitäten der getesteten Regionen in äußerster Randlage bestimmte waren(Abbildung 3). Die Echtzeit-Aktivierung der Regionen in äußerster Randlage auf Dampf Geruchsstoff Reiz war überwachten über 20 Messzyk...

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Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Physiologisch werden durch Geruchsstoff Moleküle in der Dampfphase eingeatmet Geruchsstoff Rezeptoren aktiviert. Jedoch verwenden die meisten in-vitro-Systeme Flüssigphase Geruchsstoff Stimulation. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die erlaubt, in-vitro-Echtzeitüberwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung bei Geruchsstoff Stimulation in der Dampfphase.

In-vitro-Überwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung durch einen Geruchsstoff in der Dampfphase in Echtzeit

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

Unser Protokoll ermöglicht die Messung und Diskriminierung flüchtiger Gerüche mit einem Panel von Geruchsrezeptoren. Diese Methode eröffnet die Möglichkeit, geruchsrezeptorbasierte Biosensoren zu entwickeln. Diese Technik ermöglicht eine Echtzeit-In-vitro-Überwachung der Geruchsrezeptoraktivierung auf Geruchsmoleküle in der Dampfphase.Es füllt die Lücke zwischen In-vitro- und In-vivo-Ansätzen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Kinetik von Ereignissen zu verstehen, die zur Geruchswahrnehmung führen, einschließlich der Rolle von schleimhautmetabolischen Enzymen. Um zu beginnen, bereiten M10 und M10 PSF nach dem Manuskript.Die Zellen werden in 10 Milliliterm M10 PSF bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid kultiviert. Beobachten Sie die Kulturschale unter einem Phasenkontrastmikroskop. Wenn es 100% Zusammenfluss erreicht, teilen Sie die Zellen auf eine niedrigere Konzentration, indem Sie die Medien ansipirieren und die Zellen sanft mit 10 MilliliterPBS waschen.Dann die PBS aspirieren und drei Milliliter Trypsin-EDTA hinzufügen. Lassen Sie es für etwa eine Minute reagieren, bis die Zellen von der Schale trennen. Fügen Sie fünf Milliliter M10 hinzu, um das Trypsin zu deaktivieren, und Pipette nach oben und unten, um die an der Schale befestigten Zellen zu lösen.Übertragen Sie die acht Milliliter Zellsuspension von der Schale in ein 15-Milliliter-Rohr, und zentrifugieren Sie das Rohr bei 200-mal-G für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in fünf Milliliterm M10 PSF wieder ab, indem Sie nach oben und unten pfeifen, um jede Zellmasse aufzubrechen. Vermeiden Sie blasen in der Röhre zu erstellen.Um 20 % Deseinfluss von Zellen zu erhalten, fügen Sie neun Milliliter M10 PSF in eine neue 1.000-Millimeter-Zellkulturschale ein und übertragen Sie einen Milliliter der resuspendierten Zelllösung. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Dieses Gericht, das an 20% Zusammenfluss sitzt, wird 100% Zusammenfluss in 48 Stunden erreichen.Legen Sie die Schale unter ein Phasenkontrastmikroskop, um es zu beobachten. Nehmen Sie 1/10 der 100%zelligen Konfluenzkulturschale. Saugen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen sanft mit 10 Milliliter PBS.Behandeln Sie dann die Zellen mit Trypsin-EDTA und M10, Zentrifuge, und behandeln Sie wieder mit M10 PSF wie zuvor durchgeführt. Um eine 96-Well-Platte zu realisieren, fügen Sie 500 Mikroliter aus den fünf Millilitern resuspendierter Zellen auf 5,5 Milliliter frischem M10 PSF. Mischen Sie die Zellen und M10 PSF, ohne Luftblasen zu erzeugen.Pipette 50 Mikroliter der verdünnten suspendierten Zellen in jeden Brunnen der 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette. Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Stellen Sie zunächst die 96-Well-Platte, die über Nacht kultiviert wurde, unter ein Phasenkontrastmikroskop, beobachten Sie den Zellzusammenfluss und stellen Sie sicher, dass sie zwischen 30% und 50% liegt. Bereiten Sie einen ersten Transfektionsmix in einem 1,5-Milliliter-Rohr vor, das die Plasmide enthält, die der gesamten Platte entsprechend dem Manuskript gemeinsam sind.Rho-pCi ist eine leere Vektor-Negativkontrolle, und Olfr1377 ist eine positive Kontrolle bekannt, um auf das getestete Geruchsacetophenon reagieren. Teilen Sie die Mischung in zwei Transfektionsmischungen auf, die eines der Kontrollplasmide enthalten. Bereiten Sie eine zweite Transfektionsmischung mit 500 Mikroliter MEM und 20 Mikroliter Liptectamin 2000 Reagenz vor.Fügen Sie die Hälfte der zweiten Mischung zu jedem Reservoir gut und sanft mischen, indem Sie nach oben und unten. Inkubieren Sie das Rohr für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie fünf Milliliter M10 für eine 96-Well-Platte hinzu.2,5 Milliliter in jeden Behälter geben und sanft mischen. Ersetzen Sie den M10 PSF in der zuvor beschichteten 96-Well-Platte durch 50 Mikroliter der endletzten Transfektionsmedien. Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren.Öffnen Sie dann die Tür des Luminometers und legen Sie das mit der Vakuumpumpe verbundene Rohr ein. Vakuumieren Sie die Kammer des Luminometers über Nacht. Beobachten Sie nach der Transfektion die 96-Well-Platte unter einem Phasenkontrastmikroskop, um einen Zellzusammenfluss zwischen 60% und 100% zu gewährleisten. Bereiten Sie die Stimulationslösung von Hanks Balanced Salt Solution vor, die 10-Millimolar von HEPES und 5-Millimolar D-Glucose enthält.Entfernen Sie das Transfektionsmedium von der 96-Well-Platte und waschen Sie die Zellen, indem Sie jedem Brunnen 50 Mikroliter frische Stimulationslösung hinzufügen. Um die GloSensor cAMP Reagenzlösung zu verdünnen, pipette 2,75 Milliliter der Stimulationslösung in ein Fünf-Milliliter-Rohr und 75 Mikroliter der cAMP-Reagenzlösung hinzufügen. Entfernen Sie die Stimulationslösung aus den Brunnen und fügen Sie jedem Brunnen 25 Mikroliter verdünnte cAMP-Reagenzlösung hinzu.Die 96-Well-Platte bei Raumtemperatur in einer dunklen und geruchsfreien Umgebung zwei Stunden lang bebrüten. Zuerst das Geruchsacetophenon auf 1% in 10 Milliliter Mineralöl verdünnen und die Röhre kappen. Vor dem Ende der cAMP-Reagenz-Inkubationszeit 25 Mikroliter der Geruchslösung in eine neue 96-Well-Platte geben.Legen Sie dann diese Geruchsplatte für fünf Minuten in die Leuchtkraftkammer, um die Kammer mit flüchtigen Geruchsmolekülen auszustatten. Stellen Sie das Luminometer so ein, dass die Lumineszenz bei 20 Zyklen der 90-Sekunden-Plattenmessung mit 0,7 Sekunden Intervall zwischen den Zyklen mit null Sekunden Verzögerung aufzeichnet wird. Kurz vor dem Lesen der Platte, entfernen Sie die Geruchsplatte aus der Kammer.In der 96-Well-Platte, die die transfizierten Zellen enthält, fügen Sie 25 Mikroliter Geruchsmittel in den Raum zwischen den Brunnen, und legen Sie die Platte schnell wieder in die Kammer. Starten Sie die Lumineszenzmessung aller Brunnen für 20 Zyklen innerhalb von 30 Minuten. Entfernen Sie nach der Lumineszenzmessung das restliche Geruchsmittel im Luminometer, indem Sie Diebesstoffe in der Lesekammer mindestens zwei Stunden lang ausgiebig saugen.Ersetzen Sie dies durch frische Luft, indem Sie druckluftfür fünf Minuten Druckluft senden, bevor Sie das nächste Geruchsmittel inkubieren, um eine Kreuzkontamination von Geruchsflüchtigen zu vermeiden. Um mit der Datenanalyse zu beginnen, exportieren Sie die Daten aus der Luminometer-Software. Durchschnittlichdie Replikationen desselben ODER für jede Aufnahmezeit.Um die normalisierte ODER-Antwort auf ein beliebiges Steuerelement zu berechnen, dividieren Sie den leeren Vektor-Gemitteltenwert zu jeder Aufzeichnungszeit in den OR-gemittelten Wert. Normalisieren Sie jede ODER-Antwort auf ihre Basalaktivität, indem Sie die gemittelte ODER-Antwort auf null Sekunden auf jede Aufzeichnungszeitantwort dividieren. Um einen einzelnen OR-Antwortwert für die Kurve jedes ODER zu erhalten, summieren Sie alle Lumineszenzwerte jeder Aufnahmezeit für jeden ODER, um den Bereich unter der Kurve zu erhalten.In diesem Experiment wurde die Echtzeitaktivierung von Öst-O-Werten von Mäusen auf Dampfgeruchsreize über 20 Messzyklen überwacht. Eine leere Vektorsteuerung wurde verwendet, um sicherzustellen, dass die geruchsinduzierten Aktivitäten der getesteten ORs spezifisch waren. Die Daten für jeden Brunnen wurden zunächst auf den leeren Vektorsteuerungs-Durchschnittswert für jeden Zyklus normalisiert.Um dann verschiedene ORs-Antworten zu vergleichen, wurden die Daten in diesem Test auf die OR-Ebenen der Basalaktivität normalisiert. Die Einzelaktivierungswerte für jeden ODER wurden berechnet, indem die Fläche unter der Kurve für jeden ODER berechnet wurde, indem die Emissionswerte aller Messzyklen summiert wurden. Zusätzlich können dosisabhängige Reaktionen mit steigenden Geruchsdosen gemessen werden.Die Reaktion von Olfr1377 auf Acetophenonstimulation in fünf Konzentrationen wurde aufgezeichnet. Nur die drei höheren Konzentrationen konnten Olfr1377 aktivieren. Die reine zusammengesetzte Stimulation zeigt eine Tendenz, die OR-Reaktion im Laufe der Zeit zu verringern, wahrscheinlich aufgrund der Zelltoxizität.Während des Schritts sollten Sie das verdünnte Geruchsmittel zwischen dem Brunnen hinzufügen und bereit sein, schnell mit der Aufnahme der Platte zu beginnen. Die Zeit zwischen Geruchszugabe und Überwachung sollte minimiert und zwischen zwei Experimenten konstant bleiben. In Vorhöfen sind Zellen biogefährliches Material, so erinnern Sie daran, die Zellen in den entsprechenden Apotheken zu entsorgen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Odorant-induzierten Reaktionen aus olfaktorischen Rezeptor-Neuronen mit der Saugpipette Technik aufgenommen

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Forschung

Neurowissenschaften

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Ein Protokoll für die Verwaltung von Real-Time-fMRT Neurofeedback Training

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Leben-Zelle Messung der Geruchsstoff Rezeptor Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Lokalisierung von Odorant-Rezeptor-Genen in Locust-Antennen durch RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Okuläre Kinematik gemessen durch In-vitro- Stimulation der Hirnnerven in die Schildkröte

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...