Name: real-time in vitro monitoring of odorant receptor activation by an odorant in the vapor phase
Uploaded: 2019-04-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH (DC014423 ו- DC016224), את ההגנה מתקדם פרוייקט הסוכנות RealNose פרוייקט מחקר. YF נשאר באוניברסיטת דיוק עם תמיכה כספית מתוכנית JSPS לרשתות קידום אסטרטגי בינלאומי להאיץ את זרימת הדם של מוכשרים החוקרים (R2801). אנו מודים Kaleem סהר על עריכה של כתב היד.

1. Hana3A אנליזה טרמית
<ol><li>להכין M10 (מינימום הכרחי בינוני (מאמ) בתוספת 10% v/v עוברית שור סרום (FBS)), M10PSF (M10 פלוס 100 µg/mL פניצילין-סטרפטומיצין, שהוא גוסס 1.25 µg/mL B).</li>
	<li>התרבות התאים 10 מ"ל של M10PSF בצלחת תרבות תא 100 מ מ בתוך אינקובטור להגדיר ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני (CO2).</li>
	<li>חלוקת התאים כל י?...

התפיסה של ריח תלויה באופן מהותי ההפעלה של ORs. כתוצאה מכך, הבנה של הפונקציונליות שלהם נדרש כדי לפצח את המנגנון מורכבות המשתמשות המוח להבחין סביבתו כימיים נדיפים. עם זאת, ההבנה של תהליך זה יש כבר הקשו על ידי הקשיים בהקמת שיטה חזקה למסך את הרפרטואר או פונקציונליות נגד odorants במבחנה. תא והביט...

חוש הריח מאפשר קרקעית חיות לאינטראקציה עם הסביבה כימיים נדיפים שלך כונן התנהגויות ורגשות. ביסודו, מתחיל תהליך זיהוי ריח עם האינטראקציה הראשונה של מולקולות odorant עם מערכת הריח, ברמה של קולטנים (ORs) odorant1. ביונקים, ORs מבוטאים בנפרד חוש הריח נוירונים סנסוריים (OSNs) ממוקם אפיתל חוש הריח2. הם שייכים למשפחת קולטן (GPCR) G-חלבון בשילוב, ליתר דיוק למשפחת אופסין # רודופסין דמוי משנה (המכונה גם מחלקה A). ORs זוג עם מופחתים גרם חלבון Golf הפעלת אשר מוביל המחנה ייצור ואחריו פתיחת ערוצי נוקלאוטיד מחזורית מגודרת, הדור של פוטנציאל פעולה. מקובל כי ההכרתיות ריח מסתמך על דפוס מסוים של ORs מופעל3,4 , ולכן זיהוי ריח מלווה ערכת קידוד המשתמשת קומבינטורית, או אחד יכול להיות מופעל על ידי קבוצת odorants בהם odorant אחד יכול להפעיל שילוב של ORs. דרך כזו קידוד קומבינטורית, זה הוא שמהווה אורגניזמים יכולים לזהות ולהבחין בין מספר עצום של מולקולות ריח נדיפים. אחד המפתחות להבנת איך נתפסים ריחות היא להבין איך ואשר ORs מופעלים על ידי ריח נתון.
בניסיון להבהיר odorant- או אינטראקציות, מבחני פונקציונלי במבחנה שיחקו תפקיד חיוני. הזיהוי של אגוניסט ליגנדים מדיף עבור יתום ORs (או דה-orphanization) כבר שדה פעיל מאוד בעשרים השנים האחרונות, באמצעות שימוש שונים במבחנה, ex-vivo ומבחני פונקציונלי ויוו5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.
מערכות assay במבחנה הם המתאימים ביותר עבור אפיון פונקציונלי מפורט ORs, כולל זיהוי של תחומים פונקציונליים, ומשקעים קריטי של ORs, כמו גם יישומים הנדסיים פוטנציאליים. עם זאת, בהמשך פיתוח מערכות במבחנה יקר עבור ORs היה אתגר, בין היתר בשל קושי עם culturing OSNs וביטוי פונקציונלי של ORs בתאים heterologous. האתגר הראשון היה להקים פרוטוקולים מותרים עבור הביטוי פני שטח התא של ORs פונקציונלי מיפוי של odorant-ניתוח אינטראקציות. מספר קבוצות עצמאית נעזרו שונים גישות5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. אחד ההישגים המוקדמים נוצר על ידי Krautwurst et al. ב מתויג N-הסופית של ORs עם רצף מקוצרת של אופסין # רודופסין (Rho-תג) ולצפות ביטוי השטח משופרת ב- תאי כליה אנושית עובריים (HEK)13. וריאציות שבוצעו התג המוצמד הרצף או הוא עדיין נתיב חקר לשיפור או ביטוי ופונקציונליות19,21. סאיטו ואח. ואז זיהו חלבון קולטן-הובלת 1 (RTP1), RTP2 אשר להקל או סחר בסמים. 22 גרסה קצרה יותר של RTP1, שנקרא RTP1S, גם הוכח להיות יעיל יותר מאשר החלבון המקורי23. הפיתוח של קו תא (Hana3A) stably המבטאת Golf, REEP1, RTP1 ו- RTP2 24, בשילוב עם השימוש של אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה) כתבים איפשר זיהוי של odorant-ניתוח אינטראקציות. מנגנון לפיו משפחת RTP של חלבונים מקדמת הבעת פני שטח התא ORs עדיין נקבע.
אזהרה אחת משיטות אלה הוקמה היא כי הם מסתמכים על גירוי odorant בשלב נוזלי, כלומר odorants הם התפרקה מראש לתוך מדיום גירוי לעורר תאים על-ידי החלפת המדיום. . זה מאוד שונה מזו התנאים הפיזיולוגיים שבה מולקולות odorant להגיע האפיתל חוש הריח בשלב אדי, להפעיל ORs על-ידי פירוק לתוך רירית האף. כדי להידמות יותר חשיפה גירוי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, צאנז ואח20 המוצע של assay בהתבסס על אדי גירוי על-ידי החלת טיפת odorant פתרון לתלות מתחת הפנים הפנימי של סרט פלסטיק הניח על ראש תא בארות. הם הקליטו את התגובות סידן על-ידי ניטור קרינה פלואורסצנטית בעוצמה. שיטה זו היה הראשון להשתמש אוויר-שלב odorant גירוי, אבל זה לא התירו הקרנה גדולים או ההפעלה.
. הנה, פיתחנו שיטה חדשה המאפשרת ניטור בזמן אמת של הפעלת או במבחנה באמצעות אדי שלב odorant גירוי על ידי וזמינותו Glosensor (איור 1). Assay הזה שימש בעבר בהקשר של odorant נוזלי גירוי18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. התא ניטור של luminometer זה equilibrated קודם עם odorant מתאדה לפני הצלחת לקרוא (איור 1א'). Odorant מולקולות הן ואז solvated לתוך המאגר, רחצה Hana3A תאים המבטאים את הניתוח של עניין, RTP1S את החלבונים Glosensor (איור 1B). אם odorant הוא אגוניסט של הניתוח, הניתוח לעבור קונפורמציה מופעל לאגד Golf, מפעיל את cyclase adenylyl (AC) ו בסופו של דבר לגרום רמות המחנה לעלות. המחנה העולה לאגד ולהפעיל את החלבון Glosensor כדי ליצור הפריה חוץ גופית ותזרז luciferin. הארה זו לאחר מכן נרשם על-ידי luminometer ומאפשרת או הפעלת הפיקוח. שיטה זו היא עניין גבוהה בהקשר של deorphanization או כפי שהיא מביאה מערכות in vitro קרוב התפיסה הטבעית של ריחות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:867px;" width="866">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">0.05 % trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:93px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td style="width:449px;">0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm cell culture dish&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm x 20 mm cell culture dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 mL tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352099</td>
			<td style="width:449px;">17 mm x 120 mm conical tubes</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">96-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3843</td>
			<td style="width:449px;">96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Amphotericin</td>
			<td style="width:93px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15290-018</td>
			<td style="width:449px;">Amphotericin B 250 &#181;g/mL - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuge machine</td>
			<td>Jouan</td>
			<td>C312</td>
			<td style="width:449px;">Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Class II Type A/B3 fumehood</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU-407-500</td>
			<td style="width:449px;">fumehood for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">FBS</td>
			<td style="width:93px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000-044</td>
			<td style="width:449px;">Fetal Bovine Serum - store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">GloSensor cAMP Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E1290</td>
			<td style="width:449px;">GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Incubator 37 &#176;C; 5 % CO2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-604</td>
			<td style="width:449px;">Incubator for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td style="width:449px;">Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luminometer POLARstar OPTIMA</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>discontinued</td>
			<td style="width:449px;">96 well plate reader for luminescence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:205px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410</td>
			<td style="width:449px;">Solvent for odorants - store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:205px;">Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td style="width:449px;">Minimum Essential Medium Eagle with Earle&#8217;s salts &#38; L-glutamine - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:205px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:449px;">Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:205px;">pGlosensor</td>
			<td style="width:93px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2301</td>
			<td style="width:449px;">pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">phase contrast microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>090-131.001</td>
			<td style="width:449px;">phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:205px;">RTP1S</td>
			<td style="width:93px;">H. Matsunami lab</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:449px;">100 ng/&#181;L plasmid - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time in vitro monitoring of odorant receptor activation by an odorant in the vapor phase

תפיסת הריח מתחיל האינטראקציה של odorants עם רצפטורים odorant (או) בא לידי ביטוי על ידי חוש הריח החישה הניריונים (OSN). ריח זיהוי עוקב אחר ערכת קידוד המשתמשת קומבינטורית, או אחד יכול להיות מופעל על ידי קבוצת odorants בהם odorant אחד יכול להפעיל שילוב של ORs. דרך כזאת קידוד קומבינטורית, אורגניזמים יכולים לזהות ולהבחין בין מספר עצום של מולקולות ריח נדיפים. לפיכך, ריח-ריכוז נתון יכולה להיות מתוארת על ידי תבנית ההפעלה של ORs, אשר הוא ספציפי על כל ריח. במובן הזה, פיצוח המנגנונים המשתמשת המוח להבחין ריח דורש את ההבנה odorant-ניתוח אינטראקציות. זו הסיבה מדוע הקהילה חוש הריח מחויבת "דה orphanize" רצפטורים אלו. קונבנציונאלי מערכות in vitro המשמש לזיהוי odorant- או אינטראקציות נעזרו ומוכנסות המדיה הנייד עם odorant, אשר היא נבדלת הגילוי הטבעי של ריחות באמצעות פירוק odorants אדי לתוך רירית האף לפני בחברת ORs. כאן, אנו מתארים שיטה חדשה מאפשר ניטור בזמן אמת של הפעלת או באמצעות אדים-שלב odorants. השיטה שלנו מתבססת על מדידת שחרור המחנה על ידי הפריה חוץ גופית באמצעות וזמינותו Glosensor. זה גשרים הנוכחי פערים בין גישות ויוו במבחנה ומספק בסיס חיישן כימיים נדיפים ביונים.

הוקרנו התגובה של שלושה העכבר ORs, Olfr746, Olfr124, Olfr1093 באמצעות גירוי אדי cinnamaldehyde (איור 3). במקביל, השתמשנו פקד וקטור ריק (Rho-pCI) כדי להבטיח כי פעילות odorant-induced ORs שנבדקו היו ספציפיות (איור 3א). הפעלת בזמן אמת ORs על גירוי odorant אדי היה בפיקוח מדידה מעל 20 מחזורים. הנתו...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase at JoVE.com

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

מבחינה פיזיולוגית, odorant רצפטורים מופעלים על ידי מולקולות odorant בשאיפה בשלב אדי. עם זאת, ביותר מערכות in vitro לנצל שלב נוזלי odorant גירוי. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת ניטור בזמן אמת במבחנה של הפעלת קולטן odorant על odorant גירוי בשלב אדי.

בזמן אמת בחוץ גופית ניטור של הפעלת קולטן Odorant מאת Odorant בהשלב אדי

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר למדוד גילוי ואפליה של ריחות נדיפים עם פאנל של קולטני ריח. שיטה זו פותחת את האפשרות לפתח biosensors מבוססי קולטן ריח. טכניקה זו מאפשרת ניטור במבחנה בזמן אמת של הפעלת קולטן ריח על מולקולות ריח בשלב האדים.זה ממלא את הפער בין במבחנה ו בגישות vivo. שיטה זו יכולה לשמש כדי להבין את הקינטיקה של אירועים שמובילים לתפיסת ריח, כולל התפקיד של אנזימים מטבוליים ריר. כדי להתחיל, להכין M10 ו M10 PSF על פי כתב היד.תאים מתורבתים ב 10 מיליליטר של M10 PSF ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. שימו לב לצלחת התרבות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. כאשר הוא מגיע 100%confluence, לפצל את התאים לריכוז נמוך יותר על ידי שאפת התקשורת לשטוף את התאים בעדינות עם 10 מיליליטר של PBS.לאחר מכן שאפו את ה-PBS והוסיפו שלושה מיליליטר של טריפסין-אדטה. תן לו להגיב במשך כדקה עד התאים להתנתק מן המנה. הוסף חמישה מיליליטר של M10 כדי להשבית את טריפסין, ואת פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים המחוברים לצלחת.מעבירים את שמונת המיליליטרים של השעיית התא מהצלחת לצינור של 15 מיליליטר, ומעבירים את הצינור ב-200 פעמים למשך חמש דקות. שאפו את העל-טבעי והתינו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של M10 PSF על-ידי צינור למעלה ולמטה כדי לשבור כל מסת תא. הימנע מיצירת בועות בצינור.כדי להשיג 20%confluence של תאים, להוסיף תשעה מיליליטר של M10 PSF בצלחת חדשה 1, 000 מילימטר תאים, ולהעביר מיליליטר אחד של פתרון התא המתווסף מחדש. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. מנה זו, היושבת על 20%, תגיע ל-100% התכנסות ב-48 שעות.מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה להתבונן. קח 1/10 מתוך 100% צלחת תרבות קונפלונס תא. שאפו את התקשורת ושטפו את התאים בעדינות עם 10 מיליליטר של PBS.לאחר מכן לטפל בתאים עם טריפסין-EDTA ו M10, צנטריפוגה, ולטפל שוב עם M10 PSF כפי שבוצע בעבר. כדי לממש צלחת אחת 96 באר, להוסיף 500 microliters מחמשת מיליליטר של תאים resuspended ל 5.5 מיליליטר של PSF M10 טרי.פיפטה 50 מיקרוליטרים של התאים המושעים המדוללים לתוך כל באר של צלחת 96 באר באמצעות פיפטה רב ערוצית. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. ראשית, מניחים את הצלחת 96 היטב מתורבת בן לילה תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה, להתבונן קונפלונס התא, ולוודא שזה בין 30% ו 50% להכין תערובת transfection הראשון בצינור 1.5 מיליליטר המכיל את הפלסמידים המשותפים הצלחת כולה על פי כתב היד.Rho-pCi היא שליטה שלילית וקטורית ריקה, ו Olfr1377 היא שליטה חיובית ידוע להגיב אצטופנון ריח נבדק. מפצלים את התערובת לשתי תערובות טרנס-דביקות המכילות את אחת פלסמידי הבקרה. הכן תערובת transfection שנייה המכילה 500 microliters של MEM ו 20 microliters של ליפופקטמין 2000 reagent.מוסיפים חצי מהתערובת השנייה היטב לכל מאגר ומערבבים בעדינות על ידי צינור למעלה ולמטה. דגירה הצינור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף חמישה מיליליטר של M10 עבור צלחת אחת 96 היטב.מוסיפים 2.5 מיליליטר לתוך כל מאגר היטב ומערבבים בעדינות. החלף את ה- PSF M10 בצלחת 96 באר מצופה בעבר עם 50 מיקרוליטרים של המדיה האחרונה transfection. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.לאחר מכן פתח את הדלת של מד הזוהר והכנס את הצינור המחובר למשאבת הוואקום. שאבו את התא של הלומינומטר בן לילה. לאחר ההמרה, יש להתבונן בצלחת ה-96 בארות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להבטיח התכנסות תאים בין 60% ל-100% הכן את פתרון הגירוי של תספורת המלח המאוזנת של האנק המכילה 10 מ"ל של HEPES וחמישה מילימטרים של D-glucose.הסר את מדיום ההמרה מהצלחת 96 באר ולשטוף את התאים על ידי הוספת 50 microliters של פתרון גירוי טרי לכל באר. כדי לדלל את פתרון הריג'נט של GloSensor, פיפטה 2.75 מיליליטר של פתרון הגירוי לצינור של חמישה מיליליטר ולהוסיף 75 מיקרוליטרים של פתרון הריג'נט של CAMP. הסר את פתרון הגירוי מה בארות, ולהוסיף 25 microliters של פתרון reagent cAMP מדולל לכל באר.הדגירה את צלחת 96 באר בטמפרטורת החדר בסביבה חשוכה ונונטת ריח במשך שעתיים. ראשית, לדלל את ריח אצטופנון ל 1%ב 10 מיליליטר של שמן מינרלי לכסות את הצינור. לפני תום זמן הדגירה של הדגירה של הדגירה, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תותבת הריח לכל באר בצלחת חדשה של 96 בארות.לאחר מכן מניחים את צלחת הריח בתא הזוהר במשך חמש דקות כדי לצייד את התא במולקולות ריח נדיפות. הגדר את מד הזוהר כדי לתעד את הזוהר עם אפס שניות של השהיה במהלך 20 מחזורים של מדידת צלחת 90 שניות, עם 0.7 שניות של מרווח בין מחזורים. ממש לפני קריאת הצלחת, מוציאים את לוחית הריח מהתא.בצלחת 96 באר המכיל את התאים מנודים, להוסיף 25 microliters של ריח בחלל בין בארות, במהירות לשים את הצלחת בחזרה לתוך התא. התחל את מדידת luminescence של כל הבארים במשך 20 מחזורים בתוך 30 דקות. לאחר מדידת הזוהר, הסר את הריח הנותר בתוך מד התאור על ידי שאיבת ריחות בתא הקריאה בהרחבה במשך שעתיים לפחות.החלף באוויר צח על ידי שליחת אוויר דחוס במשך חמש דקות לפני הדגירה של הריח הבא, כדי למנוע זיהום צולב של נדיפות ריח. כדי להתחיל בניתוח נתונים, יצא את הנתונים מתווית הלומינומטר. ממוצע השכפולים של אותו OR עבור כל זמן הקלטה.כדי לחשב את תגובת OR מנורמלת לכל פקד בסופו של דבר, חלק את הערך הווקטורי הריק לערך הממוצע OR בכל זמן הקלטה. לנרמל כל תגובת OR לפעילות הבסיסית שלהם על-ידי חלוקת תגובת OR הממוצעת באפס שניות לכל תגובת זמן הקלטה. כדי להשיג ערך תגובה יחיד של OR עבור העקומה של כל OR, סכם את כל ערכי ה- luminescence של כל זמן הקלטה עבור כל OR כדי להשיג את האזור מתחת לעקומה.בניסוי זה, ההפעלה בזמן אמת של עכברים ORs על גירוי ריח אדים היה במעקב מעל 20 מחזורי מדידה. פקד וקטור ריק שימש כדי להבטיח כי הפעילויות הנגרמות על ידי ריח של ORs נבדק היו ספציפיים. הנתונים עבור כל באר מנורמלים תחילה לערך הווקטורי הריק הממוצע עבור כל מחזור.לאחר מכן, כדי להשוות תגובות שונות של ORs, הנתונים היו מנורמלים לרמות OR של פעילות בסיס בראיה זו. ערכי הפעלה יחידה עבור כל OR חושבו על-ידי חישוב האזור מתחת לעקומה עבור כל OR על-ידי סיכום ערכי הפליטה של כל מחזורי המדידה. בנוסף, תגובות תלויות מינון ניתן למדוד באמצעות הגדלת מינוני ריח.התגובה של Olfr1377 לגירוי אצטופנון בחמישה ריכוזים נרשמה. רק שלושת הריכוזים הגבוהים יותר הצליחו להפעיל את Olfr1377. הגירוי המורכב הטהור מראה נטייה להקטין את תגובת OR לאורך זמן, ככל הנראה עקב רעילות התא.במהלך השלב, אתה צריך להוסיף את הריח מדולל בין הבאר, להיות מוכן להתחיל במהירות את ההקלטה של הצלחת. יש למזער את הזמן בין תוספת ריח לניטור וקבוע בין שני ניסויים. בתאי אטריה הם חומר biohazardous, אז להזכיר להיפטר התאים בבית המרקחת המתאימים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

פרוטוקול עבור fMRI ניהול בזמן אמת Neurofeedback אימונים

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

לוקליזציה של גנים קולטן Odorant ב אנטנות ארבה על ידי RNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

קינמטיקה עינית נמדדת במבחנה גירוי עצבי של הצב

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...