Name: excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals at JoVE.com

يود المؤلفون أن يعترفوا بالدعم من NSF 1725937، وNIH P01HL066299، وNIH R01HL058506، وNIH S10OD020149، وNIH UL1 TR001417، وNIH R01HL137030، AHA 18PRE34060163، وصندوق أبراهام ميتشل لبحوث السرطان.

1. جهاز الإعداد
<ol><li>مصدر الضوء: حدد مصدر ضوء طيفي واسع النطاق مع خرج طاقة عالية وترتيب عالي (تم استخدام مصباح قوس يُستخدم بقوة 300 واط في هذه الدراسات).</li>
	<li>الغالق (اختياري): أضف غالقًا إلى المسار البصري لتقليل ابيضاض الصور للتصوير بالفاصل الزمني.</li>
	<li>نظام فلتر قابل للضبط: تضمين تجميع ضبط م...

يبدأ الاستخدام الأمثل لإعداد التصوير فوق الطيفي المسح يُظهر ببناء مسار الضوء. وعلى وجه الخصوص، فإن اختيار مصدر الضوء، والمرشحات (القابلة للضبط وثنائية الديكروويك)، وطريقة تبديل الفلاتر، والكاميرا تحدد النطاق الطيفي المتاح، وسرعة المسح المحتملة، وحساسية الكاشف، وأخذ العينات المكانية. ت...

يمكن إجراء التصوير الطيفي بطرق مختلفة ويشار إليه بعدةمصطلحات1و2و3و4. وبوجه عام، يشير التصوير الطيفي إلى البيانات التي تم الحصول عليها في بعدين مكانيتين على الأقل وبعد طيفي واحد. يتميز التصوير المتعدد الأطياف وفرط الطيفية في أغلب الأحيان بعدد نطاقات الطول الموجي أو ما إذا كانت النطاقات الطيفية متجاورة1. وبالنسبة لهذا التطبيق، تُعرَّف البيانات فوق الطيفية بأنها البيانات الطيفية المكتسبة بنطاقات الطول الموجي المتجاورة التي تتحقق عن طريق المباعدة بين الأطوال الموجية المركزية بما لا يقل عن نصف العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) لكل مرشح تمرير شريطي يستخدم للإثارة (أي 5 نانومتر تباعد الطول الموجي مركز لمرشحات النطاق مع 14-20 نانومتر عرض النطاق). وتسمح الطبيعة المتجاورة لنطاقات البيانات بالإفراط في أخذ مجموعة البيانات، مما يكفل استيفاء معايير Nyquist عند أخذ عينات من المجال الطيفي.
وقد تم تطوير التصوير فوق الطيفي من قبل ناسا في 1970s و 1980s جنبا إلى جنب مع أول ساتل لاندسات5,6. وقد أتاح جمع البيانات من عدة نطاقات طيفية متجاورة توليد طيف إشراقة لكل بكسل. إن تحديد وتحديد طيف الإشراقة للمكونات الفردية جعل من الممكن ليس فقط الكشف عن المواد السطحية بواسطة أطيافها المميزة، بل سمح أيضاً بإزالة الإشارات المتداخلة، مثل الاختلافات في الإشارة بسبب الظروف الجوية. وقد طُبق مفهوم الكشف عن المواد باستخدام أطيافها المميزة على النظم البيولوجية في عام 1996 عندما استخدم شروك وآخرون مجموعات من خمسة فلوروفورات مختلفة وأطيافها المعروفة للتمييز بين الكروموسومات المسماة في عملية تسمى [كرّوبي] طيفيّة [كرّووبي]7. وقد تم تفصيل هذه التقنية في عام 2000 من قبل Tsurui وآخرون لتصوير الفلورة من عينات الأنسجة، وذلك باستخدام سبعة أصباغ فلورية وتحلل قيمة فريدة لتحقيق الفصل الطيفي لكل بكسل في تركيبات خطية من الأطياف في المرجع مكتبة8. وعلى غرار نظيراتها في مجال الاستشعار عن بعد، يمكن حساب مساهمة كل فلوروفور معروف من الصورة الفائقة الطيفية، مع إعطاء معلومات مسبقة عن طيف كل فلوروفور.
كما تم استخدام التصوير الطيفي الفائق في مجالات الزراعة9، علم الفلك10، الطب الحيوي11، التصوير الكيميائي12، التطبيقات البيئية13، العناية بالعين14، علوم الأغذية15، علم الطب الشرعي16،17، العلوم الطبية18، علم المعادن19، والمراقبة20. ومن القيود الرئيسية لأنظمة التصوير فوق الطيفي المجهر الفلوري الحالي أن تقنية التصوير الطيفي الفائق الطيفي القياسية تعزل إشارات الفلورة في نطاقات ضيقة بنسبة 1) أولاً تصفية ضوء الإثارة للتحكم في الإثارة العينة، ثم 2) مزيد من تصفية الضوء المنبعث لفصل انبعاث الفلورة إلى نطاقات ضيقة التي يمكن فصلها في وقت لاحق رياضيا21. يؤدي تصفية كل من إضاءة الإثارة والفلورة المنبعثة إلى تقليل مقدار الإشارة المتاحة، مما يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء ويتطلب فترات اكتساب طويلة. وتحد الإشارة المنخفضة وفترات الاكتساب الطويلة من إمكانية تطبيق التصوير فوق الطيفي كأداة تشخيصية.
وقد تم تطوير طريقة التصوير التي تستخدم التصوير فوق الطيفي ولكن يعزز الإشارة المتاحة، مما يقلل من وقت الاقتناء اللازم21،22. وتكتسب هذه الطريقة الجديدة، التي تسمى التصوير الطيفي الفائق المسح للإثارة، بيانات الصورة الطيفية عن طريق تغيير طول موجة الإثارة وجمع مجموعة واسعة من الضوء المنبعث. وقد تبين من قبل أن هذه التقنية تسفر عن أوامر من الزيادات في حجم نسبة الإشارة إلى الضوضاء بالمقارنة مع تقنيات مسح الانبعاثات21،22. وتعزى الزيادة في نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى حد كبير إلى النطاق الواسع (~ 600 نانومتر) من ضوء الانبعاثات المكتشف، في حين يتم توفير الخصوصية عن طريق تصفية ضوء الإثارة فقط بدلاً من انبعاث الفلورة. وهذا يسمح لجميع الضوء المنبعث (لكل موجة الإثارة) للوصول إلى كاشف21. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية للتمييز الفلورة الذاتية من التسميات الخارجية. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على تقليل وقت الاكتساب بسبب زيادة الإشارة القابلة للكشف تقلل من خطر ابيضاض الصور، كما تسمح بإجراء عمليات مسح طيفي بمعدل اكتساب مقبول للتصوير الطيفي بالفيديو.
والهدف من هذا البروتوكول هو أن يكون بمثابة دليل لاقتناء البيانات من أجل التصوير المجهري للتصوير فوق الطيفي المسحي. بالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين الأوصاف التي تساعد على فهم مسار الضوء والأجهزة. كما يرد وصف لتنفيذ برمجيات مفتوحة المصدر للمجهر التصويري الفائق الطيفي المسحي. وأخيراً، يتم توفير أوصاف لكيفية معايرة النظام إلى معيار NIST يمكن تتبعها، وضبط إعدادات البرامج والأجهزة للحصول على نتائج دقيقة، وفك خلط الإشارة المكتشفة في مساهمات من مكونات فردية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2119px;" width="2120">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Airway Smooth Muscle Cells</td>
			<td style="width:327px;">National Disease Research Interchange (NDRI)</td>
			<td style="width:360px;">Isolated from human lung tissues obtained from NDRI</td>
			<td style="width:1105px;">Highly autofluorescent, calcium sensitive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Shutter</td>
			<td style="width:327px;">Thorlabs Inc.</td>
			<td style="width:360px;">SHB1</td>
			<td>Remote-controllable shutter to minimize photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">H177P1T4</td>
			<td>Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage Controller (XY)</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Proscan III (H31XYZE-US)</td>
			<td>For interfacing automated stage with computer and joystick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Buffer</td>
			<td style="width:327px;">Made in-house</td>
			<td style="width:360px;">Made in-house</td>
			<td>145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Cell Chamber</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Attofluor Cell Chamber, A7816</td>
			<td>Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Excitation Filters</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-378/16</td>
			<td>Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-402/16</td>
			<td>Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-449/15</td>
			<td>Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-501/15</td>
			<td>Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-561/14</td>
			<td>Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF495-Di03</td>
			<td>Separates excitation and emission light at 495 nm (&#62;98% reflection between 350-488 nm, &#62;93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Longpass Filter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF01 496/LP-25</td>
			<td>Allows passage of light longer than 496 nm ( &#62;93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GCaMP Probe</td>
			<td style="width:327px;">Addgene</td>
			<td style="width:360px;">G-CaMP3; Plasmid #22692</td>
			<td>A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Integrating Sphere</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">FOIS-1</td>
			<td>Used for accurate measurement of wide-angle illumination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">TE2000</td>
			<td>Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Mitotracker Green FM</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">M7514</td>
			<td>Labels mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Calibration Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">LS-1-CAL-INT</td>
			<td>A lamp with a known spectrum for use as a standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Fluorescein</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">F36915</td>
			<td>For verifying appropriate spectral response of the system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NucBlue</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">R37605</td>
			<td>Labels cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (10X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 10X/0.45 &#8734;/0.17 MRD00105</td>
			<td>Useful for large fields of view</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (20X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 20X/0.75 &#8734;/0.17 MRD00205</td>
			<td>Most often used for tissue samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (60X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &#8734;/0.15-0.18 WD 0.27</td>
			<td>Most often used for cell samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">sCMOS Camera</td>
			<td style="width:327px;">Photometrics</td>
			<td style="width:360px;">Prime 95B (Rev A8-062802018)</td>
			<td>For acquiring high-sensitivity digital images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">QE65000</td>
			<td>Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tunable Filter Changer</td>
			<td style="width:327px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:360px;">Lambda VF-5</td>
			<td>Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Xenon Arc Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Sunoptic Technologies</td>
			<td style="width:360px;">Titan 300HP Lightsource</td>
			<td>Light source with relatively uniform spectral output</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals

وتعتمد عدة تقنيات على الكشف عن إشارات الفلورة لتحديد الظواهر أو دراستها أو توضيح الوظائف. وقد ثبت أن فصل إشارات الفلورة هذه مرهق حتى ظهور التصوير فوق الطيفي، الذي يمكن فيه فصل مصادر الفلورة عن بعضها البعض وكذلك عن إشارات الخلفية والفلورة الذاتية (نظراً للمعرفة بخصائصها الطيفية التوقيعات). ومع ذلك، فإن التصوير الطيفي الفائق المسحي للانبعاثات التقليدي يعاني من بطء أوقات الاكتساب وانخفاض نسب الإشارة إلى الضوضاء بسبب التصفية الضرورية لكل من الإثارة وضوء الانبعاثات. وقد تبين من قبل أن التصوير الطيفي الفائق المسح يُحدِّد وقت الاكتساب اللازم مع زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء في البيانات المكتسبة في الوقت نفسه. وباستخدام المعدات المتاحة تجارياً، يصف هذا البروتوكول كيفية تجميع ومعايرة واستخدام نظام تصوير التصوير الطيفي الفائق المسح يُظهر الإثارة لفصل الإشارات عن عدة مصادر فلورسفية في عينة واحدة. في حين أن هذه التقنية تنطبق بشكل كبير على التصوير المجهري للخلايا والأنسجة، إلا أنها قد تكون مفيدة لأي نوع من التجارب التي تستخدم الفلورة التي يمكن فيها تغيير أطوال موجية الإثارة، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر: التصوير الكيميائي، التطبيقات البيئية، ورعاية العيون، وعلوم الأغذية، وعلم الطب الشرعي، والعلوم الطبية، والمعادن.

ومن الضروري اتخاذ عدة خطوات هامة من هذا البروتوكول لضمان جمع البيانات الدقيقة والخالية من التصوير والقطع الأثرية الطيفية. وقد يؤدي تخطي هذه الخطوات إلى بيانات تبدو هامة ولكن لا يمكن التحقق منها أو استنساخها مع أي نظام تصوير طيفي آخر، مما يبطل فعلياً أي استنتاجات يتم الت?...

Watch this Scientific Journal Video about Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals at JoVE.com

Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

التصوير المجهري للتصوير الفائق الطيفي للتصوير الضوئي الفائق الطيفي للتمييز بكفاءة بين إشارات الفلورة

وقد أصبح التصوير الطيفي حلاً موثوقاً به لتحديد وفصل إشارات الفلورة المتعددة في عينة واحدة، ويمكن أن يميز بسهولة بين الإشارات ذات الأهمية والخلفية أو الفلورة الذاتية. يحسن التصوير الطيفي الفائق المسح الضوئي على هذه التقنية عن طريق تقليل وقت الحصول على الصور اللازمة مع زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء في نفس الوقت.

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

وهذا البروتوكول هام لأنه يصف طريقة يمكن استخدامها لفصل عدة إشارات فلورية في عينة واحدة. وبالمقارنة مع الأساليب التقليدية، يمكن أن يزيد المسح الضوئي من سرعة التجربة ويحسن حساسية البيانات. باستخدام مصادر الإضاءة المختلفة مثل ليزر supercontinuum ، قد تكون هذه الطريقة قابلة للتطبيق على القرص الغزل أو الليزر المسح المجهر المجهر.عند إجراء المسح الضوئي، التصوير الطيفي المجهري، من المهم التحقق من أن ذروة الإثارة لكل ملصق فلوري يحدث في طول موجي مختلف. للبدء، قم بإعداد مجهر مقلوب للفلورانس وكاميرا كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم تحميل العينة على خشبة المسرح.من القائمة المنسدلة في النافذة الرئيسية micromanager، حدد 475 نانومتر لعرض العينة الأولية. ثم انقر نقراً مزدوجاً فوق المربع الموجود بجوار التعرض، وأدخل 100 لضبط وقت التعرض على 100 مللي ثانية. وأخيراً، انقر مباشرة لعرض العينة.الآن انقر على السيارات. زر نطاق عرض الكثافة التلقائية لتحقيق الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم في نطاقات مرئية ذات معنى. بعد ذلك ، استخدم مقابض التركيز في المجهر لتركيز العينة.بمجرد التركيز، ضبط موضع العينة بحيث تكون الحافة في وسط مجال الرؤية. ثم صقل التركيز. تكون العينة في بؤرة التركيز عندما تظهر ميزات الحافة في الصورة حادة.الآن، افتح أداة الاستحواذ متعددة الأبعاد. في القائمة، انقر فوق زر التحميل واختر إعدادًا مسبقًا يحتوي على نطاق الطول الموجي المناسب للحصول على الاكتساب الطيفي. بمجرد تأكيد إعدادات الامتلاك، انتقل إلى منطقة فارغة من العينة وانقر فوق الحصول على تجميع مجموعة صور طيفية تحتوي على خلفية وضوضاء لاستخدامها للطرح في وقت لاحق.ثم، انتقل حول العينة للعثور على ألمع المناطق. ومن المرجح أن يكون للعينات فلورانس أكثر كثافة بعيدا عن حافة العينة. بمجرد أن تقع المنطقة الأكثر سطوعًا، خذ رصة صورة واحدة.قم بتحميل الصورة المكتسبة في صورة J واستخدم وظيفة قياس Image J للتأكد من عدم وجود أطوال موجية تحتوي على بيكسلات مكشوفة. إذا كان من الضروري تقليل وقت التعرض بسبب التعرض المفرط ، يجب استعادة صورة الخلفية مع وقت التعرض الجديد أيضًا. إذا وجد أن أي من الصور تحتوي على الحد الأعلى للكشف عن الكاميرا، ضبط وقت التعرض للمسح الطيفي لضمان أن الإشارة القصوى في جميع أنحاء النطاق الطيفي لا يتجاوز النطاق الديناميكي للكاميرا.مع وقت التعرض المناسب الآن تحديد، وضع عينة unlabeled على خشبة المسرح. الحصول على بيانات الصورة الطيفية من العينة غير التي تم تصنيفها لتحديد ما إذا كان هناك أي فلورة تلقائية. ثم ضع عينة واحدة على المسرح.الحصول على بيانات الصور الطيفية من كل عينة من العينات ذات التسمية الواحدة لاستخدامها كضوابط طيفية لبناء مكتبة طيفية. إجراء المسح الضوئي لكل عينة تحكم باستخدام وقت التعرض للنطاق الموجي متطابقة وإعدادات الكاميرا. بعد ذلك، ضع شريحة تحتوي على العينة التجريبية على المجهر.حدد حقل عرض تم تصنيفه بشكل مناسب للخلايا والحصول على بيانات الصورة الطيفية من العينة باستخدام إعدادات الاكتساب المحددة. صور تصحيح إلى استجابة طيفية مسطحة عن طريق طرح الطيف الخلفية من صورة العينة وضرب الصورة في معامل التصحيح. هنا ، يتم استخدام برنامج MATLAB لمعالجة الصور بسرعة.بعد ذلك، قم بإنشاء المكتبة الطيفية. للحصول على أفضل النتائج، تطبيع كل عضو نهاية إلى الفرقة الطول الموجي من أكبر كثافة عن طريق تحديد أي الفرقة الطول الموجي له قيمة أكثر كثافة وتقسيم القياس في كل نطاق الطول الموجي من قبل تلك القيمة القصوى. ثم احفظ البيانات الطيفية كملف دات.عند اكتمال، unmix بيانات الصورة الطيفية. سوف تؤدي الخطوة غير المُزكّاة إلى توليد صورة وفرة لكل ملصق فلوري، حيث تكون الوفرة هي مقدار الإشارة الفلورية النسبية في الصورة من الملصق المحتمل. بعد ذلك، افتح كل صورة غير مُزوّت لمعاينة توزيع المكونات النقية بصريًا.مقارنة حجم صورة الخطأ مع تلك الصور غير المُزكّت. إذا كان حجم صورة الخطأ مشابه لصور الوفرة غير المُزكّت، فقد لا يتم حساب الإشارات في بيانات الصورة الطيفية بدقة. وأخيراً، تحقق من وجود هياكل متبقية غير محددة عن طريق مقارنة صورة الخطأ إلى الصور غير المُزكّت.عندما يتم تنفيذها بشكل صحيح، تسمح عملية فك الدمج الطيفي بفصل كومة صورة طيفية إلى مساهمات كل منها من كل تسمية مضنية. هنا، صورة طيفية غير مُجَزَزة مع صور فردية تسلط الضوء على مجرى الهواء السلس لخلايا العضلات، ومسبار GCaMP وتسمية الميتوكوندريا. وهناك خطأ كبير مرتبط بالمنطقتين النووية والقعقعية من الخلايا مما يشير إلى أن الأطياف المقاسة لتلك المناطق لا تُحسَّن جيداً بالأطياف الموجودة في المكتبة الطيفية.الأطياف النقية التي تم جمعها من الخلايا المسماة التي هي أيضا autofluorescent من المرجح أن تلوث التشكيل الجانبي الطيفي للمكون النقي. هنا، يمكن للمرء أن يرى الفرق من الاحتياك مع الأطياف النقية الملوثة مع الفلورا، مقابل الأطياف النقية تصحيح بعد الطرح تحجيم. إن الحصول على البيانات المناسبة أمر ضروري عند تصوير العينات الحساسة لأنها قد تبقى على قيد الحياة فقط في جلسة تصوير واحدة على عكس الخلفية والضوابط التي قد تكون reimaged.تأكد من أن الأجهزة المناسبة وإعدادات الامتلاك محددة مسبقاً قدر الإمكان. وكخطوة تالية، يمكن استخدام مقاطع الفيديو التي تم إنشاؤها من بيانات الفاصل الزمني التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النظام لتتبع المصادر الفلورية في مواقع سرية مع مرور الوقت مثل تعريب إشارة المرسل الثاني. الحرص عند استخدام مصادر الضوء قوية لتجنب التعرض للعين.أيضا، تأكد من ارتداء القفازات المناسبة عند التعامل مع الملصقات البيولوجية.

Research

JoVE Journal

Engineering

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

استخدام متعدد مقصورة الحيوي واحدة أنزيم فانتوم للدراسات وكلاء الرنين المغناطيسي Hyperpolarized

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

ديناميكية المسام على نطاق وخزان شرط التصوير من رد الفعل في كربونات باستخدام السنكروترون التصوير المقطعي السريع

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Advanced Compositional Analysis of Nanoparticle-polymer Composites Using Direct Fluorescence Imaging

المتقدم تحليل التركيبية من المركبات الجسيمات النانوية البوليمر عن طريق المباشر الإسفار التصوير

The fabrication of polymer-nanoparticle composites is extremely important in the development of many functional materials. Identifying the precise ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

نانومتر الفرعي التصوير القرار مع السعة التشكيل الذرية المجهري القوة في السائل

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

ميكروفلويديك تدفق التدفق الخلوي بواسطة غير المتماثلة الكشف الوقت تمتد المجهر الضوئي (أتوم)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes

تصوير تشوريوريتينال المزدوج-طريقة رواية التنظير المجهري والتصوير المقطعي التماسك البصري في عيون الأرانب الحية

Photoacoustic ocular imaging is an emerging ophthalmic imaging technology that can noninvasively visualize ocular tissue by converting light energy into ...

Synchrotron X-ray Microdiffraction and Fluorescence Imaging of Mineral and Rock Samples

السنكروتروني ميكروديفراكتيون الأشعة السينية والتصوير Fluorescence المعدنية وعينات من الصخور

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder ...

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

خالية من تسمية "التصوير من واحد البروتينات ويفرز" من "الخلايا الحية" عبر إيست المجهري

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...