Name: enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity at JoVE.com

ويشكر المؤلفان الدكتور جوزيف وو (جامعة ستانفورد) على التكرم بتقديم بناء شركة Fluc-GFP والدكتور يانوين ليو على المساعدة التقنية الممتازة. ويدعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1 المنح HL95077، HL114120، HL131017، HL138023، UO1 HL134764 (إلى J.Z.)، وHL121206A1 (إلى L.Z.)، وR56 منحة HL142627 (إلى W.Z.)، وهو جمعية القلب الأمريكية منحة العالم 16SDG30410018، وجامعة ألاباما في برمنغهام كلية منحة التنمية (إلى W.Z.).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة ألاباما في برمنغهام، واستندت إلى المعاهد الوطنية للصحة مختبر رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية (NIH المنشور لا 85-23).
1. إعداد لوحات الثقافة والإعل?...

<ol>
	<li>Menasche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clinical+use+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors:+a+translational+experience.">Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience.</a> European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Frisch, S. M., Francis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+epithelial+cell-matrix+interactions+induces+apoptosis.">Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis.</a> Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).</li><li>Haun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+anoikis+signalling+pathway+using+the+fungal+virulence+factor+gliotoxin.">Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin.</a> Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).</li><li>Ohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase+ROCK+activates+LIM-kinase+1+by+phosphorylation+at+threonine+508+within+the+activation+loop.">Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).</li><li>Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase-dependent+contraction+of+stress+fibres+and+the+organization+of+focal+adhesions.">Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions.</a> Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).</li><li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression.">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li><li>Legate, K. R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+adaptor+binding+to+beta-integrin+cytoplasmic+tails.">Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+Inhibitor+Y-27632+Promotes+Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Survival+by+Altering+Cellular+Biomechanical+Properties.">ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties.</a> Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).</li><li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li><li>Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCND2+Overexpression+Enhances+the+Regenerative+Potency+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes:+Remuscularization+of+Injured+Ventricle.">CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle.</a> Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Single-Cell+Analysis+of+Transplanted+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+After+Acute+Myocardial+Infarction.">Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction.</a> Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+Preconditioning+Enhances+Transplantation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+in+Myocardial+Infarction+Mice.">Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice.</a> Cardiovascular Research. , (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inhibition+promotes+atypical+anoikis+in+glioma+cells.">Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e1012 (2014).</li><li>Lelievre, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+mediates+neuronal+cell+survival+through+Bim+down-regulation.">N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation.</a> PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+cell+motility+by+carbon+ion+irradiation+via+the+Rho+signaling+pathway+and+its+inhibition+by+the+ROCK+inhibitor+Y-27632+in+lung+adenocarcinoma+A549+cells.">Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells.</a> Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).</li><li>Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC-beta+exacerbates+in+vitro+brain+barrier+damage+in+hyperglycemic+settings+via+regulation+of+RhoA/Rho-kinase/MLC2+pathway.">PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).</li></ol>

وتشمل الخطوات الرئيسية لهذه الدراسة الحصول على hiPSC-CMs نقية، وتحسين نشاط hiPSC-CMs من خلال Y-27632 المعالجة المسبقة، وأخيرا، زرع كمية دقيقة من hiPSC-CMs في نموذج MI الماوس.
وكانت القضايا الرئيسية التي تم تناولها هنا هي أننا، أولاً، قمنا بتحسين أساليب التنقية الخالية من الجلوكوز...

وقد أظهرت العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية إمكانات كبيرة كعلاج لتلف القلب الناجم عن MI1. استخدام hiPSCs المتمايزة يوفر مصدرا لا ينضب من hiPSC-CMs2 ويفتح الباب أمام التطور السريع للعلاجات اختراق. ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من القيود على الترجمة العلاجية، بما في ذلك التحدي المتمثل في انخفاض معدل تطعيم الخلايا المزروعة بشكل حاد.
فصل الخلايا مع التربسين يبدأ anoikis3، والتي يتم تسريعها فقط مرة واحدة يتم حقن هذه الخلايا في بيئات قاسية مثل عضلة القلب الإقفارية ، حيث البيئة نقص الأكسجة يسرع المسار نحو موت الخلايا. من الخلايا المتبقية، يتم غسل نسبة كبيرة من موقع الزرع في مجرى الدم وتنتشر في جميع أنحاء المحيط. واحدة من المسارات المبرمج ة الرئيسية هو مسار RhoA / ROCK4. استنادا إلى البحوث السابقة، ومسار RhoA / ROCK ينظم منظمة الأكتين الخلوية الهيكلية5،6، وهو المسؤول عن خلل الخلية7،8. يستخدم مثبطات ROCK Y-27632 على نطاق واسع خلال انفصال الخلايا الجسدية والجذعية وتمريرها، لزيادة التصاق الخلايا والحد من المبرمج للخلايا9و10و11. في هذه الدراسة، يستخدم Y-27632 لعلاج hiPSC-CMs قبل زرع في محاولة لزيادة معدل تطعيم الخلايا.
وقد تم إنشاء عدة طرق تهدف إلى تحسين معدل تطعيم الخلايا، مثل الصدمة الحرارية والطابق السفلي طلاء مصفوفة غشاء12. وبصرف النظر عن هذه الأساليب، يمكن للتكنولوجيا الوراثية أيضا تعزيز انتشار خلايا القلب13 أو عكس الخلايا غير المريمية في خلايا القلب14. من منظور الهندسة الحيوية، يتم زرع خلايا القلب على سقالة المواد الحيوية لتحسين كفاءة زرع15. ومما يؤسف له أن غالبية هذه الأساليب معقدة ومكلفة. على العكس من ذلك، فإن الطريقة المقترحة هنا بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وفعالة، ويمكن استخدامها كعلاج القاعدية قبل زرع، وكذلك في الاقتران مع التكنولوجيات الأخرى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase (stem cell detachment solution)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>20163029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM (calcium indicator)</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free RPMI 1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (extracellular matrix )</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR (human pluripotent stem cells medium)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (surfactant polyol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho activator II</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>CN03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium DL-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE (cell-dissociation enzymes)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm Coverslips</td>
			<td>Warner</td>
			<td>CS-15R15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Camera</td>
			<td>pco</td>
			<td>1200 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scan Head</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-42LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microincubation System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>DH-40iL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minivent Mouse Ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/SCID mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast Protein Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Packs</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1704156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot System</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab198580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin C</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab137130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab47003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-175-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-095-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab91605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#946;1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ab9260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Myosin Light Chain 2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3671s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2016A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.52g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity

عامل حاسم في تحسين فعالية العلاج الخلوي لتجديد عضلة القلب هو زيادة بأمان وكفاءة معدل تطعيم الخلايا. Y-27632 هو مثبط قوي للغاية من الكينا البروتين المرتبطة بـ Rho، واللفائف المحتوية على لفائف (RhoA/ROCK) ويستخدم لمنع المبرمج الخلوي الناجم عن التفكك (anoikis). نثبت أن المعالجة المسبقة Y-27632 لخلايا القلب المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى (hiPSC-CMs+RI)قبل زرع نتائج في تحسين معدل تطعيم الخلايا في نموذج الماوس من احتشاء عضلة القلب الحاد (MI). هنا، نقوم بوصف إجراء كامل من التمايز hiPSC-CMs، وتنقية، والعلاج المسبق للخلايا مع Y-27632، فضلا عن تقلص الخلايا الناتجة، قياسات عابرة الكالسيوم، وزرع في نماذج MI الماوس. توفر الطريقة المقترحة طريقة بسيطة وآمنة وفعالة ومنخفضة التكلفة مما يزيد بشكل كبير من معدل تطعيم الخلايا. لا يمكن استخدام هذه الطريقة فقط جنبا إلى جنب مع طرق أخرى لزيادة تعزيز كفاءة زرع الخلايا ولكن أيضا يوفر أساسا مواتيا لدراسة آليات أمراض القلب الأخرى.

وقد استمدت الـ hiPSC-CMs المستخدمة في هذه الدراسة من أصل بشري مع جين مراسل لوسيفيراز؛ لذلك، تم الكشف عن معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا المزروعة في الجسم الحي عن طريق التصوير الإنارة الحيوية (BLI)17 (الشكل1A،B). بالنسبة لأقسام القلب الن...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity at JoVE.com

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

في هذا البروتوكول، نقوم بشرح وتفصيل كيفية استخدام الخلايا الجذعية متعددة القوى التي يسببها الإنسان للتمايز وتنقية خلايا القلب، والمزيد، حول كيفية تحسين كفاءتها في زرع مع مثبطات كيناز البروتين المرتبطة بـ Rho المعالجة المسبقة في نموذج احتشاء عضلة القلب الماوس.

تعزيز تطعيم خلايا القلب المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان عن طريق تثبيط عابر لنشاط رو كيناز

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

بياناتنا توضح أن تثبيط عابرة من نشاط Rho كيناز يعزز التصاق، والبقاء، وengraftment من القلب المشتقة من هيبسك بعد زرعها في قلوب الحيوانات المهجوعة. نحن نقدم بسيطة، منخفضة التكلفة، في حين أن طريقة عالية الكفاءة لزيادة engraftment من زرع هيبسك المشتقة من القلب في قلوب الحيوانات المصابة. كما يمكن أن تحسن هذه التقنية معدلات engraftment الخلايا بأمان وكفاءة في احتشاء القلب الحاد وفشل القلب، فإنه يساهم في التحسينات الناتجة في وظيفة القلب، والأوعية الدموية، و المبرمج.على الرغم من أننا اختبرنا بروتوكولاتنا فقط في الـ(هيبس) إلا أن هذه الطرق يمكن تطبيقها على أنواع أخرى من الخلايا، مثل الخلايا الجذعية الجنينية، والخلايا الجذعية الماسية، وما إلى ذلك. جرعة ومدة العلاج Y-27632 أمر بالغ الأهمية. يمكن أن تظهر مظاهرة بصرية بقدر كبير من التفصيل جميع الخطوات الرئيسية في البروتوكول، وهو أمر مفيد لشخص لم يسبق له أن أدى هذه التقنية من قبل.في اليوم 21 بعد التمايز hiPSC-CM، التعرق المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني عقيمة مرة واحدة. احتضان الخلايا مع 0.5 ملليلتر من إنزيمات تفكك الخلايا في بئر 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى سبع دقائق. بعد فترة الحضانة، والماصات مرارا وتكرارا تعليق الخلية باستخدام ماصة ملليلتر واحد من أجل فصل الخلايا تماما.ثم، إضافة ملليلتر واحد من حل تحييد لكل بئر، وجمع خليط الخلية في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر، والطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي، تجاهل السوبر و resuspend الخلايا في حل تحييد. ثم، إعادة زرع الخلايا على الجيلاتين المغلفة، لوحات ستة جيدا في كثافة مليوني خلية في البئر.بعد 24 إلى 48 ساعة، استبدل الوسيطة الثقافية بوسيلة التنقية لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام. قبل زرع, زرع الخلايا في مجموعة العلاج لمدة 12 ساعة في RB زائد المتوسطة تكمل مع 10-ميكرومولار Y-27632. وبالمثل، إجراء العلاج فيراباميل على الخلايا في المتوسط RB زائد مع ميكرومول واحد من فيراباميل لمدة 12 ساعة.بعد العلاج، وغسل هيبسك-CMs مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة، واحتضان الخلايا مع 0.5 ميكرولترات من إنزيمات تفكك الخلايا في البئر لمدة أقصاها دقيقتين. الماص مرارا وتكرارا تعليق الخلية باستخدام ماصة ملليلتر واحد لتفكك الخلايا تماما. بعد ذلك، تحييد الخلايا مع تحييد الحل، وجمع خليط الخلية في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر، والطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة ثلاث دقائق.بعد الطرد المركزي، resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني بتركيز 0.1 مليون خلية لكل خمسة ميكرولترات استعدادا للحقن. مباشرة بعد احتشاء عضلة القلب التعريفي، حقن خمسة ميكرولترات من hiPSC السيطرة-CMs، Y-27632-pretreated hiPSC-CMs، فيراباميل المعالجة hiPSC-CMs، أو حجم متساو من برنامج تلفزيوني في عضلة القلب الماوس في كل موقع، واحد في منطقة هافيركت واثنين في المناطق المحيطة بالحفار. قبل 12 ساعة من إجراء الكشف عن الكالسيوم العابر والانكماشية ، أضف 10 ميكرومولار Y-27632 ، 100 نانومولار RA ، فيراباميل واحد ميكرومولار ، أو حجم متساو من PBS في وسط الثقافة من hiPSC-CMs.بعد ذلك ، تجاهل المتوسطة ، وغسل لوحة مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة. تغيير المتوسطة إلى DMEM الحمراء خالية من الفينول التي تحتوي على 0.02 الوزن لكل حجم في المئة من البوليول السطحي، خمسة ميكرومولار الكالسيوم المؤشر، وY-27632 المقابلة، RA، فيراباميل، أو حجم متساو من برنامج تلفزيوني، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، والتخلص من اعمال، وغسل الخلايا مع DMEM خالية من الصبغة ثلاث مرات، والسماح للراحة المتوسطة لمدة 30 دقيقة ل de-استقريف صبغة رسم الخرائط.ضع غطاء الخلايا المبذر في غرفة حمام مفتوحة، وأدخل الغرفة في نظام الدمج الدقيق المكافئ إلى 37 درجة مئوية مع وحدة تحكم تلقائية لدرجة الحرارة. Perfuse مع حل التيرود ، وإضافة مستمرة RI ، RA ، أو برنامج تلفزيوني إلى حل الضخ. استخدم مجهر الفلورانس المقلوب ورأس المسح الضوئي بالليزر لتسجيل عابر الكالسيوم التلقائي عن طريق استخدام مسح خط x-t.سجل الانقباض التلقائي لـ hiPSC-CMs باستخدام وظيفة التباين التفاضلي للتداخل في المجهر confocal. تم تأكيد معدل البقاء على قيد الحياة للخلايا المزروعة من خلال زيادة نشاط لوسيفراز. أظهرت زيادة تروبونين القلب البشري T وتعبير المستضد النووي البشري أن المعالجة المسبقة Y-27632 يمكن أن تحسن بشكل كبير معدل نقادة الخلايا.Y-27632 أظهرت الخلايا المعالجة المسبقة هيكل الهيكل العظمي على شكل قضيب أكبر وأكثر تحديدًا. أيضا، Y-27632 انخفض المعالجة المسبقة الخلايا الإيجابية موالف، مما يشير إلى انخفاض زرع hiPSC-CM المبرمج في الجسم الحي. واقترحت لطخة غربية أن Y-27632 قبل المعالجة زيادة التعبير عن بيتا-1 وN-cadherin انخفض التعبير عن سلسلة الضوء فوسفو-ثيوسين 2.تم تطبيع هذا التغيير بعد 72 ساعة من انسحاب Y-27632. في المختبر الماوس HL-1 تجارب مرفق الخلية أشارت إلى أن Y-27632 قبل المعالجة زيادة كبيرة التزام hiPSC-CM نسبة إلى HL-1. Y-27632 قبل المعالجة خفضت قوة التقلص، وذرية الفلورية عابرة الكالسيوم، ومدة عابرة الكالسيوم.Y-27632 قبل المعالجة ينظم انكماش القلب من خلال الحد بشكل كبير من التعبير عن cTnI و cTnT. على غرار Y-27632, فيراباميل المعالجة المسبقة زيادة نشاط لوسيفيراز وأعداد الخلايا الإيجابية المزدوجة hcTnT/HNA. الخطوة الأكثر أهمية هي زراعة الخلايا في مجموعة العلاج لمدة 12 ساعة في RB-plus المتوسطة تكملها 10 ميكرومولار Y-27632.وبناء على هذه الطريقة، فإن الإفراج البطيء عن Y-27632 لزيادة معدل النقش الخلوي هو استراتيجية واعدة. هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لدراسة علم وظائف الأعضاء ووظيفتها hiPSC من CMs في الجسم الحي. جزيء صغير CHIR99021 المستخدمة للتمايز cardiomyocytes خطرة، والتي قد تسبب تهيج في الجهاز التنفسي.من فضلك لا تتناول أو تستنشق بأي شكل من الأشكال.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز في المختبر الاعتداء

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

تنقية البروتين اللاهوائية وتحليل الحركية عبر مسرى الأوكسجين لدراسة النشاط ديوكسيجيناسي دسب وتثبيط

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

الإنسان المحيطية عزل العدلات الدم لاستجواب باركنسون المرتبطة LRRK2 مسار كيناز من خلال تقييم Rab10 الفوسفور

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

تحديد ركائز كيناز CK2 الرواية باستخدام نهج بيوكيميائية تنوعاً

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

دراسة التمثيلات الحمض النووي الريبي للبروتين كيناز المنشط الجيش الملكي النيبالي خلال دورة الخلية الثديية

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

واحد خطوه إثراء من الحنفية الموسومة histone deاسيتيل من الفطريات الخيطية الرشاشيات معشش لفحص النشاط الانزيمي

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...