Name: enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity at JoVE.com

המחברים מודים לד ר ג'וזף ג. וו (אוניברסיטת סטנפורד) לספק באדיבות את המבנה Fluc-GFP וד ר יאנון ליו לקבלת סיוע טכני מעולה. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי של בריאות RO1 מענקים HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (כדי J.Z.), ו HL121206A1 (כדי L.Z.), ו R56 מענק HL142627 (כדי W.Z.), מענק האיגוד האמריקני לפיתוח מדען האגודה 16SDG30410018, ואת אוניברסיטת אלבמה ב ברמינגהאם מענק פיתוח הפקולטה (כדי W.Z.).

כל ההליכים בעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים הוועדה השתמש (IACUC) של אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם התבססו על המכון הלאומי של מעבדת בריאות טיפול בעלי חיים והנחיות להשתמש (NIH פרסום לא 85-23).
1. הכנת לוחות תרבות ומדיה ותרבות
<ol><li>
הכנה בינונית
	<ol>
<li>עבור ?...

<ol>
	<li>Menasche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clinical+use+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors:+a+translational+experience.">Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience.</a> European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Frisch, S. M., Francis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+epithelial+cell-matrix+interactions+induces+apoptosis.">Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis.</a> Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).</li><li>Haun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+anoikis+signalling+pathway+using+the+fungal+virulence+factor+gliotoxin.">Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin.</a> Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).</li><li>Ohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase+ROCK+activates+LIM-kinase+1+by+phosphorylation+at+threonine+508+within+the+activation+loop.">Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).</li><li>Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase-dependent+contraction+of+stress+fibres+and+the+organization+of+focal+adhesions.">Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions.</a> Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).</li><li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression.">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li><li>Legate, K. R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+adaptor+binding+to+beta-integrin+cytoplasmic+tails.">Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+Inhibitor+Y-27632+Promotes+Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Survival+by+Altering+Cellular+Biomechanical+Properties.">ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties.</a> Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).</li><li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li><li>Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCND2+Overexpression+Enhances+the+Regenerative+Potency+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes:+Remuscularization+of+Injured+Ventricle.">CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle.</a> Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Single-Cell+Analysis+of+Transplanted+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+After+Acute+Myocardial+Infarction.">Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction.</a> Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+Preconditioning+Enhances+Transplantation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+in+Myocardial+Infarction+Mice.">Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice.</a> Cardiovascular Research. , (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inhibition+promotes+atypical+anoikis+in+glioma+cells.">Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e1012 (2014).</li><li>Lelievre, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+mediates+neuronal+cell+survival+through+Bim+down-regulation.">N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation.</a> PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+cell+motility+by+carbon+ion+irradiation+via+the+Rho+signaling+pathway+and+its+inhibition+by+the+ROCK+inhibitor+Y-27632+in+lung+adenocarcinoma+A549+cells.">Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells.</a> Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).</li><li>Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC-beta+exacerbates+in+vitro+brain+barrier+damage+in+hyperglycemic+settings+via+regulation+of+RhoA/Rho-kinase/MLC2+pathway.">PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).</li></ol>

השלבים המרכזיים של מחקר זה כוללים השגת היפוך טהור-CMs, שיפור הפעילות של היפרsc-CMs דרך Y-27632 pretreatment טיפול, ולבסוף, שתילת כמות מדויקת של היפנוsc-CMs לתוך מודל MI של העכבר.
הנושאים המרכזיים שנדונו כאן היו כי, תחילה, אנו אופטימיזציה שיטות הטיהור ללא גלוקוז19 והקימו מערכת טיהו...

תאי גזע מבוססי טיפולים הראו פוטנציאל ניכר כטיפול בנזקי לב שנגרמו על ידי MI1. השימוש הבדיל hiPSCs מספק מקור בלתי נדלה של היפנואס-CMs2 ופותח את הדלת להתפתחות מהירה של טיפולים פריצת דרך. עם זאת, נותרו מגבלות רבות לתרגום תרפויטי, כולל האתגר של השיעור הנמוך החמור ביותר של תאים מושתלים.
הנתק תאים עם טריפסין יוזם anoikis3, אשר מואצת רק פעם אחת תאים אלה מוזרק לסביבות קשות כמו שריר הלב, שם הסביבה ארוי מאיצה את הקורס לקראת מוות התאים. מבין התאים הנותרים, מדובר בפרופורציה גדולה החוצה מאתר ההשתלה למחזור הדם ומתפשט ברחבי הפריפריה. אחד המסלולים מפתח השבץ הוא מסלול RhoA/סלע4. בהתבסס על המחקר הקודם, מסלול rhoa/סלע מווסת את ארגון אקטין השלד של הגוף5,6, אשר אחראי על תפקוד התאים7,8. הסלע מעכב Y-27632 נמצא בשימוש נרחב במהלך הדיסוציאציה של תאי גזע ומלא, כדי להגדיל את הדבקה התא ולהפחית אפופטוזיס תא9,10,11. במחקר זה, Y-27632 משמש לטיפול היפרsc-CMs לפני השתלת בניסיון להגדיל את שיעור התא המקביל.
מספר שיטות שמטרתן לשפר את שיעור התיאום בין התאים, כגון שוק חום וציפוי מטריצות ממברדת מרתפים12, הוקמו. מלבד שיטות אלה, טכנולוגיה גנטית יכולה גם לקדם את התפשטות הקרדיוציט13 או תאים שאינם שריר הלב לתוך הקרדיוציטים14. מנקודת המבט הביולוגית, הקרדיוציטים. מתשתלת בתוך ביופיגום כדי לשפר את יעילות ההשתלה15 למרבה הצער, רוב השיטות האלה הן מסובכות ויקרות. להיפך, השיטה המוצעת כאן היא פשוטה, חסכונית ויעילה, והיא יכולה לשמש כטיפול בסיס לפני ההשתלה, כמו גם בקוניוגציה עם טכנולוגיות אחרות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase (stem cell detachment solution)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>20163029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM (calcium indicator)</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free RPMI 1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (extracellular matrix )</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR (human pluripotent stem cells medium)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (surfactant polyol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho activator II</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>CN03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium DL-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE (cell-dissociation enzymes)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm Coverslips</td>
			<td>Warner</td>
			<td>CS-15R15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Camera</td>
			<td>pco</td>
			<td>1200 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scan Head</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-42LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microincubation System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>DH-40iL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minivent Mouse Ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/SCID mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast Protein Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Packs</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1704156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot System</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab198580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin C</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab137130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab47003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-175-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-095-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab91605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#946;1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ab9260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Myosin Light Chain 2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3671s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2016A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.52g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity

גורם מכריע בשיפור האפקטיביות של הטיפול הסלולארי להתחדשות שריר הלב היא להגדיל בביטחה וביעילות את שיעור התיאום בין התאים. Y-27632 הוא מעכב חזק מאוד של Rho-הקשורים, סליל המכיל חלבון קינאז (RhoA/רוק) והוא משמש כדי למנוע אפופטוזיס המושרה תא (anoikis). אנו מדגימים כי Y-27632 מראש עבור האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע שמקורם בגוף (היפנוטית-CMs+ RI) לפני תוצאות השרשה תא שיפור שיעור השיפור במודל העכבר של אוטם שריר הלב חריפה (MI). כאן, אנו מתארים הליך מלא של בידול היפנוסי-CMs, טיהור, תא טיפול מקדים עם Y-27632, כמו גם את התכווצות התאים המתקבל, מדידות חולף סידן, ו השתלת לתוך מודלים MI של העכבר. השיטה המוצעת מספקת שיטה פשוטה, בטוחה, אפקטיבית ובעלות נמוכה אשר מגדילה באופן משמעותי את קצב התיאום בין התאים. שיטה זו לא ניתן להשתמש רק בשילוב עם שיטות אחרות כדי לשפר עוד יותר את יעילות השתלת התא, אך גם מספק בסיס נוח לחקר המנגנונים של מחלות לב אחרות.

ההיסק-CMs המשמש במחקר זה נגזר ממוצא אנושי עם גן כתבת לוציפראז; לכן, שיעור ההישרדות של התאים המושתלים ב vivo זוהה על ידי הדמיה biלומינסנציה (בלי)17 (איור 1a, B). עבור מקטעי לב היסטלוגיים, לבבות בעלי מערכת לב בעלי מטרה מסוימת (מימן) ואנטיגן גרעינ?...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity at JoVE.com

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

בפרוטוקול זה, אנו להפגין ולפרט כיצד להשתמש בתאי גזע המושרה האדם pluripotent לבידול וטיהור, ועוד, על איך לשפר את היעילות השתלת שלה עם Rho-הקשורים החלבון קינאז מעכבי טיפול מקדים במודל אוטם שריר הלב של העכבר.

שיפור העפילו של תא גזע הנגרם לידי אדם-קרדיוציטים באמצעות עיכוב חולף של פעילות Rho קינאז

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

הנתונים שלנו מראים כי עיכוב חולף של פעילות Rho-kinase משפר הידבקות, הישרדות, וחריטה של cardiomyocytes נגזר hiPSC לאחר שהושתל לתוך לבבות בעלי חיים אוטם. אנו מספקים שיטה פשוטה, בעלות נמוכה, תוך יעילה מאוד להגברת חריטה של קרדיומיוציטים המושתלים שמקורם ב- hiPSC בלבבות בעלי החיים הפצועים. כמו טכניקה זו יכולה לשפר את שיעורי חריטה התא בבטחה וביעילות אוטם לב חריף ואי ספיקת לב, זה תורם לשיפורים וכתוצאה מכך בתפקוד הלב, כלי דם, אפופטוזיס.למרות שבדקנו את הפרוטוקולים שלנו רק ב- hiPSCs, ניתן ליישם שיטות אלה על סוגים אחרים של תאים, כגון תאי גזע עובריים, תאי גזע mesenchymal, וכו '. המינון ומשך הטיפול Y-27632 הוא קריטי. ההדגמה החזותית יכולה להדגים בפירוט רב את כל השלבים העיקריים בפרוטוקול, וזה מועיל עבור מישהו שמעולם לא ביצע טכניקה זו לפני.ביום 21 לאחר בידול hiPSC-CM, שאפו את המדיום ושטפו את התאים עם PBS סטרילי פעם אחת. דגירה התאים עם 0.5 מיליליטר של אנזימי דיסוציאציה התא ל הבאר ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד שבע דקות. לאחר זמן הדגירה, שוב ושוב pipette ההשעיה התא באמצעות פיפטה מיליליטר אחד על מנת לנתק ביסודיות את התאים.לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של נטרול פתרון לכל באר, אוספים את תערובת התאים בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך שלוש דקות. לאחר הצנטריפוגה, השלך את העל-טבעי והתן מחדש את התאים בתת-הפתרון המנטרל. לאחר מכן, לשתול מחדש את התאים על מצופה ג'לטין, שש בארות צלחות בצפיפות של שני מיליון תאים לגם.לאחר 24 עד 48 שעות, החלף את מדיום התרבות במדיום הטיהור במשך שלושה עד חמישה ימים. לפני ההשתלה, תרבות התאים בקבוצת הטיפול במשך 12 שעות ב RB פלוס בינוני בתוספת 10 מיקרומולרי Y-27632. באופן דומה, לבצע טיפול verapamil על התאים במדיום RB פלוס עם micromole אחד של verapamil במשך 12 שעות.לאחר הטיפול, לשטוף את hiPSC-CMs עם PBS פעם אחת, ולהדקר את התאים עם 0.5 microliters של אנזימי דיסוציאציה התא ל הבאר לכל היותר שתי דקות. שוב ושוב pipette ההשעיה התא באמצעות פיפטה מיליליטר אחד כדי לנתק ביסודיות את התאים. לאחר מכן, לנטרל את התאים עם פתרון נטרול, לאסוף את תערובת התא בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך שלוש דקות.לאחר צנטריפוגה, תן שימוש חוזר בתאים ב- PBS בריכוז של 0.1 מיליון תאים לכל חמישה מיקרוליטרים כהכנה להזרקה. מיד לאחר אינדוקציה אוטם שריר הלב, להזריק חמישה microliters של hiPSC-CMs שליטה, Y-27632-pretreated hiPSC-CMs, hiPSC-CMs מטופלים verapamil, או נפח שווה של PBS לתוך שריר הלב של העכבר בכל אתר, אחד באזור infarct ושניים באזורים סביב infarct. 12 שעות לפני ביצוע זיהוי סידן ארעי והתכווצות, להוסיף 10 מיקרומולר Y-27632, 100-nanomolar RA, verapamil מיקרומולר אחד, או נפח שווה של PBS לתוך מדיום התרבות של hiPSC-CMs.לאחר מכן, להשליך את המדיום, ולשטוף את הצלחת עם PBS פעם אחת. שנה את המדיום ל- DMEM נטול פניול נטול אדום המכיל 0.02 משקל לנפח של פוליול פעילי שטח, מחוון סידן חמישה מיקרומולרים, ואת Y-27632 המתאים, RA, verapamil, או נפח שווה של PBS, ולטוג את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, השליכו את העל-טבעי, שטפו את התאים עם ה-DMEM נטול הצבע שלוש פעמים, ותנו לבינונה הבינונית לנוח במשך 30 דקות כדי לבטל את האסטרוזציה של צבע המיפוי.מניחים את הכיסויים עם זרעי התא בתא אמבטיה פתוח, ומכניסים את התא למערכת מיקרו-אינקובציה הציידה ל-37 מעלות צלזיוס עם בקר טמפרטורה אוטומטי. לנטרל אותו עם הפתרון של טירוד, ולהוסיף ברציפות RI, RA, או PBS לפתרון תדלוק. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך וראש סריקת לייזר כדי להקליט סידן ארעי ספונטני על ידי שימוש בסריקת קו x-t.רשום את ההתכווצות הספונטנית של hiPSC-CMs באמצעות פונקציונליות ניגודיות ההפרעה המדרגית של המיקרוסקופ הקונפוקלי. שיעור ההישרדות של התאים המושתלים אושר על ידי פעילות לוציפראז מוגברת. טרופונין לב אנושי מוגבר T וביטוי אנטיגן גרעיני אנושי הראו כי טיפול מקדים Y-27632 יכול לשפר באופן משמעותי את קצב חריטה התא.תאים מטופלים Y-27632 הציגו מבנה ציטוסקלטלי גדול ומוגדר יותר בצורת מוט. כמו כן, Y-27632 טיפול מקדים ירד תאים חיוביים TUNEL, המציין את אפופטוזיס hiPSC-CM מושתל מופחת ב vivo. כתם מערבי הציע כי טיפול מקדים Y-27632 הגביר את הביטוי של בטא-1 ו- N-cadherin של Y-27632 והפחית את הביטוי של שרשרת אור phospho-myosin 2.שינוי זה היה מנורמל 72 שעות לאחר נסיגת Y-27632. ניסויים בהצמדת תא HL-1 בעכבר במבחנה הצביעו על כך שקדם-טיפול Y-27632 הגדיל באופן משמעותי את הדבקות hiPSC-CM ביחס ל- HL-1. טיפול מקדים Y-27632 הפחית את הכוח החוזי, את שיא הסידן הפלואורסצנטי חולף, ואת משך הסידן חולף.Y-27632 טיפול מקדים מוסדר התכווצות cardiomyocyte על ידי צמצום משמעותי את הביטוי של cTnI ו cTnT. בדומה ל- Y-27632, טיפול מקדים verapamil גדל פעילות luciferase ומספרים של תאים חיוביים כפולים hcTnT / HNA. הצעד החשוב ביותר הוא לתאי תרבות בקבוצת הטיפול במשך 12 שעות ב Rb פלוס בינוני בתוספת 10 מיקרומולרי Y-27632.בהתבסס על שיטה זו, שחרור איטי של Y-27632 כדי להגדיל עוד יותר את קצב חריטה התא היא אסטרטגיה מבטיחה. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לחקור את הפיזיולוגיה והתפקוד של hiPSC של CMs ב vivo. המולקולה הקטנה CHIR99021 המשמשת להתברות קרדיומיוציטים מסוכנת, מה שעלול לגרום לגירוי נשימתי.נא לא צריכת או לשאוף בשום דרך.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

צעד אחד העשרת הברז-Tagged הידסטון Deאצטקלז של פטריה Filamentous מנידוס מינידוס לפעילות אנזימטית

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...