Name: enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00
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著者らは、Fluc-GFPコンストラクトを親切に提供してくれたジョセフ・C・ウー博士(スタンフォード大学)とヤンウェン・リウ博士に優れた技術支援を提供してくれたことに感謝しています。この研究は、米国国立衛生研究所RO1助成金HL95077、HL114120、HL131017、HL138023、UO1 HL134764(J.Z.)、およびHL121206A1(L.Z.)、およびR56助成金HL142627(米国科学者への)によってサポートされています。16SDG30410018、およびバーミンガム教員開発助成金(W.Z.)のアラバマ大学。

この研究のすべての動物の手順は、バーミンガムのアラバマ大学の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、国立衛生研究所動物ケアおよび使用ガイドライン(NIH出版No.)に基づいていました。85-23)。
1. 培養メディア・文化プレートの作成
<ol><li>
中程度の準備
	<ol>
<li>hiPSC培地の場合は、ヒト多能性幹細胞(hPSC)基底培地(材料表1)の400...

<ol>
	<li>Menasche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clinical+use+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors:+a+translational+experience.">Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience.</a> European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Frisch, S. M., Francis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+epithelial+cell-matrix+interactions+induces+apoptosis.">Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis.</a> Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).</li><li>Haun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+anoikis+signalling+pathway+using+the+fungal+virulence+factor+gliotoxin.">Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin.</a> Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).</li><li>Ohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase+ROCK+activates+LIM-kinase+1+by+phosphorylation+at+threonine+508+within+the+activation+loop.">Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).</li><li>Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase-dependent+contraction+of+stress+fibres+and+the+organization+of+focal+adhesions.">Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions.</a> Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).</li><li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression.">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li><li>Legate, K. R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+adaptor+binding+to+beta-integrin+cytoplasmic+tails.">Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+Inhibitor+Y-27632+Promotes+Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Survival+by+Altering+Cellular+Biomechanical+Properties.">ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties.</a> Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).</li><li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li><li>Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCND2+Overexpression+Enhances+the+Regenerative+Potency+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes:+Remuscularization+of+Injured+Ventricle.">CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle.</a> Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Single-Cell+Analysis+of+Transplanted+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+After+Acute+Myocardial+Infarction.">Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction.</a> Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+Preconditioning+Enhances+Transplantation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+in+Myocardial+Infarction+Mice.">Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice.</a> Cardiovascular Research. , (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inhibition+promotes+atypical+anoikis+in+glioma+cells.">Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e1012 (2014).</li><li>Lelievre, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+mediates+neuronal+cell+survival+through+Bim+down-regulation.">N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation.</a> PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+cell+motility+by+carbon+ion+irradiation+via+the+Rho+signaling+pathway+and+its+inhibition+by+the+ROCK+inhibitor+Y-27632+in+lung+adenocarcinoma+A549+cells.">Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells.</a> Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).</li><li>Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC-beta+exacerbates+in+vitro+brain+barrier+damage+in+hyperglycemic+settings+via+regulation+of+RhoA/Rho-kinase/MLC2+pathway.">PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).</li></ol>

本研究の主なステップは、純粋なhiPSC-PMの取得、Y-27632前処理によるhiPSC-PMの活性の向上、そして最後に、正確な量のhiPSC-PMをマウスMIモデルに移植することである。
ここで取り上げられた主な問題は、まず、グルコースフリー精製方法19を最適化し、新規の効率的な精製システムを確立したことです。システム手順には、細胞解離酵素の適用、ゼラチンコ...

幹細胞ベースの治療法は、MI1によって引き起こされる心臓損傷の治療薬としてかなりの可能性を示している。差別化されたhiPSCの使用はhiPSC-CM2の無尽蔵の源を提供し、画期的な処置の急速な発展のためのドアを開く。しかしながら、移植細胞の移植率が著しく低い課題を含む治療翻訳には多くの制限が残っている。
トリプシンとの解離細胞は、低酸素環境が細胞死に向かう過程を加速する虚血性心筋のような過酷な環境に注入された後にのみ加速されるアノイキス3を開始する。残りの細胞のうち、大部分は移植部位から血流に洗い流され、周辺に広がる。主要なアポトーシス経路の1つは、RhoA/ROCK経路4です。以前の研究に基づいて、RhoA/ROCK経路は、細胞機能障害7、8を担当するアクチン細胞骨格組織5、6を調節する。ROCK阻害剤Y-27632は、体細胞および幹細胞の解離および通過時に広く使用され、細胞接着性を高め、細胞アポトーシス9、10、11を減少させる。本研究では、Y-27632は移植前のhiPSC-CMを治療し、細胞生着率を高めるために用いられる。
ヒートショックや基体膜マトリックスコーティング12など、細胞生着速度の向上を目的としたいくつかの方法が確立されている。これらの方法とは別に、遺伝技術はまた、心筋細胞増殖13を促進するか、または心筋細胞14に非筋細胞を逆転させることができる。バイオエンジニアリングの観点から、心筋細胞は、移植効率を向上させるために生体材料足場に播種される15.残念ながら、これらの方法の大半は複雑でコストがかかります。それどころか、ここで提案される方法は、シンプルで費用対効果が高く、効果的であり、移植前の基礎治療や他の技術との結合としても使用できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase (stem cell detachment solution)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>20163029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM (calcium indicator)</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free RPMI 1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (extracellular matrix )</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR (human pluripotent stem cells medium)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (surfactant polyol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho activator II</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>CN03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium DL-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE (cell-dissociation enzymes)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm Coverslips</td>
			<td>Warner</td>
			<td>CS-15R15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Camera</td>
			<td>pco</td>
			<td>1200 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scan Head</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-42LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microincubation System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>DH-40iL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minivent Mouse Ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/SCID mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast Protein Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Packs</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1704156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot System</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab198580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin C</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab137130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab47003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-175-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-095-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab91605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#946;1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ab9260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Myosin Light Chain 2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3671s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2016A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.52g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity

心筋再生の細胞療法の有効性を改善する上で重要な要因は、安全かつ効率的に細胞の生着率を高めることです。Y-27632は、Rho-関連のコイルコイル含有タンパク質キナーゼ(RhoA/ROCK)の非常に強力な阻害剤であり、解離誘発性細胞アポトーシス(アノイキス)を防ぐために使用されます。移植前にヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM+RI)に対するY-27632前処理が、急性心筋梗塞(MI)のマウスモデルにおける細胞移植率の向上をもたらすことを実証する。ここでは、Y-27632によるhiPSC-PM分化、精製、細胞前処理の完全な手順と、得られた細胞収縮、カルシウム過渡測定、マウスMIモデルへの移植について説明する。提案された方法は、細胞の生着率を大幅に増加させるシンプルで安全で効果的で低コストの方法を提供します。この方法は、細胞移植効率をさらに高めるために他の方法と組み合わせて使用するだけでなく、他の心臓疾患のメカニズムの研究のための有利な基礎を提供します。

この研究で使用されるhiPSC-PMは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を持つヒト起源に由来した。従って、生体内移植細胞の生存率は、生物発光イメージング(BLI)17(図1A、B)により検出した。組織学的心臓切片については、ヒト特異的心臓トロポニンT(hcTnT)およびヒト核抗原(HNA)二重陽性細胞を生着生hiPSC-COM(<strong class="x...

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Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

このプロトコルでは、ヒト誘導多能性幹細胞を心筋細胞の分化および精製に使用する方法をデモンストレーションし、さらに、Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤による移植効率を改善する方法について説明します。マウス心筋梗塞モデルにおける前処理。

Rhoキナーゼ活性の一過性阻害によるヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞の増着増強

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

我々のデータは、Rhoキナーゼ活性の一過性阻害が梗塞動物の心臓に移植された後のhiPSC由来心筋細胞の接着、生存、および生着を増強することを示している。傷ついた動物の心臓に移植されたhiPSC由来の心筋細胞の生着を増加させる、シンプルで低コストで高効率な方法を提供します。この技術は、急性心筋梗塞および心不全において細胞の生着速度を安全かつ効率的に改善することができるので、心臓機能、血管、およびアポトーシスの結果として生じる改善に寄与する。私たちはhiPSCでプロトコルをテストしただけですが、これらの方法は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、エトセトラなどの他のタイプの細胞に適用することができます。Y-27632治療の投与量および持続時間は重要である。この視覚的なデモンストレーションでは、プロトコルのすべての重要な手順を詳細に示すことができます。hiPSC-CM分化後21日目に、培地を吸引し、滅菌PBSで細胞を一度洗浄する。摂氏37度で1回あたり0.5ミリリットルの細胞解離酵素を5〜7分間インキュベートします。インキュベーション時間後、細胞を十分に解着させるために1ミリリットルのピペットを用いて細胞懸濁液を繰り返しピペット化する。次に、各ウェルに1ミリリットルの中和溶液を加え、15ミリリットルの遠心分離管に細胞混合物を集め、遠心分離機を200回gで3分間回収する。遠心分離後、上清を捨て、中和液中等液中の細胞を再び懸濁する。その後、ゼラチンコーティングされた6ウェルプレートに細胞を再植え付けし、ウェルあたり200万個の細胞の密度を持つ。24〜48時間後、培養培地を3〜5日間精製培地に交換する。移植前に、10マイクロモルY-27632を添加したRBプラス培地で12時間治療群の細胞を培養する。同様に、12時間の1マイクロモルのRBプラス培地中の細胞にベラパミル処理を行う。処理後、HIPSC-CMをPBSで1回洗浄し、1ウェルあたり0.5マイクロリットルの細胞解離酵素で細胞を最大2分間インキュベートします。1ミリリットルのピペットを使用して細胞懸濁液を繰り返しピペットし、細胞を完全に解化する。次に、中和溶液で細胞を中和し、15ミリリットル遠心管に細胞混合物を集め、遠心分離機を200回gで3分間回収する。遠心分離後、注射に備えて5マイクロリットル当たり0.1百万個の細胞の濃度でPBS中の細胞を再懸濁する。心筋梗塞誘導直後に、5マイクロリットルの対照hiPSC-CM、Y-27632前処理hiPSC-CM、ベラパミル処理hiPSC-CM、または各部位のマウスの心筋にPBSの等しい量を注入し、梗塞領域に1つ、梗塞周辺の領域に2つ注入する。カルシウム過渡および収縮性検出を行う12時間前に、10マイクロモルY-27632、100ナノモルRA、1マイクロモルベラパミル、または同等量のPBSをhiPSC-CMの培地に添加する。次に、培地を捨て、PBSでプレートを1回洗います。培地を、界面活性剤ポリオールの体積%あたり0.02重量を含むフェノールレッドフリーDMEMに変更し、5マイクロモルカルシウム指標、および対応するY-27632、RA、ベラパミル、またはPBSの等体積を含み、37°Cでプレートを30分間インキュベートします。インキュベーション後、上清を捨て、染色を含まないDMEMで細胞を3回洗浄し、中程度を30分間休ませてマッピング色素をエステル化解除する。セルシードのカバースリップを露天風呂室に入れ、自動温度コントローラで37°Cに平衡したマイクロインキュベーションシステムにチャンバーを挿入します。Tyrodeの溶液とそれを浸透させ、そして絶え間なくRI、RA、またはPBSを注入溶液に加える。反転蛍光顕微鏡とレーザースキャンヘッドを使用して、X-t ラインスキャンを使用して自発的なカルシウム過渡を記録します。共焦点顕微鏡の差動干渉コントラスト機能を使用してhiPSC-CMの自発的な収縮を記録します。移植した細胞の生存率は、ルシファーゼ活性の増加によって確認された。ヒト心臓トロポニンTおよびヒト核抗原発現の増加は、Y-27632前処理が細胞の生着率を有意に改善できることを示した。Y-27632前処理細胞は、より大きく、より定義された棒状の細胞骨格構造を示した。また、Y-27632前処理はTUNEL陽性細胞を減少させ、インビボでの移植されたhiPSC-CMアポトーシスの減少を示す。ウェスタンブロットは、Y-27632前処理がインテグリンβ-1およびN-カドヘリンの発現を増加させ、ホスホミオシン軽鎖2の発現を低下させ、示唆した。この変更は、Y-27632離脱後72時間で正規化された。in vitroマウスHL-1細胞取り付け実験は、Y-27632前処理がHL-1に対するhiPSC-CM付着率を有意に増加させたことを示した。Y-27632前処理は収縮力、ピークカルシウム過渡性蛍光、およびカルシウム一過性持続時間を減少させた。Y-27632前処理は、cTnIおよびcTnTの発現を有意に減少させることによって心筋細胞収縮を調節した。Y-27632と同様に、ベラパミル前処理はルシファーゼ活性およびhcTnT/HNA二重陽性細胞の数を増加させました。最も重要な工程は、10マイクロモルY-27632を添加したRb-プラス培地中で12時間の治療群の細胞を培養することです。この方法に基づいて、細胞の生着速度をさらに高めるY-27632の徐放は有望な戦略である。この技術は、研究者が生体内のCMのhiPSCの生理学と機能を研究する道を開きます。心筋細胞分化に用いられる低分子CHIR99021は危険であり、呼吸刺激を引き起こす可能性がある。何らかの方法で吸入したり吸い込んだりしないでください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

ニトロセルロース結合アッセイを用いて細菌ヒスチジンキナーゼ自己リン酸化の定量化

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Rab10リン酸化を評価してパーキンソン病関連LRRK2キナーゼ経路を尋問するためのヒト末梢血好中球分離

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

糸状菌のタップタグ付きヒストンデアセチラーゼのシングルステップエンリッチメント酵素活性アッセイのためのカビnidulans

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...