Name: enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Joseph C. WU (Stanford University) for vennlig å gi svingninger-GFP konstruere og Dr. Yanwen Liu for utmerket teknisk assistanse. Denne studien er støttet av National Institutes of Health RO1 tilskudd HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (til J.Z.), og HL121206A1 (til L.Z.), og en R56 stipend HL142627 (til W.Z.), en amerikansk hjerteforeningen forsker Development Grant 16SDG30410018, og University of Alabama i Birmingham fakultet Development Grant (til W.Z.).

Alle dyr prosedyrer i denne studien ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved University of Alabama i Birmingham og var basert på National Institutes of Health Laboratory Animal Care og bruk retningslinjer (NIH publikasjon no 85-23).
1. utarbeidelse av kultur Media og kultur plater
<ol><li>
Middels forberedelse
	<ol>
<li>For hiPSC medium, bland 400 mL av humant pluripotent stilk cellen (hPSC) basal medium (tabell av materialer 1</stron...

<ol>
	<li>Menasche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clinical+use+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors:+a+translational+experience.">Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience.</a> European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Frisch, S. M., Francis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+epithelial+cell-matrix+interactions+induces+apoptosis.">Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis.</a> Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).</li><li>Haun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+anoikis+signalling+pathway+using+the+fungal+virulence+factor+gliotoxin.">Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin.</a> Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).</li><li>Ohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase+ROCK+activates+LIM-kinase+1+by+phosphorylation+at+threonine+508+within+the+activation+loop.">Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).</li><li>Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase-dependent+contraction+of+stress+fibres+and+the+organization+of+focal+adhesions.">Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions.</a> Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).</li><li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression.">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li><li>Legate, K. R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+adaptor+binding+to+beta-integrin+cytoplasmic+tails.">Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+Inhibitor+Y-27632+Promotes+Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Survival+by+Altering+Cellular+Biomechanical+Properties.">ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties.</a> Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).</li><li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li><li>Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCND2+Overexpression+Enhances+the+Regenerative+Potency+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes:+Remuscularization+of+Injured+Ventricle.">CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle.</a> Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Single-Cell+Analysis+of+Transplanted+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+After+Acute+Myocardial+Infarction.">Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction.</a> Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+Preconditioning+Enhances+Transplantation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+in+Myocardial+Infarction+Mice.">Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice.</a> Cardiovascular Research. , (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inhibition+promotes+atypical+anoikis+in+glioma+cells.">Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e1012 (2014).</li><li>Lelievre, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+mediates+neuronal+cell+survival+through+Bim+down-regulation.">N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation.</a> PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+cell+motility+by+carbon+ion+irradiation+via+the+Rho+signaling+pathway+and+its+inhibition+by+the+ROCK+inhibitor+Y-27632+in+lung+adenocarcinoma+A549+cells.">Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells.</a> Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).</li><li>Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC-beta+exacerbates+in+vitro+brain+barrier+damage+in+hyperglycemic+settings+via+regulation+of+RhoA/Rho-kinase/MLC2+pathway.">PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).</li></ol>

De viktigste trinnene i denne studien er å skaffe ren hiPSC-CMs, forbedre aktiviteten til hiPSC-CMs gjennom Y-27632 forbehandling, og til slutt, transplantere en presis mengde hiPSC-CMs i en mus MI modell.
De viktigste spørsmålene som er omtalt her var at først, vi optimalisert glukose-fri rensing metoder19 og etablerte en roman effektiv rensing system. Systemet prosedyren inkluderte å bruke celle-dissosiasjon enzymer, nyplanting celler i gelatin-belagt plater, dyr...

Stilk cellen-basert terapeut ha vist betydelig muligheter som behandling for CARDIAC skade forårsaket av MI1. Bruken av differensiert hiPSCs gir en uuttømmelig kilde til hiPSC-CMs2 og åpner døren for den raske utviklingen av banebrytende behandlinger. Men mange begrensninger på terapeutisk oversettelse gjenstår, inkludert utfordringen med alvorlig lav engraftment rate av implantert celler.
Dissociating celler med Trypsin initierer anoikis3, som bare er akselerert når disse cellene injiseres i tøffe miljøer som iskemiske myokard, der hypoxic miljøet akselererer kursen mot celle død. Av de resterende cellene, er en stor andel vasket ut fra implantation området i blodet og spredt over hele periferien. En av de viktigste apoptotisk trasé er RhoA/ROCK Pathway4. Basert på tidligere forskning, RhoA/rock Pathway regulerer utgangen cytoskjelettkomponenter Organization5,6, som er ansvarlig for celle dysfunksjon7,8. The Rock inhibitor Y-27632 er mye brukt under somatiske og stilk cellen dissosiasjon og passaging, for å øke celle vedheft og redusere celle apoptose9,10,11. I denne studien, Y-27632 brukes til å behandle hiPSC-CMs før transplantasjon i et forsøk på å øke celle engraftment rate.
Flere metoder for å forbedre celle engraftment hastighet, slik som varme sjokk og kjeller membran matrise belegg12, er etablert. Bortsett fra disse metodene, kan genetisk teknologi også fremme cardiomyocyte spredning13 eller reversere nonmyocardial celler til cardiomyocytes14. Fra bioteknologi perspektiv, cardiomyocytes er sådd på en biomaterialet stillas for å forbedre transplantasjon effektivitet15. Dessverre, de fleste av disse metodene er kompliserte og kostbare. Tvert imot, metoden foreslås her er enkel, kostnadseffektiv og effektiv, og den kan brukes som en basal behandling før transplantasjon, så vel som i Bøyning med andre teknologier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase (stem cell detachment solution)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>20163029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM (calcium indicator)</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free RPMI 1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (extracellular matrix )</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR (human pluripotent stem cells medium)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (surfactant polyol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho activator II</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>CN03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium DL-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE (cell-dissociation enzymes)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm Coverslips</td>
			<td>Warner</td>
			<td>CS-15R15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Camera</td>
			<td>pco</td>
			<td>1200 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scan Head</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-42LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microincubation System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>DH-40iL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minivent Mouse Ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/SCID mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast Protein Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Packs</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1704156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot System</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab198580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin C</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab137130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab47003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-175-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-095-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab91605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#946;1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ab9260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Myosin Light Chain 2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3671s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2016A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.52g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity

En avgjørende faktor i å forbedre cellulær terapi effektivitet for hjerteinfarkt regenerering er å trygt og effektivt øke celle engraftment rate. Y-27632 er en svært potent hemmer av Rho-assosiert, spiral-spiral-inneholdende protein kinase (RhoA/ROCK) og brukes til å forebygge dissosiasjon celle apoptose (anoikis). Vi viser at Y-27632 forbehandling for humant indusert pluripotent stilk cellen-avledet cardiomyocytes (hiPSC-CMs+ ri) før implantation resulterer i en celle engraftment rate forbedring i en musemodell av akutt hjerteinfarkt (mi). Her beskriver vi en komplett prosedyre av hiPSC-CMs differensiering, rensing, og celle forbehandling med Y-27632, samt den resulterende celle sammentrekning, kalsium forbigående målinger, og transplantasjon i mus MI modeller. Den foreslåtte metoden gir en enkel, sikker, effektiv og rimelig metode som i betydelig grad øker celle engraftment rate. Denne metoden kan ikke bare brukes sammen med andre metoder for å ytterligere forbedre celle transplantasjon effektivitet, men gir også et gunstig grunnlag for studiet av mekanismene for andre hjertesykdommer.

Den hiPSC-CMs som brukes i denne studien ble avledet fra menneskelig opprinnelse med luciferase reporter genet; Derfor ble overlevelsesraten for de transplanterte cellene i vivo oppdaget av bioluminesens avbildning (BLI)17 (figur 1a, B). For histologiske hjertet seksjoner, menneskelig-spesifikke CARDIAC Troponin T (hcTnT) og menneskelig kjernefysisk antigen (HNA) dobbelt-positive celler ble klassifisert som engrafted h...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity at JoVE.com

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

I denne protokollen, viser vi og utdype hvordan du bruker humant indusert Pluripotent stamceller for cardiomyocyte differensiering og rensing, og videre, om hvordan å forbedre sin transplantasjon effektivitet med Rho-assosiert protein kinase inhibitor forbehandling i en mus hjerteinfarkt modell.

Styrking av engraftment av humant indusert pluripotent Stem Cell-avledet Cardiomyocytes via en forbigående hemming av Rho kinase aktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Våre data viser at forbigående hemming av Rho-kinase aktivitet forbedrer vedheft, overlevelse og engraftment av hiPSC-avledede kardiomyocytter etter å ha blitt transplantert inn i de ufarcted dyrehjerter. Vi tilbyr en enkel, rimelig, mens svært effektiv metode for å øke engraftment av transplanterte hiPSC-avledede kardiomyocytter i de skadede dyrehjertene. Da denne teknikken kan forbedre celleverdifrekvensen trygt og effektivt ved akutt hjerteinfeksjon og hjertesvikt, bidrar det til de resulterende forbedringene i hjertefunksjon, vaskulariteter og apoptose.Selv om vi bare testet protokollene våre i hiPSCer, kan disse metodene brukes på andre typer celler, for eksempel embryonale stamceller, mesenchymale stamceller, et cetera. Dosen og varigheten av behandling med Y-27632 er kritisk. Den visuelle demonstrasjonen kan i stor detalj demonstrere alle viktige trinn i protokollen, noe som er gunstig for noen som aldri har utført denne teknikken før.På dag 21 etter hiPSC-CM differensiering, aspirer mediet og vask cellene med steril PBS en gang. Inkuber cellene med 0,5 milliliter celledissosiasjonsenzymer per brønn ved 37 grader Celsius i fem til syv minutter. Etter inkubasjonstiden pipettes cellen gjentatte ganger ved hjelp av en en milliliter pipette for å fjerne cellene grundig.Deretter legger du til en milliliter nøytraliserende løsning på hver brønn, samler celleblandingen i et 15-milliliter sentrifugerør og sentrifuge ved 200 ganger g i tre minutter. Etter sentrifugeringen, kast de overnaturante og gjenoppuspend cellene i nøytraliserende løsning. Deretter plante cellene på gelatinbelagte, seksbrønnsplater med en tetthet på to millioner celler per brønn.Etter 24 til 48 timer erstatter du kulturmediet med rensemediet i tre til fem dager. Før transplantasjon, kultur cellene i behandlingsgruppen i 12 timer i RB-pluss medium supplert med 10-mikromolar Y-27632. På samme måte utfører verapamilbehandling på cellene i RB-pluss-mediet med en mikromol verapamil i 12 timer.Etter behandlingen vasker du hiPSC-CMs med PBS en gang, og inkubere cellene med 0,5 mikroliter celledissosiasjonsenzymer per brønn i maksimalt to minutter. Pipette cellefjæringen gjentatte ganger ved hjelp av en en milliliter pipette for å ta i bruk cellene grundig. Deretter nøytraliserer cellene med nøytraliserende løsning, samler celleblandingen i et 15-milliliter sentrifugerør og sentrifuge ved 200 ganger g i tre minutter.Etter sentrifugering, resuspend cellene i PBS i en konsentrasjon på 0,1 millioner celler per fem mikroliter som forberedelse til injeksjon. Umiddelbart etter hjerteinfarkt induksjon, injisere fem mikroliter kontroll hiPSC-CMs, Y-27632-forbehandlet hiPSC-CMs, verapamil-behandlet hiPSC-CMs, eller et likt volum av PBS inn i musens myokardi på hvert sted, en i det infarct området og to i områdene rundt infarkt. 12 timer før du utfører kalsiumtransient og kontraktilitetsdeteksjon, tilsett 10-mikromolar Y-27632, 100-nanomolar RA, en mikromolar verapamil eller et likt volum PBS i kulturmediet til hiPSC-CMs.Deretter kaster du mediet og vasker platen med PBS én gang. Endre mediet til en fenol rødfri DMEM som inneholder 0,02 vekt per volum prosent av overflateaktivt polyol, fem mikromolar kalsiumindikator, og tilsvarende Y-27632, RA, verapamil, eller et likt volum av PBS, og inkubere platen på 37 grader Celsius i 30 minutter. Etter inkubasjonen, kast supernatanten, vask cellene med det fargefrie DMEM tre ganger, og la mediet hvile i 30 minutter for å avesterifisere kartleggingsfargestoffet.Plasser celleseedede dekkslipp i et åpent badekammer, og sett kammeret inn i et mikroinkubasjonssystem likevektet til 37 grader Celsius med en automatisk temperaturregulator. Perfuse det med Tyrodes løsning, og kontinuerlig legge RI, RA, eller PBS til perfusjonsløsningen. Bruk et invertert fluorescensmikroskop og et laserskanningshode for å registrere spontan kalsiumtransient ved å bruke en x-t-linjeskanning.Registrer spontan sammentrekning av hiPSC-CMs ved hjelp av differensial interferenskontrastfunksjonaliteten til det konfokale mikroskopet. Overlevelsesraten til de transplanterte cellene ble bekreftet av økt luciferaseaktivitet. Den økte humane hjertetroponin T og humant kjernefysisk antigenuttrykk viste at Y-27632-forbehandling kunne forbedre celleverdien betydelig.Y-27632 forbehandlede celler viste en større og mer definert stangformet cytoskeletal struktur. Også, Y-27632 forbehandling redusert TUNEL-positive celler, noe som indikerer redusert transplantert hiPSC-CM apoptose in vivo. Western blot antydet at Y-27632 forbehandling økt uttrykk for integrin beta-1 og N-kadherin og redusert uttrykk for fosfo-myosin lys kjede 2.Denne endringen ble normalisert 72 timer etter Y-27632 tilbaketrekking. In vitro mus HL-1 celle vedlegg eksperimenter indikerte at Y-27632 forbehandling betydelig økt hiPSC-CM etterlevelse i forhold til HL-1. Y-27632 forbehandling reduserte kontraktil kraft, toppen kalsium forbigående fluorescens, og kalsium forbigående varighet.Y-27632 forbehandling regulert kardiomyocytt sammentrekning ved å redusere uttrykket for cTnI og cTnT betydelig. I likhet med Y-27632 økte verapamil-forbehandlingen luciferaseaktiviteten og antall hcTnT/HNA dobbeltpositive celler. Det viktigste trinnet er å kulturceller i behandlingsgruppen i 12 timer i Rb-pluss medium supplert med 10-mikromos Y-27632.Basert på denne metoden, langsom utgivelse av Y-27632 å ytterligere øke celle engraftment rate er en lovende strategi. Denne teknikken baner vei for forskere å studere fysiologi og funksjon av hiPSC av CMs in vivo. Det lille molekylet CHIR99021 som brukes til kardiomyocytter differensiering er farlig, noe som kan forårsake åndedrettsirritasjon.Vennligst ikke innsug eller inhaler på noen måte.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifisering av bakteriell histidin kinase Autofosforylering Ved hjelp av en Nitrocellulose bindingsanalyse

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analysering av proteinkinaseaktivitet med radiomerket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikasjon av Cyclin-avhengige Kinase 1 bestemt fosforylering områder av en In Vitro Kinase analysen

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rensing og kinetisk analyse via oksygen elektrode for å studere DesB Dioxygenase aktivitet og hemming

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Humanperifert blod nøytrofil isolasjon for å forhøre Parkinsons tilknyttede LRRK2 Kinase Pathway ved å vurdere Rab10 fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifikasjon av romanen CK2 Kinase underlag med en allsidig biokjemiske tilnærming

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studere RNA interaktører av Protein Kinase RNA-aktivert under pattedyr cellen syklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step berikelse av en TAP-Tagged Histone deacetylase av trådformede sopp Aspergillus nidulans for enzymatisk aktivitet analysen

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på Molecular Level bruker robust biokjemiske tilnærminger av en ny kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase inhibitor screening i selv-monterte Human protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...