Name: enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00
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Os autores agradecem ao Dr. Joseph C. Wu (Universidade de Stanford) por gentilmente fornecer o constructo Fluc-GFP e o Dr. Yanwen Liu para uma excelente assistência técnica. Este estudo é apoiado pelos institutos nacionais de saúde RO1 concede HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (a J.Z.), e HL121206A1 (a L.Z.), e um R56 conceder HL142627 (a W.Z.), uma associação americana de desenvolvimento do cientista do coração Grant 16SDG30410018, e a Universidade de Alabama na concessão do desenvolvimento da faculdade de Birmingham (a W.Z.).

Todos os procedimentos animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade do Alabama em Birmingham e foram baseados nos institutos nacionais de saúde laboratório de cuidados com os animais e diretrizes de uso (NIH publicação não 85-23).
1. preparação de meios de cultura e placas de cultura
<ol><li>
Preparação média
	<ol>
<li>Para o meio hiPSC, misture 400 mL de meio basal de células-tronco pluripote...

<ol>
	<li>Menasche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clinical+use+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors:+a+translational+experience.">Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience.</a> European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Frisch, S. M., Francis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+epithelial+cell-matrix+interactions+induces+apoptosis.">Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis.</a> Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).</li><li>Haun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+anoikis+signalling+pathway+using+the+fungal+virulence+factor+gliotoxin.">Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin.</a> Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).</li><li>Ohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase+ROCK+activates+LIM-kinase+1+by+phosphorylation+at+threonine+508+within+the+activation+loop.">Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).</li><li>Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase-dependent+contraction+of+stress+fibres+and+the+organization+of+focal+adhesions.">Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions.</a> Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).</li><li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression.">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li><li>Legate, K. R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+adaptor+binding+to+beta-integrin+cytoplasmic+tails.">Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+Inhibitor+Y-27632+Promotes+Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Survival+by+Altering+Cellular+Biomechanical+Properties.">ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties.</a> Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).</li><li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li><li>Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCND2+Overexpression+Enhances+the+Regenerative+Potency+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes:+Remuscularization+of+Injured+Ventricle.">CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle.</a> Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Single-Cell+Analysis+of+Transplanted+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+After+Acute+Myocardial+Infarction.">Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction.</a> Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+Preconditioning+Enhances+Transplantation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+in+Myocardial+Infarction+Mice.">Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice.</a> Cardiovascular Research. , (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inhibition+promotes+atypical+anoikis+in+glioma+cells.">Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e1012 (2014).</li><li>Lelievre, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+mediates+neuronal+cell+survival+through+Bim+down-regulation.">N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation.</a> PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+cell+motility+by+carbon+ion+irradiation+via+the+Rho+signaling+pathway+and+its+inhibition+by+the+ROCK+inhibitor+Y-27632+in+lung+adenocarcinoma+A549+cells.">Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells.</a> Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).</li><li>Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC-beta+exacerbates+in+vitro+brain+barrier+damage+in+hyperglycemic+settings+via+regulation+of+RhoA/Rho-kinase/MLC2+pathway.">PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).</li></ol>

Os principais passos deste estudo incluem a obtenção de Hisc-CMs puro, melhorando a atividade do hiPSC-CMs através do pré-tratamento Y-27632 e, finalmente, transplantar uma quantidade exata de hiPSC-CMs em um modelo de MI do mouse.
As principais questões abordadas aqui foram que, primeiro, otimizamos os métodos de purificação sem glicose19 e estabelecemos um novo sistema de purificação eficiente. O procedimento de sistema incluiu a aplicação de enzimas de di...

As terapias baseadas em células-tronco mostraram um potencial considerável como um tratamento para danos cardíacos causados pelo MI1. O uso de hiPSCs diferenciados fornece uma fonte inesgotável de hiPSC-CMs2 e abre a porta para o rápido desenvolvimento de tratamentos inovadores. Entretanto, muitas limitações à tradução terapêutica permanecem, incluindo o desafio da taxa severamente baixa do Engraftment de pilhas implantadas.
Dissociar células com tripsina inicia anoikis3, que só é acelerado uma vez que estas células são injetadas em ambientes agressivos como o miocárdio isquêmico, onde o ambiente hipóxico acelera o curso em direção à morte celular. Das células remanescentes, uma grande proporção é lavada do local de implantação para a corrente sanguínea e se espalhou por toda a periferia. Uma das principais vias apoptóticas é a via RhoA/ROCK4. Com base em pesquisas anteriores, a via Rhoa/rock regula a organização citoesquelética actina5,6, que é responsável pela disfunção celular7,8. O inibidor da rocha Y-27632 é amplamente utilizado durante a dissociação e passaging de células estéticas e somáticas, para aumentar a adesão celular e reduzir a apoptose celular9,10,11. Neste estudo, o Y-27632 é usado para tratar o hiPSC-CMs antes da transplantação na tentativa de aumentar a taxa do Engraftment da pilha.
Vários métodos destinados a melhorar a taxa de Engraftment celular, tais como choque térmico e revestimento da matriz de membrana basal12, foram estabelecidas. Além desses métodos, a tecnologia genética também pode promover a proliferação de cardiomiócitos13 ou células não miocárdicas reversas em cardiomiócitos14. Do ponto de vista da bioengenharia, os cardiomiócitos são semeados em um andaime biomaterial para melhorar a eficiência do transplante15. Infelizmente, a maioria destes métodos são complicados e dispendiosos. Pelo contrário, o método proposto aqui é simples, econômico e efetivo, podendo ser utilizado como tratamento basal antes do transplante, bem como na conjugação com outras tecnologias.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase (stem cell detachment solution)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>20163029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM (calcium indicator)</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free RPMI 1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (extracellular matrix )</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR (human pluripotent stem cells medium)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (surfactant polyol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho activator II</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>CN03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium DL-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE (cell-dissociation enzymes)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm Coverslips</td>
			<td>Warner</td>
			<td>CS-15R15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Camera</td>
			<td>pco</td>
			<td>1200 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scan Head</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-42LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microincubation System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>DH-40iL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minivent Mouse Ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/SCID mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast Protein Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Packs</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1704156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot System</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab198580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin C</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab137130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab47003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-175-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-095-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab91605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#946;1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ab9260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Myosin Light Chain 2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3671s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2016A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.52g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity

Um fator crucial na melhoria da eficácia da terapia celular para a regeneração miocárdica é de forma segura e eficiente aumentar a taxa de Engraftment celular. Y-27632 é um inibidor altamente potente da proteína quinase (RhoA/ROCK) associada a Rho, coiled-coil, e é usada para prevenir a apoptose celular induzida por dissociação (anoikis). Nós demonstramos que o pré-tratamento de Y-27632 para os cardiomiócitos pluripotentes induzidos humanos da pilha de haste (hiPSC-CMs+ ri) antes da implantação conduz a uma melhoria da taxa do Engraftment da pilha em um modelo do rato do infarction miocárdico agudo (MI). Aqui, nós descrevemos um procedimento completo da diferenciação, da purificação, e do pré-tratamento da pilha do hiPSC-CMs com Y-27632, assim como a contração resultante da pilha, as medidas transientes do cálcio, e a transplantação em modelos do rato MI. O método proposto fornece um método simples, seguro, eficaz e de baixo custo que aumenta significativamente a taxa de Engraftment celular. Este método não pode somente ser usado conjuntamente com outros métodos para realçar mais a eficiência da transplantação da pilha mas igualmente fornece uma base favorável para o estudo dos mecanismos de outras doenças cardíacas.

O hiPSC-CMs usado neste estudo foi derivado da origem humana com o gene do repórter do luciferase; Conseqüentemente, a taxa de sobrevivência das pilhas transplantadas in vivo foi detectada pela imagem latente do bioluminescência (bli)17 (Figura 1a, B). Para as seções histológicas do coração, a troponina cardíaca humana-específica T (hctnt) e o antígeno nuclear humano (HNA) pilhas dobro-positivas foram class...

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Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Neste protocolo, podemos demonstrar e elaborar sobre como usar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para diferenciação e purificação de cardiomiócitos, e ainda, sobre como melhorar sua eficiência de transplante com inibidor de proteína quinase associada a Rho pré-tratamento em um modelo de infarto do miocárdio do camundongo.

Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Nossos dados demonstram que a inibição transitória da atividade rho-quinase aumenta a adesão, sobrevivência e engrafamento de cardiomiócitos derivados do hiPSC após serem transplantados nos corações animais infartados. Fornecemos um método simples, de baixo custo, enquanto altamente eficiente para aumentar o enxerto de cardiomiócitos transplantados derivados de hiPSC nos corações animais feridos. Como essa técnica pode melhorar as taxas de enxercimento celular de forma segura e eficiente em infarto cardíaco agudo e insuficiência cardíaca, contribui para as melhorias resultantes na função cardíaca, vasculares e apoptose.Embora só tenhamos testado nossos protocolos em hiPSCs, esses métodos podem ser aplicados a outros tipos de células, como células-tronco embrionárias, células-tronco mesenquimais, etc. A dose e duração do tratamento Y-27632 é crítica. A demonstração visual pode demonstrar em grande detalhe todos os passos-chave do protocolo, o que é benéfico para alguém que nunca realizou essa técnica antes.No dia 21, após a diferenciação hiPSC-CM, aspire o meio e lave as células com PBS estéril uma vez. Incubar as células com 0,5 mililitros de enzimas de dissociação celular por poço a 37 graus Celsius por cinco a sete minutos. Após o tempo de incubação, pipeta repetidamente a suspensão celular usando uma pipeta de um mililitro, a fim de dissociar completamente as células.Em seguida, adicione um mililitro de solução neutralizante a cada poço, colete a mistura celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes g por três minutos. Após a centrifugação, descarte o supernasce e resuspenque as células na solução neutralizante. Em seguida, replante as células em placas revestidas de gelatina, seis poços a uma densidade de dois milhões de células por poço.Após 24 a 48 horas, substitua o meio de cultura pelo meio de purificação por três a cinco dias. Antes do transplante, cultura as células do grupo de tratamento por 12 horas em RB-plus médio suplementado com 10-micromolar Y-27632. Da mesma forma, realize o tratamento verapamil nas células do meio RB-plus com um micromole de verapamil por 12 horas.Após o tratamento, lave os hiPSC-CMs com PBS uma vez, e incuba as células com 0,5 microliters de enzimas de dissociação celular por poço por um máximo de dois minutos. Pipeta repetidamente a suspensão celular usando uma pipeta de um mililitro para dissociar completamente as células. Em seguida, neutralizar as células com solução neutralizante, coletar a mistura celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífugas a 200 vezes g por três minutos.Após a centrifugação, resuspengue as células em PBS a uma concentração de 0,1 milhão de células por cinco microliters em preparação para a injeção. Imediatamente após a indução do infarto do miocárdio, injete cinco microliters de controle hiPSC-CMs, Y-27632-pré-tratado hiPSC-CMs, hiPSC-CMs tratados com verapamil, ou um volume igual de PBS no miocárdio do camundongo em cada local, um na área de infarto e dois nas áreas ao redor do infarto. 12 horas antes de realizar a detecção transitória e contralute de cálcio, adicione 10 micromolar Y-27632, 100-nanomolar RA, verapamil de um micromolar, ou um volume igual de PBS no meio de cultura de hiPSC-CMs.Em seguida, descarte o meio e lave a placa com PBS uma vez. Altere o DMEM médio para um DMEM sem fenol contendo 0,02 peso por volume por cento do políil surfactante, indicador de cálcio de cinco micromolares e o Y-27632 correspondente, RA, verapamil, ou um volume igual de PBS, e incubar a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, descarte o supernasce, lave as células com o DMEM sem corante três vezes e deixe o meio descansar por 30 minutos para desesmagizar o corante de mapeamento.Coloque o deslizamento de cobertura semeado por células em uma câmara de banho aberta e insira a câmara em um sistema de microincubstura equilibrado a 37 graus Celsius com um controlador de temperatura automático. Perfumá-lo com a solução de Tyrode e adicione continuamente RI, RA ou PBS à solução de perfusão. Use um microscópio de fluorescência invertida e uma cabeça de varredura a laser para registrar um transitório de cálcio espontâneo, empregando uma varredura de linha X-T.Regissocular a contração espontânea de hiPSC-CMs utilizando a funcionalidade de contraste de interferência diferencial do microscópio confocal. A taxa de sobrevivência das células transplantadas foi confirmada pelo aumento da atividade da luciferase. O aumento da troponina cardíaca t e a expressão do antígeno nuclear humano mostraram que o pré-tratamento Y-27632 poderia melhorar significativamente a taxa de enxercimento celular.As células pré-tratadas Y-27632 apresentaram uma estrutura citoesquelélada maior e mais definida em forma de vara. Além disso, o pré-tratamento Y-27632 diminuiu as células tunel-positivas, indicando a redução da apoptose hiPSC-CM transplantada in vivo. A mancha ocidental sugeriu que o pré-tratamento Y-27632 aumentou a expressão de beta-1 e N-cadherin integrin e diminuiu a expressão da cadeia de luz fosfo-miosina 2.Essa mudança foi normalizada 72 horas após a retirada do Y-27632. Experimentos in vitro de fixação de células HL-1 indicaram que o pré-tratamento Y-27632 aumentou significativamente a adesão do hiPSC-CM em relação ao HL-1. O pré-tratamento Y-27632 reduziu a força contratil, o pico da fluorescência transitória do cálcio e a duração transitória do cálcio.Y-27632 pré-tratamento regulado contração de cardiomiócitos reduzindo significativamente a expressão de 2008 e cTnT. Semelhante ao Y-27632, o pré-tratamento verapamil aumentou a atividade da luciferase e o número de células hcTnT/HNA duplamente positivas. O passo mais importante é cultivar as células do grupo de tratamento por 12 horas em rb-plus médio suplementado com 10-micromolar Y-27632.Com base neste método, a liberação lenta do Y-27632 para aumentar ainda mais a taxa de enxerximento celular é uma estratégia promissora. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores estudarem a fisiologia e a função do hiPSC dos CMs in vivo. A pequena molécula CHIR99021 usada para diferenciação de cardiomiócitos é perigosa, o que pode causar irritação respiratória.Por favor, não ingestão ou inalar de forma alguma.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Quantificação dos Quinase bacteriana Histidina Autofosforilação utilizando um ensaio de ligação de nitrocelulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Bioquímica

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purificação de proteínas anaeróbica e análise cinética através do eletrodo de oxigênio para estudar a inibição e atividade dioxigenase DesB

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano para interrogar o Caminho Associado lRRK2 Kinase de Parkinson avaliando rab10 fosforilação

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identificação de substratos de quinase CK2 novela usando uma abordagem bioquímica versátil

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Estudando o RNA interactianos de proteína quinase RNA-ativado durante o ciclo celular dos mamíferos

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Enriquecimento de uma única etapa de um histone TAP-Tagged deacetilase do fungo filamentoso Aspergillus nidulans para o ensaio de atividade enzimática

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Triagem de inibidores da quinase em Microarrays de proteínas humanas Automontados

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...