Name: enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity at JoVE.com

Авторы благодарят д-ра Джозефа К. Ву (Стэнфордский университет) за любезное предоставление конструкции Fluc-GFP и д-ра Янвена Лю за отличную техническую помощь. Это исследование поддерживается Национальными институтами здравоохранения RO1 грантов HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (до J. З.), и HL121206A1 (в Л.З.), и R56 грант 16SDG30410018, и Университет Алабамы в Бирмингеме факультета развития Грант (до В.З.).

Все процедуры для животных в этом исследовании были одобрены Институциональным Комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Алабамы в Бирмингеме и были основаны на Национальных институтах здравоохранения лабораторных животных уход и использование Руководящих п...

<ol>
	<li>Menasche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clinical+use+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors:+a+translational+experience.">Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience.</a> European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Frisch, S. M., Francis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+epithelial+cell-matrix+interactions+induces+apoptosis.">Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis.</a> Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).</li><li>Haun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+anoikis+signalling+pathway+using+the+fungal+virulence+factor+gliotoxin.">Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin.</a> Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).</li><li>Ohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase+ROCK+activates+LIM-kinase+1+by+phosphorylation+at+threonine+508+within+the+activation+loop.">Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).</li><li>Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase-dependent+contraction+of+stress+fibres+and+the+organization+of+focal+adhesions.">Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions.</a> Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).</li><li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression.">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li><li>Legate, K. R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+adaptor+binding+to+beta-integrin+cytoplasmic+tails.">Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+Inhibitor+Y-27632+Promotes+Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Survival+by+Altering+Cellular+Biomechanical+Properties.">ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties.</a> Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).</li><li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li><li>Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCND2+Overexpression+Enhances+the+Regenerative+Potency+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes:+Remuscularization+of+Injured+Ventricle.">CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle.</a> Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Single-Cell+Analysis+of+Transplanted+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+After+Acute+Myocardial+Infarction.">Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction.</a> Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+Preconditioning+Enhances+Transplantation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+in+Myocardial+Infarction+Mice.">Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice.</a> Cardiovascular Research. , (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inhibition+promotes+atypical+anoikis+in+glioma+cells.">Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e1012 (2014).</li><li>Lelievre, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+mediates+neuronal+cell+survival+through+Bim+down-regulation.">N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation.</a> PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+cell+motility+by+carbon+ion+irradiation+via+the+Rho+signaling+pathway+and+its+inhibition+by+the+ROCK+inhibitor+Y-27632+in+lung+adenocarcinoma+A549+cells.">Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells.</a> Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).</li><li>Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC-beta+exacerbates+in+vitro+brain+barrier+damage+in+hyperglycemic+settings+via+regulation+of+RhoA/Rho-kinase/MLC2+pathway.">PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).</li></ol>

Ключевыми шагами этого исследования являются получение чистого hiPSC-CMs, повышение активности hiPSC-CMs через предварительное лечение Y-27632 и, наконец, пересадка точного количества hiPSC-CMs в модель мыши MI.
Ключевые вопросы, которые были рассмотрены здесь, были в том, что, во-первых, ...

Стволовые клетки на основе терапии показали значительный потенциал в качестве лечения сердечного повреждения, вызванного MI1. Использование дифференцированных HIPSCs обеспечивает неисчерпаемый источник hiPSC-CMs2 и открывает двери для быстрого развития прорыв лечения. Тем не менее, многие ограничения на терапевтический перевод остаются, в том числе проблема сильно низкой скорости прививок имплантированных клеток.
Диссоциирующая клетка с трипсином инициирует anoikis3, который только ускоряется, как только эти клетки вводят сявок в суровые среды, такие как ишемический миокард, где гипоксическая среда ускоряет курс к смерти клеток. Из оставшихся клеток значительная часть вымывается из места имплантации в кровоток и распространяется по всей периферии. Одним из ключевых апоптотических путей является путьRhoA/ROCK 4. Основываясь на предыдущих исследованиях, RhoA / ROCK путь регулирует актина цитоскелетной организации5,6, который отвечает за дисфункцию клеток7,8. Ингибитор ROCK Y-27632 широко используется при соматической и стволовой клетке диссоциации и прохода, чтобы увеличить слипания клеток и уменьшить апоптоз клеток9,10,11. В этом исследовании, Y-27632 используется для лечения hiPSC-CMs до трансплантации в попытке увеличить скорость прививования клеток.
Было установлено несколько методов, направленных на улучшение скорости прививок клеток, таких как тепловой шок и мембранное матримальное покрытие подвала12. Помимо этих методов, генетические технологии могут также способствовать пролиферации кардиомиоцитов13 или обратить вспять немиокардиальные клетки в кардиомиоциты14. С точки зрения биоинженерии, кардиомиоциты посеяны на биоматериал эшафот для повышения эффективности трансплантации15. К сожалению, большинство из этих методов являются сложными и дорогостоящими. Напротив, предложенный здесь метод прост, экономичен и эффективен, и его можно использовать как базальное лечение до трансплантации, так и в спряжении с другими технологиями.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase (stem cell detachment solution)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>20163029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM (calcium indicator)</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free RPMI 1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (extracellular matrix )</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR (human pluripotent stem cells medium)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (surfactant polyol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho activator II</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>CN03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium DL-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE (cell-dissociation enzymes)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm Coverslips</td>
			<td>Warner</td>
			<td>CS-15R15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Camera</td>
			<td>pco</td>
			<td>1200 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scan Head</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-42LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microincubation System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>DH-40iL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minivent Mouse Ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/SCID mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast Protein Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Packs</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1704156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot System</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab198580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin C</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab137130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab47003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-175-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-095-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab91605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#946;1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ab9260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Myosin Light Chain 2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3671s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2016A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.52g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity

Решающим фактором в повышении эффективности клеточной терапии для регенерации миокарда является безопасное и эффективное увеличение скорости прививок клеток. Y-27632 является очень мощным ингибитором Rho-связанных, скручивания,содержащих белок киназы (RhoA/ ROCK) и используется для предотвращения диссоциации индуцированной клеточной апоптозы (anoikis). Мы демонстрируем, что Y-27632 предлечения для человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMsЗРИ) до имплантации приводит к улучшению скорости клеток при в мышиной модели острого инфаркта миокарда (MI). Здесь мы описываем полную процедуру дифференциации hiPSC-CMs, очищения и клеточной предобработки с помощью Y-27632, а также результирующее сокращение клеток, временные измерения кальция и трансплантацию в мышиные модели MI. Предлагаемый метод обеспечивает простой, безопасный, эффективный и недорогой метод, который значительно увеличивает скорость прививок клеток. Этот метод не может быть использован только в сочетании с другими методами для дальнейшего повышения эффективности трансплантации клеток, но и обеспечивает благоприятную основу для изучения механизмов других сердечных заболеваний.

HIPSC-CMs, используемые в этом исследовании, были получены из человеческого происхождения с геном репортера люциферазы; Таким образом, выживаемость пересаженных клеток in vivo была обнаружена с помощью биолюминесценционной визуализации (BLI)17 (рисуно?...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity at JoVE.com

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

В этом протоколе мы демонстрируем и подробно о том, как использовать искусственные плюрипотентные стволовые клетки человека для диффериоцитной дифференциации и очистки, и далее, о том, как улучшить его эффективность трансплантации с ингибитором родо-синазы, связанных с Ро-ассоциированным предварительной обработки в модели инфаркта миокарда мыши.

Улучшение прививки человека индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных кардиомиоцитов через переходный ингибирование Деятельности Ро Киназы

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Наши данные показывают, что переходное ингибирование активности родианазы усиливает адгезию, выживание и приписку кардиомиоцитов, полученных хиПСК, после пересадки в сердца животных. Мы предоставляем простой, недорогой, в то время как высокоэффективный метод для увеличения engraftment пересаженных hiPSC полученных кардиомиоцитов в сердцах раненых животных. Поскольку этот метод может улучшить показатели результации клеток безопасно и эффективно при остром инфаркте сердца и сердечной недостаточности, он способствует улучшению сердечной функции, сосудистости и апоптоза.Хотя мы тестировали наши протоколы только в hiPSCs, эти методы могут быть применены к другим типам клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, и так далее. Доза и продолжительность лечения Y-27632 имеет решающее значение. Визуальная демонстрация может очень подробно продемонстрировать все ключевые шаги в протоколе, что выгодно для тех, кто никогда не выполнял эту технику раньше.На 21 день после дифференциации hiPSC-CM, аспирировать средний и мыть клетки стерильными PBS один раз. Инкубировать клетки с 0,5 миллилитров клеточной диссоциации ферментов на колодец при 37 градусов по Цельсию в течение пяти-семи минут. После инкубации время, неоднократно pipette клеточной подвески с помощью одного миллилитров пипетки для того, чтобы тщательно разобщить клетки.Затем добавьте по миллилитр нейтрализующий раствор в каждую колодец, соберите клеточную смесь в 15-миллилитровую центрифугу и центрифугу по 200 раз г в течение трех минут. После центрифугации отбросьте супернатант и повторно помекуйте клетки в нейтрализующий раствор. Затем пересаживаем клетки на пластины с покрытием желатина с шестью колодецами при плотности в два миллиона клеток на колодец.Через 24-48 часов замените культурную среду средой очистки на три-пять дней. До трансплантации, культура клеток в группе лечения в течение 12 часов в РБ-плюс среды дополняется 10-микромоляной Y-27632. Аналогичным образом, выполнять верапамил лечения на клетках в РБ-плюс среды с одним микромоле верапамила в течение 12 часов.После лечения, мыть hiPSC-CMs с PBS один раз, и инкубировать клетки с 0,5 микролитров клеточной диссоциации ферментов на хорошо в течение максимум двух минут. Неоднократно пипетка клеточной подвески с помощью одноми миллилитров пипетки тщательно разобщить клетки. Затем нейтрализуем клетки с нейтрализуя раствором, соберите клеточную смесь в 15-миллилитровую центрифугу и центрифугу по 200 раз г в течение трех минут.После центрифугации, повторное использование клеток в PBS в концентрации 0,1 миллиона клеток на пять микролитров в рамках подготовки к инъекции. Сразу же после индукции инфаркта миокарда ввишите пять микролитров контроля hiPSC-CMs, Y-27632-pretreated hiPSC-CMs, verapamil-обработанные hiPSC-CMs, или равное количество PBS в миокарда мыши на каждом месте, один в области инфаркта и два в области вокруг infar. За 12 часов до выполнения кальция переходных и обнаружения контрактоемости, добавить 10-микромолярной Y-27632, 100-наномолярный РА, один микромолярный верапамил, или равный объем PBS в культуре среды hiPSC-CMs.Затем отбросьте среду, и мыть пластину с PBS один раз. Измените среду на фенол красный без DMEM, содержащий 0,02 веса на объем процента сурфактанта полиола, пятимимолярный индикатор кальция, и соответствующие Y-27632, RA, verapamil, или равного объема PBS, и инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. После инкубации, отбросить супернатант, мыть клетки с красителем, свободной DMEM три раза, и пусть средний отдых в течение 30 минут, чтобы де-эстерифицировать отображение красителя.Поместите крышку с семенами клеток в открытую камеру ванны и вставьте камеру в систему микроинцуаровок, уравновешенную до 37 градусов по Цельсию с помощью автоматического контроллера температуры. Использовать его с раствором Tyrode, и постоянно добавлять RI, RA, или PBS в раствор перфузии. Используйте перевернутый флуоресцентный микроскоп и лазерное сканирование головы для записи спонтанного преходящем кальция с помощью сканирования линии x-t.Запись спонтанного сокращения hiPSC-CMs с использованием дифференциального интерференционного контраста функциональности конфокального микроскопа. Выживаемость пересаженных клеток была подтверждена повышенной активностью люциферазы. Увеличение человеческого сердечного тропонина Т и человеческого ядерного антигена выражение показало, что Y-27632 предварительной обработки может значительно улучшить скорость клетки engraftment.Предварительно обработаемые клетки Y-27632 продемонстрировали большую и более определенную цитоскелетную структуру в форме стержня. Кроме того, Y-27632 предварительной обработки снижение TUNEL-положительных клеток, что свидетельствует о снижении пересаженных hiPSC-CM апоптоз in vivo. Западная помарка предложила что pretreatment Y-27632 увеличило выражение интегрина бета-1 и N-кадерина и уменьшило выражение цепи света фосфо-миозин 2.Это изменение было нормализовано через 72 часа после вывода Y-27632. Эксперименты по вложению клеток in vitro HL-1 показали, что предварительная обработка Y-27632 значительно увеличила соблюдение hiPSC-CM по сравнению с HL-1. Предварительное лечение Y-27632 уменьшило контрактилинную силу, пик преходящей флуоресценции кальция и преходящую продолжительность кальция.Y-27632 предлечение регулируется сокращением кардиомиоцитов за счет значительного снижения экспрессии cTnI и cTnT. Как и Y-27632, предлечение верапамилов увеличило активность люциферазы и количество двойных положительных клеток HCTnT/HNA. Наиболее важным шагом является культура клеток в группе лечения в течение 12 часов в Rb-плюс среды дополняется 10-микромолейной Y-27632.Основываясь на этом методе, медленное высвобождение Y-27632 для дальнейшего увеличения скорости ферментации клеток является перспективной стратегией. Этот метод прокладывает путь для исследователей для изучения физиологии и функции hiPSC CMs in vivo. Небольшая молекула CHIR99021, используемая для дифференциации кардиомиоцитов, опасна, что может вызвать раздражение дыхательных путей.Пожалуйста, не потребления или вдыхать каким-либо образом.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Анализ активности протеинкиназы с радиоактивно меченым АТФ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Идентификация Циклин зависимая киназа 1 сайты конкретных фосфорилирование киназы в Vitro пробирного

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Очищение протеина анаэробных и кинетический анализ через электрод кислорода для изучения DesB Dioxygenase деятельность и ингибирование

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Человеческая периферическая кровь Нейтрофилов Изоляция для допроса Паркинсона Связанные LRRK2 Киназы Путь путем оценки Rab10 фосфорилирования

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Идентификация Роман CK2 киназы субстратов, используя универсальный подход биохимические

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Изучая РНК посредники РНК активирована во время цикла Mammalian клетки киназы протеина

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Одноэтапное обогащение крана-тегами Гистоун Деацетилаза из нитчатых грибков Аспергилласа niдулаанс для ферментативной активности анализа

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Характеристика на молекулярном уровне с использованием надежных биохимических подходов нового белка киназы

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Скрининг ингибиктора Киназы в самособранных микроарах человеческого белка

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...