Name: enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity at JoVE.com

Författarna tackar Dr Joseph C. Wu (Stanford University) för vänligt tillhandahållande av Fluc-GFP konstruera och Dr Yanwen LiU för utmärkt tekniskt bistånd. Denna studie stöds av National Institutes of Health RO1 Grants HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (till J.Z.), och HL121206A1 (till L.Z.), och en R56 Grant HL142627 (till W.Z.), en amerikansk hjärt förening vetenskapsman Development Grant 16SDG30410018, och University of Alabama vid Birmingham fakultetens Utvecklingsstipendium (till W.Z.).

Alla djurförsök i denna studie godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of Alabama i Birmingham och baserades på National Institutes of Health laboratorium djurskötsel och riktlinjer för användning (NIH publikation nr 85-23).
1. förberedelse av kultur medier och kultur skyltar
<ol><li>
Medelstora preparat
	<ol>
<li>För hiPSC medium, blanda 400 mL av humant pluripotenta stamcells (hPSC) basal medium (tabell...

<ol>
	<li>Menasche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clinical+use+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors:+a+translational+experience.">Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience.</a> European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Frisch, S. M., Francis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+epithelial+cell-matrix+interactions+induces+apoptosis.">Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis.</a> Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).</li><li>Haun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+anoikis+signalling+pathway+using+the+fungal+virulence+factor+gliotoxin.">Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin.</a> Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).</li><li>Ohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase+ROCK+activates+LIM-kinase+1+by+phosphorylation+at+threonine+508+within+the+activation+loop.">Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).</li><li>Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase-dependent+contraction+of+stress+fibres+and+the+organization+of+focal+adhesions.">Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions.</a> Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).</li><li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression.">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li><li>Legate, K. R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+adaptor+binding+to+beta-integrin+cytoplasmic+tails.">Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+Inhibitor+Y-27632+Promotes+Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Survival+by+Altering+Cellular+Biomechanical+Properties.">ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties.</a> Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).</li><li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li><li>Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCND2+Overexpression+Enhances+the+Regenerative+Potency+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes:+Remuscularization+of+Injured+Ventricle.">CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle.</a> Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Single-Cell+Analysis+of+Transplanted+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+After+Acute+Myocardial+Infarction.">Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction.</a> Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+Preconditioning+Enhances+Transplantation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+in+Myocardial+Infarction+Mice.">Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice.</a> Cardiovascular Research. , (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inhibition+promotes+atypical+anoikis+in+glioma+cells.">Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e1012 (2014).</li><li>Lelievre, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+mediates+neuronal+cell+survival+through+Bim+down-regulation.">N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation.</a> PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+cell+motility+by+carbon+ion+irradiation+via+the+Rho+signaling+pathway+and+its+inhibition+by+the+ROCK+inhibitor+Y-27632+in+lung+adenocarcinoma+A549+cells.">Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells.</a> Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).</li><li>Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC-beta+exacerbates+in+vitro+brain+barrier+damage+in+hyperglycemic+settings+via+regulation+of+RhoA/Rho-kinase/MLC2+pathway.">PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).</li></ol>

De viktigaste stegen i denna studie inkluderar att få ren hiPSC-CMs, förbättra aktiviteten av hiPSC-CMs genom Y-27632 förbehandling, och slutligen, transplantation en exakt mängd hiPSC-CMs i en mus MI modell.
De viktigaste frågorna som togs upp här var att vi först optimerade de glukos fria renings metoderna19 och upprättade ett nytt effektivt reningssystem. Systemet förfarande ingår tillämpa cell-dissociation enzymer, återplantering celler i gelatin-belagd...

Stamcells-baserade terapier har visat stor potential som en behandling för hjärtskador orsakade av MI1. Användningen av differentierade hiPSCs ger en outtömlig källa av hiPSC-CMs2 och öppnar dörren för den snabba utvecklingen av genombrott behandlingar. Emellertid, många begränsningar till terapeutisk översättning kvarstår, inklusive utmaningen att den kraftigt låga inympningar graden av implanterade celler.
Separera celler med trypsin initierar Anoikis3, som bara accelereras när dessa celler injiceras i hårda miljöer som den ischemiska myocardium, där hypoxisk miljö accelererar kursen mot celldöd. Av de kvarvarande cellerna tvättas en stor del ut från implantationsstället in i blodomloppet och sprids i periferin. En av de viktigaste apoptotiska vägar är RhoA/ROCK Pathway4. Baserat på tidigare forskning, den RhoA/rock Pathway reglerar aktin cytoskeletala organisationen5,6, som ansvarar för cell dysfunktion7,8. Berg hämmaren Y-27632 används flitigt under somatiska och stamcells dissociation och passaging, för att öka celladhesion och minska Cell apoptos9,10,11. I denna studie, Y-27632 används för att behandla hiPSC-CMs före transplantation i ett försök att öka cell inympning hastighet.
Flera metoder som syftar till att förbättra cell inympnings frekvens, såsom värme chock och basalmembran matris beläggning12, har fastställts. Bortsett från dessa metoder, genetisk teknik kan också främja kardiomyocyte proliferation13 eller omvänd nonmyokardiserade celler i kardiomyocyter14. Ur bioteknik perspektiv, kardiomyocyter är seedade på en biomaterial byggnadsställning för att förbättra transplantationen effektivitet15. Tyvärr är de flesta av dessa metoder komplicerade och kostsamma. Tvärtom, den metod som föreslås här är enkel, kostnadseffektiv och effektiv, och den kan användas som en basal behandling före transplantation, liksom i konjugering med andra tekniker.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase (stem cell detachment solution)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>20163029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM (calcium indicator)</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free RPMI 1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (extracellular matrix )</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR (human pluripotent stem cells medium)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (surfactant polyol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho activator II</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>CN03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium DL-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE (cell-dissociation enzymes)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm Coverslips</td>
			<td>Warner</td>
			<td>CS-15R15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Camera</td>
			<td>pco</td>
			<td>1200 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scan Head</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-42LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microincubation System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>DH-40iL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minivent Mouse Ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/SCID mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast Protein Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Packs</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1704156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot System</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab198580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin C</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab137130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab47003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-175-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-095-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab91605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#946;1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ab9260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Myosin Light Chain 2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3671s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2016A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.52g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity

En avgörande faktor för att förbättra cellulära terapi effektivitet för myokardiell förnyelse är att säkert och effektivt öka cell inympning hastighet. Y-27632 är en mycket potent hämmare av Rho-associerade, lindade-Coil-innehållande proteinkinas (RhoA/ROCK) och används för att förhindra dissociation-inducerad Cell apoptos (Anoikis). Vi visar att Y-27632 förbehandling för humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs+ RI) före implantation resulterar i en cell engrafations hastighet förbättring i en musmodell av akut hjärtinfarkt (mi). Här beskriver vi ett komplett förfarande av hiPSC-CMs differentiering, rening, och cell förbehandling med Y-27632, samt den resulterande cellkontraktion, kalcium övergående mätningar, och transplantation till mus MI modeller. Den föreslagna metoden ger en enkel, säker, effektiv och låg kostnad metod som avsevärt ökar cell inympningsgraden. Denna metod kan inte bara användas tillsammans med andra metoder för att ytterligare förbättra cell transplantations effektiviteten utan ger också en gynnsam grund för studiet av andra hjärtsjukdomar.

Den hipsc-CMS som används i denna studie härstammar från mänskligt ursprung med luciferas reporter Gene; överlevnadsfrekvensen för de transplanterade cellerna in vivo upptäcktes därför av Mareld Imaging (bli)17 (figur 1a, B). För histologiska hjärt avsnitt klassificerades Human-specifika hjärttroponin T (hcTnT) och humana nukleära antigen (HNA) dubbel positiva celler som inympade hiPSC-CMs (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity at JoVE.com

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

I detta protokoll visar och utvecklar vi hur man använder humana inducerade pluripotenta stamceller för kardiomyocyte differentiering och rening, och vidare, om hur man kan förbättra sin transplantation effektivitet med Rho-associerad proteinkinashämmare förbehandling i en mus hjärtinfarkt modell.

Förbättra inympningen av humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda Kardiomyocyter via en övergående hämning av Rho-Kinas aktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Våra data visar att transient hämning av Rho-kinas verksamhet förbättrar vidhäftning, överlevnad och engraftment av hiPSC-härledda kardiomyocyter efter att ha transplanterats in i infarcted djur hjärtan. Vi ger en enkel, låg kostnad, medan mycket effektiv metod för att öka engraftment av transplanterade hiPSC-härledda kardiomyocyter i de skadade djur hjärtan. Eftersom denna teknik kan förbättra cellen engraftment priser säkert och effektivt i akut hjärt infarkt och hjärtsvikt, det bidrar till de resulterande förbättringarna i hjärtfunktion, vascularities, och apoptos.Även om vi bara testade våra protokoll i hiPSCs, kan dessa metoder tillämpas på andra typer av celler, såsom embryonala stamceller, mesenkymala stamceller, et cetera. Dosen och varaktigheten av Y-27632 behandling är kritisk. Den visuella demonstrationen kan visa i detalj alla viktiga steg i protokollet, vilket är fördelaktigt för någon som aldrig har utfört denna teknik tidigare.På dag 21 efter hiPSC-CM differentiering, aspirera mediet och tvätta cellerna med steril PBS gång. Inkubera cellerna med 0,5 milliliter cell-dissociation enzymer per brunn vid 37 grader Celsius i fem till sju minuter. Efter inkubationstiden pipetterar cellupphängningen upprepade gånger med en en milliliterpipett för att noggrant separera cellerna.Tillsätt sedan en milliliter neutraliserande lösning till varje brunn, samla cellblandningen i ett 15-milliliter centrifugrör och centrifug vid 200 gånger g i tre minuter. Efter centrifugeringen kasserar du supernatanten och återanvänder cellerna i neutraliserande lösning. Sedan plantera om cellerna på gelatin-belagda, sex-brunn plattor med en densitet av två miljoner celler per brunn.Efter 24 till 48 timmar, byt ut odlingsmediet med reningsmediet i tre till fem dagar. Före transplantation, odla cellerna i behandlingsgruppen i 12 timmar i RB-plus medium kompletteras med 10-mikromolar Y-27632. På samma sätt utför verapamil behandling på cellerna i RB-plus-mediet med ett mikromol av verapamil i 12 timmar.Efter behandlingen tvättar du hiPSC-CMs med PBS en gång, och inkuberar cellerna med 0,5 mikroliter av cell-dissociation enzymer per brunn i högst två minuter. Upprepade gånger pipettera cellupphängningen med hjälp av en en-milliliter pipett för att noggrant separera cellerna. Därefter neutraliserar cellerna med neutraliserande lösning, samla cellblandningen i ett 15-milliliter centrifugeringsrör och centrifug vid 200 gånger g i tre minuter.Efter centrifugeringen, resuspend cellerna i PBS vid en koncentration av 0,1 miljoner celler per fem mikroliter som förberedelse för injektion. Omedelbart efter hjärtinfarkt induktion, injicera fem mikroliter av kontroll hiPSC-CMs, Y-27632-pretreated hiPSC-CMs, verapamil-behandlade hiPSC-CMs, eller en lika stor volym pbs i musens hjärtmusard på varje plats, en i infarkt området och två i områdena runt inctfarct. 12 timmar innan du utför kalciumtransient och kontraktilitetsdetektering, lägg till 10-mikromolar Y-27632, 100-nanomolar RA, en-mikromolar verapamil eller en lika stor volym PBS i odlingsmediet för hiPSC-CMs.Därefter kasserar du mediet och tvättar plattan med PBS en gång. Ändra mediet till en fenol rödfri DMEM som innehåller 0,02 vikt per volymprocent av tensidpolyol, femmikariumkalciumindikator och motsvarande Y-27632, RA, verapamil eller en lika stor volym PBS, och inkubera plattan i 37 grader Celsius i 30 minuter. Efter inkubationen, kassera supernatanten, tvätta cellerna med det färgämnesfria DMEM tre gånger, och låt mediet vila i 30 minuter för att de-esterifiera kartläggningsfärgen.Placera cell-seedade coverslip i ett öppet bad kammare, och sätt in kammaren i en mikroincubation system ekvilirated till 37 grader Celsius med en automatisk temperaturregulator. Gör den mer genom att genomsyra med Tyrodes lösning, och lägg kontinuerligt till RI, RA eller PBS i perfusionslösningen. Använd en inverterad fluorescens mikroskop och en laser scanning huvud för att spela in spontana kalcium övergående genom att anställa en x-t linje scan.Registrera den spontana sammandragningen av hiPSC-CMs med hjälp av differentiell inblandning kontrast funktionalitet av confocal mikroskop. De transplanterade cellernas överlevnadsgrad bekräftades av den ökade luciferasaktiviteten. Den ökade mänskliga hjärt troponin T och mänskliga nukleära antigen uttryck visade att Y-27632 förbehandling kunde avsevärt förbättra cellen engraftment hastigheten.Y-27632 förbehandlade celler uppvisade en större och mer definierade stavformade cytoskeletal struktur. Också, Y-27632 förbehandling minskade TUNEL-positiva celler, vilket indikerar den reducerade transplanterade hiPSC-CM apoptos in vivo. Western blot föreslog att Y-27632 förbehandling ökat uttryck av integrin beta-1 och N-cadherin och minskade uttrycket av phospho-myosin ljus kedja 2.Denna förändring normaliserades 72 timmar efter Y-27632 tillbakadragande. In vitro mus HL-1 cellen bilaga experiment anges att Y-27632 förbehandling avsevärt ökat hiPSC-CM följsamhet i förhållande till HL-1. Y-27632 förbehandling minskade kontraktil kraft, topp kalcium övergående fluorescens, och kalcium övergående varaktighet.Y-27632 förbehandling reglerad kardiomycytkontraktion genom att avsevärt minska uttrycket av cTnI och cTnT. Liknar Y-27632, verapamil pretreatment ökade luciferas aktivitet och antalet hcTnT/HNA dubbel-positiva celler. Det viktigaste steget är att odlingsceller i behandlingsgruppen i 12 timmar i Rb-plus medium kompletterat med 10-mikromolar Y-27632.Baserat på denna metod, långsam frisättning av Y-27632 att ytterligare öka cellen engraftment rate är en lovande strategi. Denna teknik banar väg för forskare att studera fysiologi och funktion av hiPSC av CMs in vivo. Den lilla molekylen CHIR99021 som används för kardiomyocyter differentiering är farligt, vilket kan orsaka irritation i luftvägarna.Vänligen inte intag eller andas in på något sätt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifiering av Bacterial Histidin Kinase-autofosforylering med hjälp av en Nitrocellulosabindningsanalys

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analys av proteinkinasaktivitet med radiomärkt ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifiering av cyklin-beroende Kinase 1 särskilda fosforylering platser av ett In Vitro -Kinas Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rening och kinetiska analys via syre elektrod för att studera DesB dioxygenas aktivitet och hämning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human perifert blod Neutrophil Isolering för förhör av Parkinsons associerade LRRK2 Kinas väg genom att bedöma Rab10 Fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifiering av romanen CK2 Kinase substrat med en mångsidig biokemisk metod

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studera RNA interactmedlemmar av proteinkinas RNA-aktiverad under däggdjur cellcykeln

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Enstegs berikning av en TAP-märkta Histone Deacetylase av Filamentous svampen Aspergillus nidulans för enzymatisk aktivitet assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder för ett nytt Kinas protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinashämmare screening i självmonterade humana Proteinmikromatriser

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...