Name: enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity at JoVE.com

Yazarlar nazik Fluc-GFP yapı ve mükemmel teknik yardım için Dr Yanwen Liu sağlayan Dr Joseph C. Wu (Stanford Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışmada, Ulusal Sağlık Enstitüleri RO1 hibe HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (J.Z.) ve HL121206A1 (iniş) ve bir R56 Grant HL142627 (W.Z.), bir Amerikan Kalp Derneği Bilim adamı kalkınma Grant tarafından desteklenmektedir 16.30410018, ve Alabama Üniversitesi Birmingham fakülte kalkınma Grant (W.Z. için).

Bu çalışmada tüm hayvan prosedürleri kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıABUC) tarafından Birmingham Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmış ve ulusal sağlık laboratuvarı hayvan bakımı ve kullanım kılavuzları (NıH Yayın No 85-23).
1. Kültür Medya ve kültür plakalarının hazırlanması
<ol><li>
Orta hazırlık
	<ol>
<li>HiPSC orta için, mix 400 mL insan pluripotent kök hücresi (hPSC) Bazal Orta (tablo malzeme 1) ve...

<ol>
	<li>Menasche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+clinical+use+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors:+a+translational+experience.">Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience.</a> European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Frisch, S. M., Francis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+epithelial+cell-matrix+interactions+induces+apoptosis.">Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis.</a> Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).</li><li>Haun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+anoikis+signalling+pathway+using+the+fungal+virulence+factor+gliotoxin.">Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin.</a> Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).</li><li>Ohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase+ROCK+activates+LIM-kinase+1+by+phosphorylation+at+threonine+508+within+the+activation+loop.">Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).</li><li>Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+kinase-dependent+contraction+of+stress+fibres+and+the+organization+of+focal+adhesions.">Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions.</a> Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).</li><li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression.">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li><li>Legate, K. R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+adaptor+binding+to+beta-integrin+cytoplasmic+tails.">Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+Inhibitor+Y-27632+Promotes+Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Survival+by+Altering+Cellular+Biomechanical+Properties.">ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties.</a> Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).</li><li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li><li>Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCND2+Overexpression+Enhances+the+Regenerative+Potency+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes:+Remuscularization+of+Injured+Ventricle.">CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle.</a> Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Single-Cell+Analysis+of+Transplanted+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+After+Acute+Myocardial+Infarction.">Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction.</a> Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+Preconditioning+Enhances+Transplantation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+in+Myocardial+Infarction+Mice.">Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice.</a> Cardiovascular Research. , (2018).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inhibition+promotes+atypical+anoikis+in+glioma+cells.">Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e1012 (2014).</li><li>Lelievre, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+mediates+neuronal+cell+survival+through+Bim+down-regulation.">N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation.</a> PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+cell+motility+by+carbon+ion+irradiation+via+the+Rho+signaling+pathway+and+its+inhibition+by+the+ROCK+inhibitor+Y-27632+in+lung+adenocarcinoma+A549+cells.">Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells.</a> Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).</li><li>Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC-beta+exacerbates+in+vitro+brain+barrier+damage+in+hyperglycemic+settings+via+regulation+of+RhoA/Rho-kinase/MLC2+pathway.">PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).</li></ol>

Bu çalışmanın temel adımları saf hiPSC-CMs elde, Y-27632 pretreatment aracılığıyla hiPSC-CMs etkinliğini geliştirmek ve son olarak, bir fare mı modeline hiPSC-CMs kesin bir miktar nakli içerir.
Burada ele önemli konular, ilk olarak, biz glikoz içermeyen arıtma yöntemleri19 optimize ve yeni bir verimli arıtma sistemi kuruldu. Sistem prosedürü, hücre dağılma enzimleri uygulama dahil, jelatin kaplı plaklarda hücreleri redikasyon, nötralizasyon or...

Kök hücre bazlı tedaviler, mı1 'in neden olduğu kardiyak hasarlara yönelik bir tedavi olarak önemli bir potansiyel göstermiştir. Farklılaşan hiPSCs kullanımı, hiPSC-CMs2 ' nin tükenmeyen bir kaynağını sağlar ve çığır açan tedavilerin hızlı gelişimi için kapıyı açar. Ancak, implante edilen hücrelerin ciddi derecede düşük Engraftman oranının zorluk da dahil olmak üzere, terapötik çeviri için birçok sınırlama kalır.
Tripsin ile hücreleri ayırmak anoikis başlatır3, hangi sadece bu hücreler iskemik miyokard gibi sert ortamlar enjekte edildikten sonra hızlandırılmış, hipotik çevre hücre ölümü doğru kurs hızlandırır nerede. Kalan hücrelerin büyük bir oranı, implantasyon bölgesinden kan dolaşımına kadar yıkanır ve çevre boyunca yayılır. Anahtar apoptotik yollarından biri RhoA/kaya yolu4. Önceki araştırmaya dayanarak, rhoa/rock yolu hücre disfonksiyon7, 8sorumludur aktin sitroiskelet organizasyonu5,6, düzenler. Kaya inhibitörü Y-27632 yaygın olarak somatik ve kök hücre dağılma ve geçiş sırasında kullanılır, hücre yapışmasını artırmak ve hücre apoptozis azaltmak için9,10,11. Bu çalışmada, Y-27632, hipsc-CMS ' i transplantasyondan önce tedavi etmek için, hücre Engraftman hızını artırma girişimi için kullanılır.
Isı şok ve Bodrum membran matris kaplama12gibi hücre Engraftman hızını artırmaya yönelik çeşitli yöntemler kurulmuştur. Bu yöntemlerin yanı sıra, genetik teknoloji kardiyomiyosit proliferasyonu13 veya ters nonmiyokard hücrelerini kardiyomiyositlere14olarak teşvik edebilir. Biyomühendislik perspektifinden, kardiyomiyositler transplantasyon verimliliğini artırmak için biyomateryal iskele üzerine dikilir15. Ne yazık ki, bu yöntemlerin çoğunluğu karmaşık ve pahalıdır. Bunun aksine, burada önerilen yöntem basit, uygun maliyetli ve etkilidir ve transplantasyondan önce bazal tedavi olarak ve diğer teknolojilerle birlikte konjugasyon olarak kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase (stem cell detachment solution)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>20163029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM (calcium indicator)</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free RPMI 1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (extracellular matrix )</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR (human pluripotent stem cells medium)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (surfactant polyol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho activator II</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>CN03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium DL-lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE (cell-dissociation enzymes)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm Coverslips</td>
			<td>Warner</td>
			<td>CS-15R15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Camera</td>
			<td>pco</td>
			<td>1200 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scan Head</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-42LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microincubation System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>DH-40iL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minivent Mouse Ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/SCID mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast Protein Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Packs</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1704156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot System</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab198580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin T</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin C</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab137130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac Troponin I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab47003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-175-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-donkey anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td>
			<td>715-095-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab91605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#946;1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ab9260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Myosin Light Chain 2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3671s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2016A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.52g</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity

Miyokard rejenerasyon için hücresel terapi etkinliğini iyileştirmek için önemli bir faktör güvenli ve verimli hücre Engraftman hızını artırmak için. Y-27632, Rho ile ilişkili, helezon-bobin içeren protein kinaz (RhoA/ROCK) ve dissosyasyon kaynaklı hücre apoptozis (anoikis) önlemek için kullanılan son derece güçlü bir inhibitörü. Biz, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositler (hipsc-CMS+ RI) için Y-27632 ön tedavisinin, akut miyokard infarktüsü (mı) fare modelinde bir hücre Engraftman oranı iyileştirmesinde implantasyon sonuçlarından önce olduğunu gösteriyoruz. Burada, Y-27632 ile hiPSC-CMs farklılaşma, arıtma ve hücre ön tedavi prosedürlerinin yanı sıra elde edilen hücre kasılma, kalsiyum geçici ölçümleri ve fare mı modellerinde transplantasyon gibi tam bir prosedür açıklanmaktadır. Önerilen yöntem, hücre Engraftman hızını önemli ölçüde artıran basit, güvenli, etkili ve düşük maliyetli bir yöntem sağlar. Bu yöntem sadece daha fazla hücre transplantasyonu verimliliğini artırmak için diğer yöntemlerle birlikte kullanılamaz, aynı zamanda diğer kardiyak hastalıkların mekanizmalarının çalışması için de olumlu bir temel sağlar.

Bu çalışmada kullanılan hipsc-CMS, Lusiferaz muhabiri geni ile insan kökeninden türetilmiştir; Bu nedenle, nakledilen hücrelerin hayatta kalma oranı Bioluminesans görüntüleme (BLı)17 (Şekil 1a, B) ile tespit edildi. Histolojik kalp bölümleri için, insan spesifik kardiyak troponin T (hcTnT) ve insan nükleer antijen (HNA) çift pozitif hücreler enserted hiPSC-CMs olarak sınıflandırılmıştır (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity at JoVE.com

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Bu protokolde, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin kardiyomiyosit farklılaşma ve arıtma için nasıl kullanılacağı ve daha fazla, Rho ile ilişkili protein kinaz inhibitörü ile transplantasyon verimliliğini nasıl iyileştirebileceğini gösteriyoruz. bir fare miyokard infarktüsü modelinde ön tedavi.

Rho kinase aktivitesinin geçici Inhibisyonu ile ınsan kaynaklı pluripotent kök hücreli türev Kardiyomiyositlerin engraftment artırılması

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Verilerimiz, Rho-kiinaz aktivitesinin geçici inhibisyonunun, enfarktüs hayvan kalplerine nakledildikten sonra hiPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin yapışmasını, hayatta kalmasını ve engraftasyonunu artırdığını göstermektedir. Biz basit, düşük maliyetli sağlarken, yaralı hayvan kalplerinde nakledilen hiPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin engraftment artırmak için son derece verimli bir yöntem. Bu teknik akut kardiyak enfarktüs ve kalp yetmezliğinde hücre engraftment oranlarını güvenli ve verimli bir şekilde artırabildiğinden, kardiyak fonksiyon, vaskülar ve apoptozda ortaya çıkan iyileşmelere katkıda bulunur.Protokollerimizi sadece hiPSC'lerde test etmemize rağmen, bu yöntemler embriyonik kök hücreler, mezenkimal kök hücreler ve saire gibi diğer hücre türlerine de uygulanabilir. Y-27632 tedavisinin dozu ve süresi önemlidir. Görsel gösteri, protokoldeki tüm önemli adımları ayrıntılı olarak gösterebilir, bu da bu tekniği daha önce hiç gerçekleştirmemiş biri için yararlıdır.21. gün hiPSC-CM farklılaşmasından sonra, orta aspirasyon ve steril PBS ile hücreleri bir kez yıkayın. Hücreleri 0.5 mililitre hücre ayrıştırma enzimi ile 37 derecede 5-7 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka süresinden sonra, hücreleri iyice ayrıştırmak için bir mililitrelik pipet kullanarak hücre süspansiyonunu tekrar tekrar pipetleyin.Sonra, her kuyuya bir mililitre nötralize çözeltisi ekleyin, hücre karışımını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın ve üç dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj yapın. Santrifüjden sonra, süpernatant atın ve nötralize çözeltisi hücreleri resuspend. Daha sonra, jelatin kaplı üzerine hücreleri yeniden bitki, iyi başına iki milyon hücre yoğunluğunda altı iyi plakalar.24 ila 48 saat sonra, üç ila beş gün için arıtma ortamı ile kültür ortamı değiştirin. Transplantasyon dan önce, rb artı orta 12 saat boyunca tedavi grubundaki hücreleri kültür 10-mikromolar Y-27632 ile takviye. Benzer şekilde, 12 saat boyunca verapamil bir mikromol ile RB artı orta hücrelerde verapamil tedavi gerçekleştirin.Tedaviden sonra hiPSC-CM'leri bir kez PBS ile yıkayın ve hücreleri her kuyubaşına 0,5 mikrolitre hücre ayrıştırma enzimi ile en fazla iki dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri iyice ayrıştırmak için bir mililitrelik pipet kullanarak hücre süspansiyonu tekrar tekrar pipetleyin. Daha sonra, nötralize çözeltisi ile hücreleri nötralize, 15 mililitrelik santrifüj tüp hücre karışımı toplamak ve üç dakika için 200 kez g santrifüj.Santrifüjden sonra, enjeksiyona hazırlık olarak pbs'deki hücreleri beş mikrolitrede 0,1 milyon hücre konsantrasyonu yla yeniden askıya alın. Miyokard enfarktüsü indüksiyonundan hemen sonra, beş mikrolitre kontrol hiPSC-CM', Y-27632 önceden işlenmiş hiPSC-CM'ler, verapamil-tedavi hiPSC-CM'ler veya her sitede farenin miyokardiyumuna eşit miktarda PBS enjekte edin, her sitede bir tane enfarktüs alanında ve infarkt çevresindeki alanlarda iki. Kalsiyum geçici ve kontraktillik tespiti yapmadan 12 saat önce, hiPSC-CM'lerin kültür ortamına 10 mikromolar Y-27632, 100 nanomolar RA, tek mikromolar verapamil veya eşit miktarda PBS ekleyin.Ardından, orta atın ve pbs ile bir kez plaka yıkayın. Ortamı, yüzey aktif polyol, beş mikromolar kalsiyum indikatörü ve buna karşılık gelen Y-27632, RA, verapamil veya eşit miktarda PBS'nin hacmini içeren bir fenol kırmızısız DMEM'e çevirin ve plakayı 30 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, süpernatant atın, boya içermeyen DMEM ile hücreleri üç kez yıkayın ve haritalama boyası de-esterify için 30 dakika orta dinlenme sağlar.Hücre tohumu kapak kaymasını açık bir banyo odasına yerleştirin ve odayı otomatik sıcaklık kontrol ünitesiyle 37 dereceye kadar dengelenmiş bir mikro kuluçka sistemine yerleştirin. Tyrode'un çözeltisi ile perfuse ve perfüzyon çözeltisi için sürekli RI, RA veya PBS ekleyin. Bir x-t hattı taraması kullanarak spontan kalsiyum geçici kaydetmek için ters floresan mikroskop ve lazer tarama kafası kullanın.Konfokal mikroskobun diferansiyel girişim kontrastı işlevini kullanarak hiPSC-CM'lerin spontan daralmasını kaydedin. Nakledilen hücrelerin sağkalım oranı artan luciferase aktivitesi ile doğrulandı. Artan insan kardiyak troponin T ve insan nükleer antijen ekspresyonu Y-27632 ön tedavi önemli ölçüde hücre engraftment oranını artırabilir gösterdi.Y-27632 önceden işlem görmüş hücreler daha büyük ve daha tanımlı çubuk şeklinde sitoskeletyapısı sergiledi. Ayrıca, Y-27632 ön tedavi tunel-pozitif hücreleri azalttı, in vivo nakledilen hiPSC-CM apoptoz un azaldığını gösteren. Batı lı blot, Y-27632 ön işlem deingrin beta-1 ve N-kadherin ekspresyonunu artırdığını ve fosfo-miyozin ışık zinciri 2 ekspresyonunu azalttığını ileri sürmüştür.Bu değişiklik Y-27632 çekilmesinden 72 saat sonra normale döndü. In vitro fare HL-1 hücre ek deneyleri Y-27632 ön işlem hl-1 göre hiPSC-CM bağlılık önemli ölçüde arttığını gösterdi. Y-27632 ön işlem kontraktil kuvveti, pik kalsiyum geçici floresan ve kalsiyum geçici süresini azalttı.Y-27632 pretreatment düzenlenmiş kardiyomiyosit daralması önemli ölçüde cTnI ve cTnT ekspresyonu azaltarak. Y-27632'ye benzer şekilde verapamil ön işlem hcTnT/HNA çift pozitif hücrelerin luciferase aktivitesini ve sayılarını arttırmıştır. En önemli adım 10 mikromolar Y-27632 ile desteklenen Rb artı orta 12 saat boyunca tedavi grubunda kültür hücreleri için.Bu yönteme dayanarak, y-27632 yavaş salınımı daha fazla hücre engraftment oranını artırmak için umut verici bir stratejidir. Bu teknik, araştırmacıların in vivo CMs hiPSC fizyolojisi ve fonksiyonu çalışma için önünü açıyor. Kardiyomiyosit farklılaşması için kullanılan küçük molekül CHIR99021 tehlikelidir, bu da solunum yolu tahrişine neden olabilir.Lütfen herhangi bir şekilde solumayın ya da nefes almayın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Enzimatik aktivite assay için Filasentous mantar Aspergillus nidulans bir tap-Tagged histon Deacetylase tek adımlı zenginleştirme

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...