Name: measurement of specific mycobacterial mistranslation rates with gain-of-function reporter systems
Uploaded: 2019-04-26T13:30:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems at JoVE.com

Dette arbejde blev til dels støttet af tilskud fra Bill og Melinda Gates Foundation (OPP1109789), National Natural Science Foundation i Kina (31570129), og start-up midler fra Tsinghua University School of Medicine til B.J. B.J. er en Wellcome Trust Investigator (207487/Z/17/Z).

1. Renilla-Firefly Dual-luciferase reporter
Bemærk: For en visuel gengivelse af denne metode, se figur 2.
<ol><li>Inokulere mykobakterielle reporter stammer fra-80 °C lager med 2 mL 7H9 medium. Wild-type Dual-luciferase, samt muterede renilla (reporter) stammer, skal anvendes til at tillade beregning af forkert oversættelse satser (Se trin 1,7). Ryst ved 37 °C i 1 til 2 dage indtil OD600 når den stationære fase (OD > 3).</li>
	<li>Aliquot og fortyndes til OD600Nm omkring 0,1-0,5. For typiske eksperimenter, brug tre uafhængige biologiske replikat kulturer. Anhydrotetracyclin (ATC), en tetracyklin analog induktor af reporter Expression (som styres af en tetracyclin inducerbar promotor) til en endelig koncentration på 50 ng/ml.</li>
	<li>At måle virkningerne af kasugamycin på forkert oversættelse satser21, tilsæt forskellige doser af kasugamycin til kulturen (Se figur 4 for de angivne doser) på samme tid (ved de testede doser, kasugamycin har ingen antimikrobiel aktivitet). Bemærk, at det er vigtigt at inkludere mindst én ikke-induceret kontrol for hver reporter. Kultur inducerer kulturer for 4-6 h ved 37 °C med rystelser.</li>
	<li>Bakteriekulturer overføres til et 2 mL rør, og der centrifugeres ved 3.220 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at pille bakterierne ned. Kassér supernatanten.</li>
	<li>Forstyrre bakterierne ved at tilføje 40 μL 1x passiv lysis buffer (leveres af en dual-luciferase Kit), som er blevet fortyndet (1:1) i dobbeltdestilleret vand. Overfør det resuspenderede bakteriellysvæske til en hvid 96-brønd plade, en brønd pr. prøve, og ryst ved stuetemperatur i 20 min. Forsigtig: Du må ikke over inkuere bakterierne i lysis buffer (i mere end 30 min.).</li>
	<li>Der tilsættes 80 μL ildsubstrat til hver brønd, rystes i 15 s og måles luminescens med luminometer med 1.000 MS som integrationstid. Brug enten en automatisk injektor eller en multikanalpipette til at undgå pipette Rings fejl.</li>
	<li>Der tilsættes 80 μL Renilla -substrat til hver brønd, rystes i 15 s og måles luminescens med luminometer med 1.000 MS som integrationstid.</li>
	<li>Træk baggrunds luminescens-målt ved hjælp af enten Wild-type M. smegmatis (dvs. ikke indeholder journalister) eller uinduceret reporter lysat-fra de målte værdier. Brug de korrigerede værdier til at beregne mistransationsraterne for hver betingelse ved hjælp af følgende ligning11,25, hvor DN refererer til aktiviteten i den muterede reporter stamme: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59453/59453eq1.jpg">
</li>
</ol>2. nluc/GFP reporter
Bemærk: For en visuel gengivelse af denne metode, se figur 3.
<ol><li>Inokulere den bakterielle reporter stamme fra-80 °C lager med 2 mL 7H9 medium. Ryst ved 37 °C i 1 til 2 dage indtil OD600 når den stationære fase (OD > 3).</li>
	<li>Subkultur til 50 mL 7H9 medium og vokse indtil OD600 når den sene stationære fase (> 4).</li>
	<li>Før du aliciteres bakterierne til en 96-brønd plade, tilsættes ATC i en slutkoncentration på 50 ng/mL og blandes godt. Induktion af bulk-kulturen sikrer, at alle brønde indeholder den samme mængde induktor, og at induktion af indberetteren er synkroniseret. Aliquot bakterierne til en klar, rundbundet 96-brønd plade, med 100 μL volumen i hver brønd.</li>
	<li>For at screene for små molekyler, der påvirker forkert oversættelse satser, tilsættes stoffet ved den angivne koncentration for at vælge brønde. Med henblik på denne protokol anvendes kasugamycin (ved doser angivet i figur 5) som illustration. Tilsæt forskellige doser af kasugamycin til at vælge brønde (hver forsøgsgruppe skal indeholde mindst to biologiske replikater).</li>
	<li>Prøverne rystes og inducerer ved 37 °C i 16-20 timer. Bemærk: Det er nødvendigt at forsegle pladen med film. Desuden skal alle kant brønde fyldes med mindst 200 μL sterilt vand for at begrænse fordampningen fra test brøndene.</li>
	<li>Tag 80 μL fra hver brønd ved hjælp af en multikanalpipette, og Overfør prøverne til en sort 96-brønd plade (som maksimerer målingen af fluorescens signalet). Mål GFP-signalet med luminometeret med 20 MS som integrationstid.</li>
	<li>Efter måling af GFP-signalet skal pladen centrifugeres ved 3.220 x g i 10 min. Overfør 50 μl af supernatanten til en hvid bundet 96-brønd plade (som maksimerer luminescens signal måling), tilsæt 50 ΜL nluc-substrat til hver brønd, bland dem godt, og måle luminescens af luminometeret med 1.000 MS som integrationstid.</li>
	<li>Bestem Nluc/GFP-forholdet ved at dividere de korrigerede Nluc-luminescens værdier med GFP-fluorescens: denne foranstaltning (i vilkårlige enheder) er et relativt mål for aspartat for asparaginmistranslation.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+mistranslation:+friend+or+foe.">Protein mistranslation: friend or foe.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 355-362 (2014).</li><li>Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+misreading+in+Mycobacterium+smegmatis+increases+in+stationary+phase.">Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase.</a> Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).</li><li>Manickam, N., Nag, N., Abbasi, A., Patel, K., Farabaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+translational+misreading+in+vivo+show+that+the+ribosome+very+efficiently+discriminates+against+most+potential+errors.">Studies of translational misreading in vivo show that the ribosome very efficiently discriminates against most potential errors.</a> RNA. 20 (1), 9-15 (2014).</li><li>Netzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+and+chemically+triggered+oxidative+stress+modifies+translational+fidelity.">Innate immune and chemically triggered oxidative stress modifies translational fidelity.</a> Nature. 462 (7272), 522-526 (2009).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+mycobacterial+amidotransferase+GatCAB+is+a+modulator+of+specific+translational+fidelity.">The essential mycobacterial amidotransferase GatCAB is a modulator of specific translational fidelity.</a> Nature Microbiology. 1 (11), 16147 (2016).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+aminoacyl-tRNA+synthetases+editing-domain+mutations+that+cause+mistranslation+in+Mycoplasma+parasites.">Naturally occurring aminoacyl-tRNA synthetases editing-domain mutations that cause mistranslation in Mycoplasma parasites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9378-9383 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+editing+domain+functions+as+a+molecular+rheostat+to+control+codon+ambiguity+in+Mycoplasma+pathogens.">Leucyl-tRNA synthetase editing domain functions as a molecular rheostat to control codon ambiguity in Mycoplasma pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3817-3822 (2013).</li><li>Ling, J., Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+oxidative+stress+induces+protein+mistranslation+through+impairment+of+an+aminoacyl-tRNA+synthetase+editing+site.">Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4028-4033 (2010).</li><li>Raina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+amino+acid+specificity+of+mammalian+tyrosyl-tRNA+synthetase+is+associated+with+elevated+mistranslation+of+Tyr+codons.">Reduced amino acid specificity of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is associated with elevated mistranslation of Tyr codons.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li><li>Wu, J., Fan, Y., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+oxidant-induced+mistranslation+by+threonyl-tRNA+synthetase.">Mechanism of oxidant-induced mistranslation by threonyl-tRNA synthetase.</a> Nucleic Acids Research. 42 (10), 6523-6531 (2014).</li><li>Kramer, E. B., Farabaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+translational+misreading+errors+in+E.+coli+is+largely+determined+by+tRNA+competition.">The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition.</a> RNA. 13 (1), 87-96 (2007).</li><li>Evans, C. R., Fan, Y., Weiss, K., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+during+Gene+Expression:+Single-Cell+Heterogeneity,+Stress+Resistance,+and+Microbe-Host+Interactions.">Errors during Gene Expression: Single-Cell Heterogeneity, Stress Resistance, and Microbe-Host Interactions.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Mohler, K., Ibba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+fidelity+and+mistranslation+in+the+cellular+response+to+stress.">Translational fidelity and mistranslation in the cellular response to stress.</a> Nature Microbiology. 2, 17117 (2017).</li><li>Bullwinkle, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+cellular+amino+acid+pools+leads+to+cytotoxic+mistranslation+of+the+genetic+code.">Oxidation of cellular amino acid pools leads to cytotoxic mistranslation of the genetic code.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Stop+Codon+Readthrough+in+Single+Bacterial+Cells+and+Implications+for+Population+Fitness.">Heterogeneity of Stop Codon Readthrough in Single Bacterial Cells and Implications for Population Fitness.</a> Molecular Cell. 67 (5), 826-836 (2017).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+mistranslation+protects+bacteria+against+oxidative+stress.">Protein mistranslation protects bacteria against oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1740-1748 (2015).</li><li>Schwartz, M. H., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependent+mistranslation+in+a+hyperthermophile+adapts+proteins+to+lower+temperatures.">Temperature dependent mistranslation in a hyperthermophile adapts proteins to lower temperatures.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 294-303 (2016).</li><li>Schwartz, M. H., Waldbauer, J. R., Zhang, L., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tRNA+misacylation+induced+by+anaerobiosis+and+antibiotic+exposure+broadly+increases+stress+resistance+in+Escherichia+coli.">Global tRNA misacylation induced by anaerobiosis and antibiotic exposure broadly increases stress resistance in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. , (2016).</li><li>Curnow, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glu-tRNAGln+amidotransferase:+a+novel+heterotrimeric+enzyme+required+for+correct+decoding+of+glutamine+codons+during+translation.">Glu-tRNAGln amidotransferase: a novel heterotrimeric enzyme required for correct decoding of glutamine codons during translation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (22), 11819-11826 (1997).</li><li>Rathnayake, U. M., Wood, W. N., Hendrickson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+tRNA+aminoacylation+during+accurate+translation+and+phenotypic+mistranslation.">Indirect tRNA aminoacylation during accurate translation and phenotypic mistranslation.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 41, 114-122 (2017).</li><li>Chaudhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kasugamycin+potentiates+rifampicin+and+limits+emergence+of+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis+by+specifically+decreasing+mycobacterial+mistranslation.">Kasugamycin potentiates rifampicin and limits emergence of resistance in Mycobacterium tuberculosis by specifically decreasing mycobacterial mistranslation.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Toosky, M., Javid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+diagnostics+and+therapeutics+for+drug-resistant+tuberculosis.">Novel diagnostics and therapeutics for drug-resistant tuberculosis.</a> British Medical Bulletin. 110 (1), 129-140 (2014).</li><li>Robinson, N. E., Robinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deamidation+of+human+proteins.">Deamidation of human proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12409-12413 (2001).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urate+oxidase+is+imported+into+peroxisomes+recognizing+the+C-terminal+SKL+motif+of+proteins.">Urate oxidase is imported into peroxisomes recognizing the C-terminal SKL motif of proteins.</a> European Journal of Biochemistry. 223 (1), 141-146 (1994).</li><li>Javid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+mistranslation+is+necessary+and+sufficient+for+rifampicin+phenotypic+resistance.">Mycobacterial mistranslation is necessary and sufficient for rifampicin phenotypic resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 1132-1137 (2014).</li><li>Wong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+methylation+of+G518+of+the+16S+rRNA+530+loop+by+GidB+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Functional role of methylation of G518 of the 16S rRNA 530 loop by GidB in Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (12), 6311-6318 (2013).</li><li>Wiker, H. G., Harboe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antigen+85+complex:+a+major+secretion+product+of+Mycobacterium+tuberculosis.">The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis.</a> Microbiological Reviews. 56 (4), 648-661 (1992).</li><li>Roberts, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterisation+of+a+pH-stable+GFP.">Identification and Characterisation of a pH-stable GFP.</a> Scientific Reports. 6, 28166 (2016).</li><li>Li, H., Wu, M., Shi, Y., Javid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-Expression+of+the+Mycobacterial+Trehalose-Phosphate+Phosphatase+OtsB2+Results+in+a+Defect+in+Macrophage+Phagocytosis+Associated+with+Increased+Mycobacterial-Macrophage+Adhesion.">Over-Expression of the Mycobacterial Trehalose-Phosphate Phosphatase OtsB2 Results in a Defect in Macrophage Phagocytosis Associated with Increased Mycobacterial-Macrophage Adhesion.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1754 (2016).</li><li>Aldridge, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetry+and+aging+of+mycobacterial+cells+lead+to+variable+growth+and+antibiotic+susceptibility.">Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility.</a> Science. 335 (6064), 100-104 (2012).</li><li>Rego, E. H., Audette, R. E., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+a+mycobacterial+divisome+factor+collapses+single-cell+phenotypic+heterogeneity.">Deletion of a mycobacterial divisome factor collapses single-cell phenotypic heterogeneity.</a> Nature. 546 (7656), 153-157 (2017).</li><li>Zhu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rifampicin+can+induce+antibiotic+tolerance+in+mycobacteria+via+paradoxical+changes+in+rpoB+transcription.">Rifampicin can induce antibiotic tolerance in mycobacteria via paradoxical changes in rpoB transcription.</a> Nature Communications. 9 (1), 4218 (2018).</li><li>Lant, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+tRNA-dependent+mistranslation+in+human+cells.">Visualizing tRNA-dependent mistranslation in human cells.</a> RNA Biology. 15 (4-5), 567-575 (2018).</li><li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals.">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4 (4), 479-486 (1998).</li><li>Melnikov, S. V., van den Elzen, A., Stevens, D. L., Thoreen, C. C., Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+protein+synthesis+quality+control+in+host-restricted+organisms.">Loss of protein synthesis quality control in host-restricted organisms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Den her beskrevne protokol kan tilpasses til måling af mistransationstal i en lang række organismer. Der er en række overvejelser, der bør tages i betragtning ved tilpasningen af protokollen til andre systemer. For det første bør formålet med målingen overvejes. For at opnå en nøjagtig måling af mistransationsraterne ved hjælp af journalister med gevinst for funktion er der behov for (a) en robust udlæsningsassay (f. eks. enzymatisk funktion [i dette tilfælde luciferaseaktivitet] med et bredt lineært interval). Se også efter (b) tab af funktions mutation i en kritisk rest af indberetteren protein, der resulterer i et meget betydeligt tab af funktion, under den forventede hyppighed af mistranslation. For eksempel, hvis den forventede forkert oversættelse sats, der skal måles er ca. 10-3/codon, tab af funktions mutation skal være større end 1.000-fold; ellers vil den nedre række af mistransationshændelser ikke blive påvist på en fornuftig måde. Endelig er der behov for en nøjagtig måling af mistransationssatserne ved hjælp af journalister med gevinst for funktion (c) en robust benchmark-reporter er nødvendig — i dette tilfælde Firefly luciferase for afsnit 1 i protokollen. Ideelt set bør benchmarkjournalisten være fusioneret med den muterede enzymatiske reporter, som garanterer (for alle hensigter og formål), at de begge udtrykkes i ækvimolære ratio. Benchmarkudlæsningerne (og den primære reporter) skal være robuste over for forstyrrelser i udsatte miljøer. F. eks. er fluorescens af vildtype-GFP yderst modtagelig for forstyrrelser ved ændringer i pH28, hvilket gør den uegnet som benchmark for målingen af mistransationsrater i fagocytoserede mykobakterier i makrofager, som er bosat i phagosomer, der er under pH 729. På den anden side, for applikationer såsom små molekyle screening, de vigtigste overvejelser for en primær skærm vil være reproducerbarhed af målingerne (dvs. præcision, i modsætning til nøjagtighed), minimering af manuel håndtering, og små kultur mængderne. De nøjagtige målinger af forkert oversættelse satser er mindre vigtige og kan udføres som sekundære assays. Endelig skal det bemærkes, at de journalister, der er beskrevet i denne protokol, baseret på den enzymatiske funktion af luciferaseenzymer, kun vil måle gennemsnitlige mistransationsrater for en bakteriel population, men ikke kan give oplysninger om heterogenitet i enkelt celle variation i forkert oversættelse. I betragtning af betydningen af enkelt celle variabilitet i adaptive fænotyper30,31,32, fluorescerende reportere til måling af forkert oversættelse hændelser er blevet udviklet12,33 , herunder til måling af forkert oversættelse i mycobakterier5.
Efter at have overvejet kravene til måling af forkert oversættelse, skal det bemærkes, at de genetiske gevinst-for-funktion reportere som beskrevet i denne protokol kun kan måle én type forkert oversættelse (dvs. en aminosyre substitution for en codon) pr. reporter. Derfor, til måling af forskellige forkert oversættelse begivenheder, flere journalister er påkrævet. For eksempel, til måling af forkert oversættelse af ribosomal afkodning fejl af nær-cognate codon af lysyl-tRNA på én position, mindst 16 journalister er påkrævet2,3,11. Højpræcisions massespektrometri og bioinformatik gør det muligt at identificere mange forskellige typer mistransationshændelser samtidig18; men disse metoder kommer også med forbehold. Generelt, de er mindre præcise end gevinst-of-Function journalister. Desuden er de, som tidligere nævnt, mindre velegnede til påvisning af visse typer mistranslation, nemlig dem, der kan konfleres med ikke-enzymatisk Deamidering23. Endelig er massespektrometri uegnet som en læse-ud for medium-eller høj-gennemløb screening.
For tilpasning af disse journalister og protokoller til måling af forkert oversættelse i andre systemer, yderligere overvejelser omfatter et robust udtryk for indberetteren i det ønskede modelsystem. Vi oprindeligt forsøgte at bruge Dual-luciferase system udviklet af Farabaugh og kolleger i vores mykobakterielle system uden ændringer, men havde ingen succes, på grund af manglende reporter udtryk. Omfattende fejlfinding identificeret, at både codon-optimering og en mindre sekvens ændring af journalisterne var forpligtet til at give mulighed for robust udtryk25 (og se ovenfor). Det er tænkeligt, at tilsvarende tilpasninger af journalisterne ville være påkrævet til brug i andre systemer.
Endelig bør det overvejes, hvilken type mistransationshændelse der skal måles. For eksempel, hvis der er behov for at måle stop-codon readthrough (nonsens undertrykkelse), stop codon tab af funktion mutation skal indføres i en ikke-kritisk region af den primære reporter protein34. Ellers kun specifikke nonsens undertrykkelse begivenheder, der genvinde den kritiske restkoncentration (og dermed, reporter funktion) vil blive målt ved analysen, som potentielt ville føre til en betydelig undervurdering af den sande forkert oversættelse satser. Der er stigende beviser for, at translationel fejl spiller en mulig adaptiv rolle i et stort antal organismer1,12,13,35. Målingen af mistransationshændelser er dog stadig begrænset til et lille, omend stigende antal model arter. Tilpasningen af følsomme metoder til at målefejl oversættelse har potentialet til yderligere at øge forskernes forståelse af oversættelsesfejl i fysiologi og patologi.

Informationsstrømmen i molekylær biologi kræver oversættelse af genetiske oplysninger til funktionelle proteiner. Som med alle biologiske systemer involverer genoversættelse også målbare fejl. Skønnene over fejlprocenten i oversættelsen citeres typisk som ca. 1/10000 pr. codon (revideret af Ribas de Pouplana et al.1). Men, fejlprocenter varierer meget, fra mindre end 10-5 til mere end 0,05/codon1,2,3,4,5. Den brede vifte af fejlprocenter, der spænder over mere end tre størrelsesordener, skyldes det faktum, at der kan opstå fejl fra flere trin i oversættelses forløbet: fra stokastiske, mutational eller stress-inducerede fejl i aminoacylering6, 7 af , 8 ud af , 9 ud af , 10, fysiologisk misacylering af asparaginyl-og glutaminyl-trnas5, eller ribosomal afkodning fejl2,3,11. Måleligt høje fejlprocenter, der repræsenterer over 0,01/codon, tyder på, at translationelle fejl kan udføre fysiologiske funktioner1,12 og at forkert oversættelse kan være kontekst specifik13.
Vi og andre har vist, at naturligt forekommende fejl i genoversættelsen kan være adaptiv, især under stress på miljøet1,5,12,14,15,16 ,17,18. I mykobakterier medfører fejl genereret af den totrins indirekte glutamin/asparagin tRNA aminoacyleringspathway19,20 en bemærkelsesværdigt øget tolerance for den første linje Anti tuberkulose antibiotika rifampicin 5. Derfor har vi spekuleret på, at faldende mykobakterielle forkert oversættelse med et lille molekyle kan forstærke drab ved rifampicin. Vi screenet for og identificerede den naturligt forekommende aminoglycosid kasugamycin som et stof, der kunne mindske mykobakterielle mistranslation, forstærke rifampicin-medieret drab af mycobakterier både in vitro og in vivo21, og begrænse fremkomsten af rifampicin resistens21, som truer den globale bekæmpelse af tuberkulose22 -verdens mest dødbringende patogen.
For at studere translationel fejl skal der anvendes metoder til måling af forkert oversættelse. Der er flere metoder, der er blevet udviklet til måling af mistranslation, hver med fordele og ulemper. Kort sagt, præcisions massespektrometri-baserede metoder har flere fordele, hvoraf den vigtigste er, at med nyere algoritmer til påvisning af flere typer af translationel fejl, kan en relativt upartisk måling af forkert oversættelse være udført18. Massespektrometri er imidlertid ikke særlig velegnet til måling af deamidations-mistransationshændelser – netop den type forkert oversættelse, der forekommer i mykobakterier på grund af den indirekte fejlbehæftede tRNA aminoacylationspathway. Dette er på grund af højfrekvente ikke-enzymatisk Deamidering, der forekommer i behandlingen af prøver til massespektrometri23, hvilket resulterer i et ekstremt højt baggrunds signal. Derfor, for påvisning af fejl på denne vej, genetiske gevinst-of-Function journalister giver klare fordele. Specifikt, egnede gevinst-of-funktion reportere kan have ekstremt lave baggrunds hastigheder, så målingen af meget lave fejlprocenter11.
Da udførelse af eksperimenter med patogene Mycobacterium tuberkulose kræver specialiserede faciliteter og ekstra forholdsregler, udfører vi de fleste eksperimenter i den nonpatogene Mycobacterium M. smegmatis — og har vist tidligere, at resultaterne mellem de to arter er stort set sammenlignelige5,21. For at måle forkert oversættelse rater i mykobakterier genereret af den indirekte tRNA aminoacyleringsvej, ændrede vi et renilla-Firefly Dual-luciferasesystem, der tidligere var udviklet til at måle ribosomale afkodningsfejl i E. coli 11 til brug i mykobakterier. Vi lavede tre specifikke ændringer: den oprindelige reporter ikke udtrykke effektivt i mycobakterier, og derfor var sekvensen codon-optimeret, og C-terminalen tre aminosyrer af Firefly luciferase, Serine-lysin-leucin, som er blevet kommenteret som et smugleri signal i nogle systemer24, blev modificeret til isoleucin-alanin-valin25. Den oprindelige reporter havde en kritisk lysin rest i ildflue luciferase muteret. I stedet muterede vi enten en kritisk bevaret aspartat (D120) eller glutamat (E144) rest i Renilla luciferase til asparagin og glutamin, henholdsvis25 (figur 1). Indberetteren blev subcloned i den epicykliske tetracyklin-inducerbare plasmid pUV-tetOR (Se tabellen over materialer). Få-af-funktion journalister muate kritisk bevaret funktionelle rester i enzymer/fluorescerende proteiner, der gør dem fungerer ikke11,26. Translationelle (eller teoretisk, transkriptionelle) fejl, der syntetisere den funktionelle variant af proteinet, ville resultere i målbar enzymaktivitet i en delmængde af oversatte proteiner. For at korrigere for variation i protein tætheden, er den muterede reporter coudtrykt med et funktionelt protein, der fungerer som benchmark og giver mulighed for nøjagtig kvantificering af Gain-of-funktion11. Mens renilla-Firefly Dual-luciferase reporter tilladt for nøjagtig måling af specifikke mykobakterielle forkert oversættelse satser5,25 (figur 2 og afsnit 1 i protokollen), vi hurtigt indså, at det ikke er egnet til medium/høj-gennemløb screening af molekyler, der ville ændre forkert oversættelse sats. Dette skyldes hovedsagelig to grunde, nemlig a) den relative mangel på styrke af Renilla luciferase betød, at mindst 1 ml mykobakteriel kultur/prøve var nødvendig for at måle mistransationstal, og b) kravet om lysis af cellerne før til enzymaktivitet måling krævede overdreven manuel håndtering: mykobakterielle celler har en tyk og flerlags cellevæg og konvolut, der er relativt modstandsdygtig over for lysis. Derfor har vi søgt at udvikle et nyt system med gevinst for funktion, der kan bruges med små volumener (f. eks. i et 96-brønd plade system) og ikke kræver celle-lysis til målinger. Vi brugte den meget potente Nluc luciferase og identificerede en kritisk aspartat rest, der, når muteret til asparagin, resulterede i 2 logs tab af funktion (figur 1). Desuden tillod den lille størrelse af Nluc det at have en N-terminal sekretions signal tag — fra antigen 85A, et større udskilt antigen i mykobakterier27 — der ville gøre det muligt for nluc at blive udskilt i kultur supernatanten og omgå kravet om celle lysis. Benchmarkproteinet, GFP, blev udtrykt fra samme promotor som den muterede Nluc, men fra en integreret vektor (Se tabellen over materialer), og kunne måles i intakte celler21 (figur 3). På trods af disse fordele har Nluc/GFP-indberetteren (protokollens afsnit 2) også ulemper: den relativt beskedne reduktion i Nluc-aktiviteten (100 gange) med D140N-mutationen ville ikke gøre det muligt at måle ekstremt lave mistransationsrater. at gøre indberetteren mere velegnet som et screeningsværktøj end til præcise målinger af translationel fejl. Desuden har Nluc ingen kritiske glutamat rester; Derfor kunne kun asparagin-to-aspartat-fejlprocenter måles. De generelle principper, der er beskrevet i dette arbejde bør give forskerne mulighed for enten at bruge disse journalister, som vi har gjort eller ændre journalister, som er relevante for en nøjagtig og/eller facile måling af andre specifikke translationelle fejlrater i deres modelsystem af Valg.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Middlebrook 7H9</td>
			<td style="width:103px;">BD Difco</td>
			<td style="width:136px;">271310</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">anhydrotetracycline</td>
			<td style="width:103px;">Cayman Chemical&#160;</td>
			<td style="width:136px;">10009542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">kasugamycin</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:136px;">K4013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Dual-luciferase reporter assay system</td>
			<td style="width:103px;">promega</td>
			<td style="width:136px;">E1960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nano-Glo luciferase assay</td>
			<td style="width:103px;">promega</td>
			<td style="width:136px;">N1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Fluoroskan Ascent FL luminometer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo</td>
			<td style="width:136px;">/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid</td>
			<td style="width:103px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:136px;">3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid</td>
			<td style="width:103px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:136px;">3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid</td>
			<td style="width:103px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:136px;">3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non-commercial reagents (plasmids)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:247px;">pUV-TetOR-RenFF</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:136px;">NA</td>
			<td style="width:169px;">episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">pUV-TetOR-Ren-D120N-FF</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>dual-luciferase reporter with mutated Renilla</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:247px;">pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:136px;">NA</td>
			<td style="width:169px;">episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:247px;">pMC1S-GFP</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:136px;">NA</td>
			<td style="width:169px;">Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of specific mycobacterial mistranslation rates with gain-of-function reporter systems

Oversættelsen af gener til proteiner er behæftet med fejl. Selv om den gennemsnitlige grad af translationel fejl i modelsystemer skønnes at være 1/10000 pr. codon, varierer de faktiske fejlprocenter meget, afhængigt af arten, miljøet og codon undersøgt. Vi har tidligere vist, at mykobakterier bruger en to-trins pathway til generering af aminoacyleret glutamin og asparagin trnas, og at dette er specifikt forbundet med relativt høje fejlprocenter på grund af modulation af forkert oversættelse satser af en væsentlig bestanddel af vejen, amidotransferase GatCAB. Vi ændrede en tidligere ansat renilla-Firefly Dual-luciferase system, der var blevet brugt til at måle forkert oversættelse satser i Escherichia coli til brug i mykobakterier til at måle specifikke forkert oversættelse satser for glutamat ved glutamin codon og aspartat til asparagin codon. Selv om dette reporter system var velegnet til nøjagtig vurdering af specifikke fejlprocenter, manglende følsomhed og krav til overdreven manipulation skridt gjort det uegnet til high-gennemløb applikationer. Derfor har vi udviklet et andet "Gain-of-Function"-reporter system ved hjælp af Nluc luciferase og grøn fluorescerende protein (GFP), som er mere underholdende til medium/høj-gennemløb indstillinger. Vi brugte dette system til at identificere kasugamycin som et lille molekyle, der kan mindske mykobakterielle mistranslation. Selv om de journalister, som vi beskriver her, er blevet brugt til at måle specifikke typer af mykobakterielle forkert oversættelse, kan de modificeres til at måle andre typer af forkert oversættelse i en række modelsystemer.

En tegneserie, der illustrerer den generelle skitse af de to reporter systemer, der anvendes i dette arbejde, er vist i figur 1. En oversigt over protokollens afsnit 1 er vist i figur 2 og en oversigt over afsnit 2 i figur 3. Virkningen af kasugamycin på mykobakteriel forkert oversættelse er vist i figur 4, målt ved renilla-Firefly-journalist systemet. For at vise specificiteten af kasugamycin-aktionen blev indberetteren også udtrykt i en stamme af M. smegmatis , hvor ksga blev slettet (∆ ksga). KsgA er en rRNA dimethyltransferase, og ksga-slettede stammer er relativt resistente over for kasugamycin. Kasugamycin-virkningen på forkert oversættelse blev også målt ved hjælp af nluc/gfp-indberetteren, som vist i figur 5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig1.jpg"> Figur 1 : Cartoon illustrerer de to gevinst-of-Function reporter systemer. (A) renilla-Firefly-reporter systemet består af to luciferaseenzymer udtrykt som et fusionsprotein og under kontrol af en tetracyclin-inducerbar promotor. Udtryk af Wild-type Dual enzym resulterer i høj målbar aktivitet af både Renilla og Firefly luciferases (top). Mutation af en kritisk aspartatrest, D120, i renilla til asparagin gør renilla enzym (D120N) inaktiv, men Firefly luciferase er stadig aktiv. Mistranslation af asparagin til aspartat (i dette tilfælde fra fysiologisk misacyleret ASP-tRNAASN tRNA5,21) resulterer i en lille del af de oversatte renilla -proteiner, der vinder aktivitet, der kan måles. Sammenligning af Renilla/Firefly-aktiviteten hos den muterede reporter sammenlignet med det vilde dobbelt enzym gør det muligt at beregne asparaginen til en aspartat-mistransationsrate. B) NLUC/gfp-journalist systemet opererer på et lignende princip. Det muterede Nluc (D140N)-gen har et N-terminalsekretions signal afledt af antigen 85A, et stort udskilt mykobakterielt protein. Både nluc -og gfp -gener udtrykkes fra identiske tetracyklin-inducerbare promotorer for at tillade anvendelse af gfp som et relativ udtryks benchmark. Bemærk manglen på Wild-type nluc kontrol stamme: denne reporter er primært anvendes i screening, hvor målinger af relative forkert oversættelse satser er tilstrækkelige til den primære skærm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig2.jpg"> Figur 2 : Skitsering af mistransationsraten ved hjælp af renilla-Firefly reporter (afsnit 1 i protokollen). Friske kulturer af M. smegmatis, omdannes med en plasmid, der udtrykker den dobbelte-luciferase journalister, er vokset. Indberetteren udtryk er induceret, og testpræparater forbindelser eller betingelser er testet. Efter 4-6 h af reporter udtryk, er kulturerne pelleteret og lyseret og lysaterne testes for dual-luciferase aktivitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig3.jpg"> Figur 3 : Skitse til måling af mistransationsraten Nluc-GFP-reporter (protokollens afsnit 2). En frisk kultur af M. smegmatis, forvandlet med NLUC og gfp reportere, er vokset til et tilstrækkeligt volumen for alle de plader, der skal testes (forudsat ~ 10 ml/96-Well plade). Umiddelbart før pipettering bakterien kultur i hver brønd, inducere udtrykket af reportere med ATC føjet til bulk kultur. Inkubeter brøndene ved at ryste dem natten over. At måle den relative forkert oversættelse satser, overføre kulturerne til en sort plade (for at øge følsomheden af fluorescens detektion), måle gfp fluorescens, og derefter spinde pladerne ned for at pille bakterierne. Supernatanten overføres til en hvid plade til måling af Nluc-aktivitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig4.jpg"> Figur 4 : Repræsentativt resultat af brug af renilla-Firefly-reporter, der måler mistransationsraten ved tilstedeværelse af kasugamycin i forskellige stammer. Mistransationsrater af aspartat for asparagin i (a) vildtype M. smegmatis og (B) en stamme, der er slettet for ksga (∆ ksga) efter behandling med kasugamycin (KSG) målt ved renilla-Firefly Dual Reporter. Kulturerne blev behandlet med kasugamycin ved indikerede doser (i mikrogram/milliliter) i 6 timer før celle lysis og målinger. De korrigerede ren/FF-forhold (y-akser) er tegn på aspartat for asparaginmistransationsrater. Sletningen af ksga resulterer i en højere baseline forkert oversættelse sats, som er mere modstandsdygtig over for graduering af kasugamycin. Søjlerne angiver middelværdien med standardafvigelsen som fejl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig5.jpg"> Figur 5 : Repræsentativt resultat af brug af Nluc-GFP-reporter, der måler mistransationsraten ved tilstedeværelse af kasugamycin. Relative mistransationsrater for aspartat for asparagin i vildtype M. smegmatis målt ved NLUC/gfp-reporter efter behandling med kasugamycin (KSG) natten over (16 timer). Søjlerne angiver middelværdien med standardafvigelsen som fejl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems at JoVE.com

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

I denne artikel præsenterer vi to komplementære metoder til at måle specifikke rater af translationel fejl og forkert oversættelse i modellen Mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, ved hjælp af Gain-of-funktion reporter systemer. Metoderne kan anvendes til at måle nøjagtige fejlprocenter ved lav gennemløb eller relative fejlrater i en mere høj overførselshastighed.

Måling af specifikke mykobakterielle Mistranslation rater med Gain-of-funktion reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

Proteinsyntese er fejlbehæftet. Men, fejl kan være adaptive under fysiologisk stress. Vi har tidligere vist, at specifikke oversættelsesfejl i mycobacterium er bidraget til antibiotikatolerance.At være i stand til at måle specifikke fejlprocenter giver os mulighed for at målrette denne bakterier-adaptive mekanisme. De vigtigste fordele ved disse teknikker er gain-of-function reportere kan være udsøgt følsomme i måling af små fejlprocenter, der ikke er let at opdage ved massespektrometri. Nluc/GFP-analysen muliggør screening for mellemløb, da den undgår overdreven håndtering og lysis af bakterierne.Demonstration af proceduren vil være ph.d.-studerende Yue-Meng Chen. I dag vil vi demonstrere proceduren for at bruge disse to journalister gennem denne video. Til at begynde, vaccinere to milliliter 7H9 medium med vilde-type og muteret mycobakterielle reporter stammer.Ryst ved 37 grader Celsius i en til to dage, eller indtil OD ved 600 nanometer når den stationære fase. Aliquot og fortyndes for at opnå en OD ved 600 nanometer omkring 0,5 til 1. Derefter tilsættes ATC til en endelig koncentration på 50 nanogram pr. milliliter.Straks tilføje forskellige doser af ksg til kulturen i henhold til manuskriptet til at måle dens virkninger på fejloversættelse satser. Inkubere ved 37 grader Celsius med rystelser i fire til seks timer. Dernæst overførebakteriske kulturer til en to milliliter rør.Og centrifuge på 3, 220 gange g ved stuetemperatur i fem minutter for at pellet ned bakterierne. Efter centrifugeringstrinnet kasseres supernatanten, og bakterierne forstyrres ved at tilsætte 40 mikroliter 1x passiv lysisbuffer. Overfør den resuspenderede bakterielle lysate til en hvid 96-brønd plade, en brønd pr prøve, og ryst ved stuetemperatur i 20 minutter.Tilføj 80 mikroliter af firefly substrat til hver brønd. Ryst i 15 sekunder, og luminescensen måles med et luminometer. Derefter tilsættes 80 mikroliter af Renilla substrat til hver brønd.Ryst i 15 sekunder, og luminescensen måles ved hjælp af luminometeret. Brug de korrigerede værdier til at beregne fejloversættelsesraterne for hver betingelse. Til at begynde, vaccinere to milliliter 7H9 medium med bakteriel reporter stamme.Ryst ved 37 grader Celsius i en til to dage, eller indtil OD ved 600 nanometer når den stationære fase. Derefter subkultur i 50 milliliter 7H9 medium og vokse indtil OD ved 600 nanometer når den sene stationære fase. Før aliquoting bakterierne til en 96-brønd plade, tilsæt ATC ved en endelig koncentration på 50 nanogram per milliliter og bland godt.Tilføj 100 mikroliter pr. brønd til en klar, rundbundet 96-brøndplade. Dernæst tilføje forskellige doser af ksg til udvalgte brønde til at screene dens virkninger på fejloversættelse satser. Der tilsættes 200 mikroliter sterilt vand til pladens kantbnde for at begrænse fordampningen fra prøveblydene.Forsegle pladen, ryste, og fremkalde prøverne ved 37 grader Celsius i 16 til 20 timer. Brug en multikanalpipette til at tage 80 mikroliter fra hver brønd. Overfør prøverne til en sortbundet 96-brøndplade, og mål luminometerets GFP-signal.Efter måling af GFP-signalet centrifugeres pladen ved 3,220 gange g i 10 minutter. Derefter overføres 50 mikroliter af supernatanten til en hvidbundet 96-brøndplade. Derefter tilsættes 50 mikroliter af Nluc substrat til hver brønd.Bland godt og mål luminescensen ved luminometeret. Endelig skal nluc/GFP-forholdet bestemmes ved at dividere den korrigerede Nluc luminescensværdi med GFP-fluorescens. I dette arbejde blev Renilla firefly reporter-systemet brugt til at måle fejloversættelseshastigheden i nærvær af kasugamycin i vild type og i en stamme af S.Smegmatis, som ksgA blev slettet.Resultaterne viste en klar dosisafhængig måde ksg faldende fejloversættelseshastighed, mens ksg i ksgA-sletningsstammen var mindre potent, og baseline for fejloversættelseshastighed var højere på grund af kasugamycins modstandsdygtighed over for modulering. Kasugamycin-indsatsen mod fejloversættelse blev også målt ved hjælp af Nluc/GFP-reporteren. Både Renilla firefly og Nluc/GFP reporter involverer måling af luciferase aktivitet.Små pipetteringsfejl kan forårsage store udsving i udlæsninger. Til at begynde med foreslår vi at øge antallet af hver replikater for at minimere risikoen for at få upålidelige udlæsninger.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Måling af γHV68 infektion i Mus

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Effektiv Rekombinant Parvovirus Produktion ved hjælp af adenovirusafledte Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Undersøgelse af fagolysosomet Biogenese i Live makrofager

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Visualisering af IL-22-udtrykkende Lymfocytter Brug Reporter Mus

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse af lymfocyt Ekstravasation Ved anvendelse af en<em&gt; In vitro</em&gt; Model af humant blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberkulose i mus med Reporter enzym fluorescens

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

CRISPR-Cas9-baseret genom Engineering til at generere Jurkat Reporter modeller for HIV-1 infektion med udvalgte Proviral Integration websteder

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Anvendelse af konsekvente massage lignende forstyrrelser på muse kalve og overvågning af de resulterende intramuskulære trykændringer

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...