Name: measurement of specific mycobacterial mistranslation rates with gain-of-function reporter systems
Uploaded: 2019-04-26T13:30:00
Duration: 6 min 18 s
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Diese Arbeit wurde zum Teil durch Stipendien der Bill and Melinda Gates Foundation (OPP1109789), der National Natural Science Foundation of China (31570129) und Start-up-Fonds der Tsinghua University School of Medicine zu B.J. B.J. unterstützt. Ermittler (207487/Z/17/Z).

1. Renilla-Firefly Dual-luciferase Reporter
NOTE: Eine visuelle Darstellung dieser Methode finden Sie in Abbildung2.
<ol><li>Inoculate mycobacterial reporter Stämme von-80 ° C Bestand mit 2 ml von 7H9-Medium. Wild-Typ-Dual-Luciferase sowie mutierte Renila-Stämme (Reporter) müssen verwendet werden, um die Berechnung von Fehlerungsraten zu ermöglichen (siehe Schritt 1.7). Schütteln Sie bei 37 ° C 1bis 2 Tage , bis OD 600 die stationäre Phase erreicht (OD > 3).</li>
	<li>Aliquot und verdünnen zu OD600nm um 0,1-0,5. Verwenden Sie für typische Experimente drei unabhängige biologische Replikationskulturen. Anhydrotetracycline (ATC), ein tetracycline analoger Indukteur des Reporter-Ausdrucks (der von einem tetracycline-induzierbaren Promoter gesteuert wird) zu einer Endkonzentration von 50 ng/mL.</li>
	<li>Um die Auswirkungen von Kasugamycin auf die Fehlerrate 21zu messen, fügen Sie der Kultur verschiedene Dosen von Kasugamycin zur gleichen Zeit hinzu (siehe Abbildung 4 für die angezeigten Dosen) zur gleichen Zeit (bei den getesteten Dosen hat Kasugamycin keine antimikrobielle Aktivität). Beachten Sie, dass es wichtig ist, mindestens eine nicht induzierte Kontrolle für jeden Reporter einzubinden. Kulturinduzierkulturen für 4-6 h bei 37 ° C mit Schütteln.</li>
	<li>Übertragen Sie die Bakterienkulturen in ein 2 mL Rohr und Zentrifuge mit 3.220 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um die Bakterien abzuwerfen. Den Supernatant abwerfen.</li>
	<li>Stören Sie die Bakterien, indem Sie 40 μL 1x passiver Lysepuffer (geliefert durch ein Dual-Luciferase-Kit) hinzufügen, der in doppelt destilliertem Wasser verdünnt wurde (1:1). Übertragen Sie das wiederaufgenähte Bakterienlysat auf eine weiße 96-Brunnenplatte, eine gut pro Probe, und schütteln Sie bei Raumtemperatur für 20 min. CAUTION: Die Bakterien im Lysepuffer nicht überinkeln (mehr als 30 min).</li>
	<li>Fügen Sie jedem Brunnen 80 μL firefly Substrat hinzu, schütteln Sie 15 s und messen Sie die Lumineszenz mit 1000 ms als Integrationszeit. Verwenden Sie entweder einen automatisierten Injektor oder eine Multichannel-Pipette, um Pipettierfehler zu vermeiden.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Brunnen 80 μL Renilla-Substrat hinzu, schütteln Sie 15 s und messen Sie die Lumineszenz mit einem Leuchtturm mit 1.000 ms als Integrationszeit.</li>
	<li>Subtrahieren Sie die Hintergrundleuumineszenz-gemessen entweder mit Wild-Typ M. Smegmatis (d.h. ohne Reportern) oder uninduzierten Reporter-Lysat-von den Messwerten. Verwenden Sie die korrigierten Werte, um die Fehlerungsraten jeder Erkrankung mit der folgenden Gleichung11,25zuberechnen, wo DN sich auf die Aktivität in der mutierten Reporter-Stammbeläge bezieht: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59453/59453eq1.jpg">
</li>
</ol>2. Nluc/GFP Reporter
NOTE: Eine visuelle Darstellung dieser Methode finden Sie in Abbildung3.
<ol><li>Den Bakterienreporter-Stamm von-80 ° C mit 2 ml 7H9-Medium verfeinern. Schütteln Sie bei 37 ° C 1bis 2 Tage , bis OD 600 die stationäre Phase erreicht (OD & gt;3).</li>
	<li>Subkultur bis 50 mL von 7H9-Medium und wachsen bisOD 600 erreicht die späte stationäre Phase (& gt;4).</li>
	<li>Bevor Sie die Bakterien auf eine 96-Brunnenplatte setzen, ATC bei einer Endkonzentration von 50 ng/mL hinzufügen und gut vermischen. Die Einführung der Massenkultur stellt sicher, dass alle Brunnen die gleiche Menge Induktionsmenge enthalten und dass die Induktion des Reporters synchronisiert wird. Die Bakterien auf eine klare, runde 96-Brunnenplatte mit jeweils 100 μL Volumen ausrichten.</li>
	<li>Um für kleine Moleküle, die Fehlerraten beeinflussen, zu sehen, fügen Sie die Verbindung an der angegebenen Konzentration hinzu, um Brunnen auszuwählen. Für die Zwecke dieses Protokolls verwenden Sie kasugamycin (bei den in Abbildung5 angegebenen Dosen) als Illustration. Fügen Sie verschiedene Dosen von Kasugamycin hinzu, um Brunnen auszuwählen (jede Versuchsgruppe sollte mindestens zwei biologische Replikate enthalten).</li>
	<li>Schütteln und induzieren Sie die Proben bei 37 ° C für 16-20 h. NOTE: Man muss die Platte mit Folie abdichten. Außerdem müssen alle Kantenbrunnen mit mindestens 200 μL sterilem Wasser gefüllt werden, um die Verdunstung aus den Testbrunnen zu begrenzen.</li>
	<li>Nehmen Sie 80 μL von jedem Brunnen mit einer Multichannel-Pipette und übertragen Sie die Proben auf eine schwarze 96-Brunnenplatte (die die Fluoreszenzsignalmessung maximiert). Messen Sie das GFP-Signal per Leuchtometer mit 20 ms als Integrationszeit.</li>
	<li>Nach der Messung des GFP-Signals die Platte mit 3,220 x g für 10 min zentrifugen. 50 μL des Supernatants auf eine weiß-bodengebundene 96-Brunnenplatte (die die Lumineszenz-Signalmessung maximiert), 50 μL Nluc-Substrat zu jedem Brunnen hinzufügen, gut mischen, Und messen Sie die Lumineszenz mit einem Leuchtturm mit 1.000 ms als Integrationszeit.</li>
	<li>Bestimmen Sie das Nluc/GFP-Verhältnis, indem Sie die korrigierten Nluc-Lumineszenz-Werte durch GFP-Fluoreszenz teilen: Diese Maßnahme (in beliebigen Einheiten) ist ein relatives Maß an Aspartat zur Paragin-Fehlinterpretation.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+mistranslation:+friend+or+foe.">Protein mistranslation: friend or foe.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 355-362 (2014).</li><li>Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+misreading+in+Mycobacterium+smegmatis+increases+in+stationary+phase.">Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase.</a> Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).</li><li>Manickam, N., Nag, N., Abbasi, A., Patel, K., Farabaugh, P. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das hier beschriebene Protokoll kann für die Messung von Fehlerraten in einer Vielzahl von Organismen angepasst werden. Es gibt eine Reihe von Überlegungen, die bei der Anpassung des Protokolls an andere Systeme im Auge behalten werden sollten. Zunächst sollte der Zweck der Messung berücksichtigt werden. Für die exakte Messung von Fehlerraten mit Funktionsreportern ist (a) ein robuster Ausleseuntergang (z.B. enzymatische Funktion [in diesem Fall, Luciferase-Aktivität] mit einem breiten linearen Bereich erforderlich). Suchen Sie auch nach (b) einem Verlust der Funktionsmutation in einem kritischen Rückstand des Reporter-Proteins, der zu einem sehr signifikanten Funktionsverlust führt, unterhalb der erwarteten Fehlerrate. Wenn zum Beispiel die zu messende Fehlverfaltungsrate etwa 10-3/codon beträgt, muss der Verlust der Funktionsmutation mehr als 1.000-fach betragen; Ansonsten wird der untere Bereich der Fehlkommnisse nicht empfindlich erkannt. Schließlich ist für die genaue Messung der Fehlerraten mit Gain-of-Funktions-Reportern (c) ein robuster Benchmark-Reporter — in diesem Fall, firefly luciferase für Abschnitt 1 des Protokolls erforderlich. Idealerweise sollte der Benchmark-Reporter mit dem mutierten enzymatischen Reporter verschmolzen werden, um (in jeder Hinsicht) zu garantieren, dass sie beide in Gleichgewichtsverhältnissen ausgedrückt werden. Die Benchmark-(und Primarreporter-) Auslesung sollte robust sein, wenn es um Störungen in exponierten Umgebungen geht. Zum Beispiel ist die Fluoreszenz von stark typischer GFP sehr anfällig für Störungen durch Änderungen in pH28, so dass sie als Benchmark für die Messung von Fehlerraten in phagozytosierten Mykobakterien in Makrophagen, die in Makrophagen, die in Phagosomen, die unter dem pH 729 liegen. Auf der anderen Seite werden bei Anwendungen wie dem Screening von kleinen Molekülen die Reproduzierbarkeit der Messungen (d.h. Präzision, im Gegensatz zur Genauigkeit), die Minimierung der manuellen Handhabung und kleine Kulturbände. Die genauen Messungen der Fehlerraten sind weniger wichtig und können als Sekundärsassagen durchgeführt werden. Schließlich ist zu beachten, dass die in diesem Protokoll beschriebenen Reporter, basierend auf der enzymatischen Funktion von Luciferase-Enzymen, nur eine Verfallung einer bakteriellen Population bedeuten, aber keine Informationen über die Heterogenität von Einzelzellen geben können. Variation in der Fehlverwechselung. Angesichts der Bedeutung der Einzeller-Variabilität in adaptiven Phenotypen30,31,32, fluoreszierende Reporter für die Messung von Fehlkommnissen wurdenentwickelt12,33 , auch für die Messung der Fehlinterpretation in Mykobakterien5.
Nachdem man die Anforderungen für die Messung der Fehlinterpretation berücksichtigt hat, ist zu beachten, dass die genetischen Verwertungsreporter, wie in diesem Protokoll beschrieben, nur eine Art von Fehlinterpretation (d.h. eine Aminosäure-Substitution für einen messen können). Codon) pro Reporter. Für die Messung verschiedener Fehlkommentationsereignisse sind daher mehrere Reporter erforderlich. Zum Beispiel, für die Messung der Fehlinterpretation durch ribosomale Dekodierungsfehler von Beinahe-Cognitate-Codons durch lysyl-tRNA an einer Position, mindestens 16 Reporter sind 2,3,11erforderlich. Hochpräzise Massenspektrometrie und Bioinformatik ermöglichen die mögliche Identifizierung vieler verschiedener Arten von Fehlkommnissen gleichzeitig18; Diese Methoden sind aber auch mit Vorbehalten ausgestattet. In der Regel sind sie weniger genau als Gain-of-Funktions-Reporter. Darüber hinaus eignen sie sich, wie bereits erwähnt, weniger für den Nachweis bestimmter Arten von Fehlinterpretationen, nämlich solche, die mit einer nonenzymatischen Dehnung 23 vermischt werden könnten. Schließlich ist die Massenspektrometrie als Auslese-und Auslese-und Hochdurchsatz-Screening ungeeignet.
Für die Anpassung dieser Reporter und Protokolle zur Messung der Fehlinterpretation in anderen Systemen sind weitere Überlegungen eine robuste Ausdrucksweise des Reporters im gewünschten Modellsystem. Wir versuchten zunächst, das von Farabaugh und Kollegen entwickelte Dual-luciferase-System in unserem mycobacteriellen System ohne Änderungen zu verwenden, hatten aber keinen Erfolg, da es an Reporterausdruck fehlte. Eine umfangreiche Fehlersuche ergab, dass sowohl die Codon-Optimierung als auch eine geringfügige Sequenzänderung der Reporter erforderlich waren, um einen robusten Ausdruck25 zu ermöglichen (und siehe oben). Denkbar sei, dass für den Einsatz in anderen Systemen ähnliche Anpassungen der Reporter erforderlich wären.
Schließlich sollte über die Art der Verklätigung nachgedacht werden. Wenn es zum Beispiel notwendig ist, Stop-Codon-durchlesen zu messen (unsinnige Unterdrückung), muss der Verlust der Funktionsmutation des Stop-Codon innerhalb einer unkritischen Region des primären Reporter-Proteins 34 eingeführt werden. Andernfalls werden nur bestimmte Unsinn-Unterdrückungsereignisse gemessen, die die kritischen Rückstände (und damit die Reporterfunktion) wiedererlangen, durch den Test gemessen, was potenziell zu einer erheblichen Unterschätzung der wahren Fehlerrückerungsraten führen würde. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass translationale Fehler eine mögliche adaptive Rolle bei einer großen Anzahl von Organismen 1,12, 13,35spielen. Die Messung von Mistelveranstaltungen beschränkt sich aber noch immer auf eine kleine, wenn auch wachsende Zahl von Modellarten. Die Anpassung sensibler Methoden zur Messung von Fehlinterpretation hat das Potenzial, das Verständnis der Wissenschaftler für die Rolle von Übersetzungsfehlern in der Physiologie und Pathologie weiter zu verbessern.

Der Informationsfluss in der Molekularbiologie erfordert die Übersetzung von genetischen Informationen in funktionelle Proteine. Wie bei allen biologischen Systemen ist auch bei der Genübersetzung messbare Fehler. Schätzungen über die Fehlerraten in der Übersetzung werden in der Regel als etwa 1/10000 pro Codon angegeben (überprüft von Ribas de Pouplana et al.1). Die Fehlerquoten variieren jedoch stark, von weniger als 10-5 bis mehr als 0,5/Codon1,2, 3, 4,5. Die große Bandbreite der Fehlerquoten, die sich über mehr als drei Größenordnungen erstrecken, ist darauf zurückzuführen, dass Fehler aus mehreren Schritten des Übersetzungsweges entstehen können: Aus stochastischen, mutationalen oder stressbedingten Fehlern in der Aminoakylierung6, 7 , 8 , 9 , 10, physiologische Fehlakylierung von Spargel-und Glutaminyl-TRNAs5, oder ribosomale Dekodierungsfehler2, 3,11. Gemessen sind hohe Fehlerraten, die mehr als 0,halb-codon darstellen, darauf hindeuteten, dass translationale Fehler physiologische Funktionen1,12 ausführen können und dass dieFehlinterpretation kontextspezifisch sein kann.
Wir und andere haben gezeigt, dass natürlich auftretende Fehler in der Gen-Übersetzung anpassungsfähig sein können, besonders bei Umweltbelastung1,5,12, 14,15,16 ,17,18. Bei Mykobakterien führen Fehler, die durch den zweistufigen indirekten Glutamine/Spargel tRNA-Aminoacylationsweg19,20 entstehen, zu einer bemerkenswert erhöhten Toleranz gegenüber dem ersten Antituberkulose-Antibiotikum Rifampicin 5. Deshalb spekulierten wir, dass die abnehmende mycobakterielle Fehlinterpretation mit einem kleinen Molekül das Töten durch Rifampicin potenzieren kann. Wir untersuchten und identifizierten das natürlich vorkommende Aminoglykosider Kasugamycin als eine Verbindung, die mycobakterielle Miumaltung verringern könnte, das Rifampicin-vermittelte Töten von Mykobakterien sowohl in vitro als auch in vivo21 potenzierenund die Entstehung von Rifampicin-Widerstand21, der die globale Kontrolle von Tuberkulose 22 bedroht — der tödlichste Erregerder Welt.
Um translationale Fehler zu untersuchen, müssen Methoden zur Messung der Verfremdung eingesetzt werden. Es gibt mehrere Methoden, die für die Messung der Verfremdung entwickelt wurden, jede mit Vor-und Nachteilen. Kurz gesagt, Präzisionsmassenspektrometrie-basierte Methoden haben mehrere Vorteile, von denen die wichtigste ist, dass mit neueren Algorithmen zur Erkennung von mehreren Arten von Übersetzungsfehler, eine relativ unvoreingenommene Messung der Fehlinterpretation sein kann Aufgeführt 18. Die Massenspektrometrie eignet sich jedoch nicht besonders für die Messung von Degamidations-Mulnisereignissen — genau die Art der Fehlinterpretation, die bei Mykobakterien durch den fehleranfälligen indirekten TRNA-Aminoacylierungspfad auftritt. Dies liegt an der hochfrequenten nichtenzymatischen Dehnung, die bei der Bearbeitung von Proben für die Massenspektrometrie23auftritt, was zu einem extrem hohen Hintergrundsignal führt. Für die Erkennung von Fehlern auf diesem Weg bieten genetische Funktionsreporter daher deutliche Vorteile. Konkret können geeignete Gain-of-Funktions-Reporter extrem niedrige Hintergrundraten aufweisen, was die Messung sehr niedriger Fehlerquoten11ermöglicht.
Da Experimente mit pathogenen Mycobacterium tuberculosis spezialisierte Einrichtungen und zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen erfordern, führen wir die meisten Experimente im nichtpathogenen Mycobacterium M. Smegmatis durch — und haben schon früher gezeigt, dass Die Ergebnisse zwischen den beiden Arten sind im GroßenundGanzenvergleichbar 5,21. Um die Fehlerrissen-Raten von Mykobakterien zu messen, die durch den indirekten TRNA-Aminoacyliationsweg erzeugt wurden, haben wir ein Renila-Doppelluziferase-System modifiziert, das zuvor entwickelt worden war, um ribosomale Dekodierungsfehler in E. coli zu messen. 11 für den Einsatz in Mykobakterien. Wir haben drei konkrete Änderungen vorgenommen: Der ursprüngliche Reporter äußerte sich nicht effizient in Mykobakterien, und daher war die Sequenz mit Kabeljau optimiert, und das C-Terminal drei Aminosäuren der Firefly luciferase, Serine-Lysine-Leucin, die In einigen Systemen24als Schlepper-Signal kommentiert, wurde er zu Isoleucine-Alanin-Valine25modifiziert. Der ursprüngliche Reporter hatte einen kritischen Lysin-Rückstand in der firefly luciferase mutierte. Stattdessen mutierten wir entweder ein kritisch konserviertes Aspartat (D120) oder Glutamat (E144), der in der Renilla-Luciferase zu Spargel und Glutamin bzw. 25 (Abbildung1) zurückgeht. Der Reporter wurde in den bischöflichen Tetracycline-induzible Plasmid-PUV-tetOR unterklatscht (siehe Materialtabelle). Die funktionsfähigen Reporter mutieren kritisch konservierte Funktionsreste in enzymes-/fluoreszierenden Proteinen, die sie nicht funktionsunfähig machen11,26. Übersetzliche (oder theoretisch transkriptionale) Fehler, die die funktionelle Variante des Proteins synthetisieren, würden zu einer messbaren Enzymaktivität in einer Untergruppe von übersetzten Proteinen führen. Um die Variation im Proteinreichtum zu korrigieren, wird der mutierte Reporter mit einem funktionellen Protein versehen, das als Benchmark fungiert und eine genaue Quantifizierungder Gain-of-function 11 ermöglicht. Während der Renila-Spiegel-Dual-Luciferase-Reporter die genaue Messung bestimmter mykobändierischer Fehlerrissenraten 5,25 (Abbildung 2 und Abschnitt 1 des Protokolls) ermöglichte, sind wir schnell Erkannte, dass es nicht geeignet ist für eine medium/Hochdurchsatz-Screening von Molekülen, die die Fehlerrate ändern würde. Dies ist vor allem auf zwei Gründe zurückzuführen, nämlich a) die relative Fettnische von Renilla luciferase bedeutete, dass ein Minimum von 1 ml mycobakterielle Kultur/Probe erforderlich war, um Fehlerraten zu messen, und b) die Forderung nach Lyse der Zellen vor Für die Messung der Enzymaktivität war eine übermäßige manuelle Handhabung erforderlich: Mykobacterzellen haben eine dicke und vielschichtige Zellwand und eine Hülle, die relativ lysebeständig ist. Deshalb haben wir nach einem neuen Gain-of-Funktions-Reporter-System gesucht, das mit kleinen Volumina (z.B. in einem 96-Brunnenplattensystem) eingesetzt werden kann und keine Zelllyse für Messungen benötigte. Wir verwendeten die hochpotente Nluc-Lluciferase und identifizierten einen kritischen Aspartatrückstand, der, wenn er zu Spargel mutiert war, zu 2 Stämmen Funktionsverlustführte (Abbildung 1). Darüber hinaus erlaubte die geringe Größe von Nluc es, ein N-Terminal-Sekretionssignal zu haben — von Antigen 85A, ein großes Sekret-Antigen in Mykobakterien 27 —, die es ermöglichen würde, Nluc in Kultur übernatant zu Secretion zu Sekretion zu verlegen und umgehen die Forderung nach Zelllyse. Das Benchmark-Protein GFP wurde vom gleichen Promoter wie der mutierte Nluc, aber von einem integrierten Vektor (siehe Materialtabelle) ausgedrückt und konnte in intakten Zellen 21 gemessen werden (Abbildung3). Trotz dieser Vorteile hat der Nluc/GFP-Reporter (Abschnitt 2 des Protokolls) auch Nachteile: Die relativ bescheidene Reduzierung der Nluc-Aktivität (100-fach) mit der D140N-Mutation würde die Messung extrem niedriger Fehlerungsraten nicht zulassen, Einen eignet sich der Reporter besser als Screening-Tool als für die exakte Messung von translationalen Fehlern. Darüber hinaus hat Nluc keine kritischen Glutamat-Rückstände; Demnach konnten nur Spargel-Fehlerraten gemessen werden. Die allgemeinen Prinzipien, die in dieser Arbeit beschrieben werden, sollten es Forschern ermöglichen, diese Reporter entweder so zu verwenden, wie wir es getan haben, oder Reportern zu modifizieren, die für eine genaue and/oder facile Messung anderer spezifischer translationaler Fehlerquoten in ihrem Modellsystem geeignet sind. die Wahl.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Middlebrook 7H9</td>
			<td style="width:103px;">BD Difco</td>
			<td style="width:136px;">271310</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">anhydrotetracycline</td>
			<td style="width:103px;">Cayman Chemical&#160;</td>
			<td style="width:136px;">10009542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">kasugamycin</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:136px;">K4013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Dual-luciferase reporter assay system</td>
			<td style="width:103px;">promega</td>
			<td style="width:136px;">E1960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nano-Glo luciferase assay</td>
			<td style="width:103px;">promega</td>
			<td style="width:136px;">N1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Fluoroskan Ascent FL luminometer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo</td>
			<td style="width:136px;">/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid</td>
			<td style="width:103px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:136px;">3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid</td>
			<td style="width:103px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:136px;">3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid</td>
			<td style="width:103px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:136px;">3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non-commercial reagents (plasmids)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:247px;">pUV-TetOR-RenFF</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:136px;">NA</td>
			<td style="width:169px;">episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">pUV-TetOR-Ren-D120N-FF</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>dual-luciferase reporter with mutated Renilla</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:247px;">pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:136px;">NA</td>
			<td style="width:169px;">episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:247px;">pMC1S-GFP</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:136px;">NA</td>
			<td style="width:169px;">Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of specific mycobacterial mistranslation rates with gain-of-function reporter systems

Die Übersetzung von Genen in Proteine ist fehleranfällig. Obwohl die durchschnittliche Rate von translationalen Fehlern in Modellsystemen auf 1/10000 pro Codon geschätzt wird, variieren die tatsächlichen Fehlerquoten stark, je nach Art, Umwelt und Codons, die untersucht werden. Wir haben bereits gezeigt, dass Mykobakterien einen zweistufigen Weg für die Erzeugung von aminoacylizinem Glutamin und Spargel-TRNAs verwenden und dass dies aufgrund der Modulation von Fehlerraten durch eine Wesentlicher Bestandteil des Weges, die Amidotransferase GatCAB. Wir modifizierten einzuvor eingesetztes Renila-Firefly-Dual-Luciferase-System, mit dem Fehlerraten in Escherichia coli gemessen wurden, um bestimmte Fehlerraten von Glutamat bei Glutamin zu messen. Codons und Aspartat für Spargel-Codons. Obwohl dieses Reportersystem für die exakte Abschätzung spezifischer Fehlerquoten geeignet war, war es aufgrund fehlender Empfindlichkeit und Anforderungen an übermäßige Manipulationsschritte für Anwendungen mit hohem Durchsatz ungeeignet. Deshalb haben wir ein zweites Gain-of-Funktions-Reporter-System entwickelt, das Nluc luciferase und grünes Leuchtstoffprotein (GFP) verwendet, das mehr für mittlere Hochdurchsatz-Einstellungen geeignet ist. Wir haben dieses System verwendet, um Kasugamycin als kleines Molekül zu identifizieren, das die mycobakterielle Fehlinterpretation verringern kann. Obwohl die Reporter, die wir hier beschreiben, verwendet wurden, um bestimmte Arten von mycobakterieller Fehlinterpretation zu messen, können sie modifiziert werden, um andere Arten von Verfälschung in einer Reihe von Modellsystemen zu messen.

In Abbildung1 ist eine Karikatur zu sehen, die die allgemeinen Umrisse der beiden Reportersysteme, die in dieser Arbeit verwendet werden, zeigt. Eine Übersicht über Abschnitt 1 des Protokolls ist in Abbildung 2 und eine Übersicht über Abschnitt 2 in Abbildung3 zu sehen. Die Wirkung von Kasugamycin auf die mycobacterielle Fehlinterpretation wird in Abbildung4 gezeigt, wie das Renilla-Firefly-Reportersystem misst. Um die Besonderheit der Kasugamycin-Aktion zu zeigen, wurde der Reporter auch in einer Sorte von M. Smegmatis zum Ausdruck gebracht, in der ksgA gelöscht wurde. KsgA ist eine rRNA-Dimethyltransferase, und die ksgA-gelöschtenStämme sind relativ widerstandsfähig gegen Kasugamycin. Die Kasugamycin-Aktion zur Verfremdung wurde auch mit dem Nluc/GFP-Reporter gemessen, wie in Abbildung5 gezeigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig1.jpg"> Bild 1 : Cartoon, der die beiden Funktionsreportersysteme illustriert. (A) Das Renilla-Firefly-Reporter-System besteht aus zwei Luciferase-Enzymen, die als Fusionsprotein ausgedrückt werden und unter der Kontrolle eines Tetracycline-induzierbaren Promoters stehen. Die Expression des wilden Dual-Enzyms führt zu einer hohen messbaren Aktivität von Renilla und Firefly luciferases (oben). Die Mutation eines kritischen Aspartat-Rückstands, D120, in Renilla zu Spargel macht das Renilla-Enzym (D120N) inaktiv, aber firefly luciferase ist immer noch aktiv. Die Mistranslation von Spargel zu Aspartat (in diesem Fall aus physiologisch falsch akylierten Asp-tRNAAsn tRNA5,21)führt dazu, dass ein kleiner Teil der übersetzten Renilla-Proteine Aktivität gewinnt, Das kann man messen. Der Vergleich der Renilla/Firefly-Aktivität des mutierten Reporters im Vergleich zum wilden Dual-Enzym erlaubt die Berechnung des Spargels zu einer Aspart-Fehlranschreidrate. (B) Das Nluc/GFP Reportersystem arbeitet nach einem ähnlichen Prinzip. Das mutierte Nluc (D140N) Gen hat ein N-Terminal-Sekretionssignal, das von Antigen 85A abgeleitet wird, einem großen, abgelegenen mycobakteriellen Protein. Sowohl die nluc als auch die gfp-Gene werden von identischen Tetracycline-induzierbaren Promotern ausgedrückt, um die Verwendung von GFP als relativer Expressions-Maßstab zu ermöglichen. Beachten Sie den Mangel an Wild-Typ-Nluc-Kontrollstrahl: Dieser Reporter wird vor allem beim Screening eingesetzt, wo Messungen relativer Fehlerungsraten für den Primärbildschirm ausreichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig2.jpg"> Bild 2 : Skizze der Messung der Fehlerrate mit Renila--Firefly-Reporterin (Abschnitt 1 des Protokolls). Es werden frische Kulturen von M. smegmatisangebaut, die mit einem Plasmid verwandelt werden, das die Dual-Luciferase-Reporter ausdrückt. Der Reporter-Ausdruck wird induziert, und es werden Untersuchungsverbindungen oder-bedingungen getestet. Nach 4-6 h Reporter-Ausdruck werden die Kulturen gepolstert und lypisch gezaubert und die Lysaten auf Dual-Luciferase-Aktivität getestet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig3.jpg"> Bild 3 : Skizze der Messung der Fehlerrate Nluc-GFP Reporter (Abschnitt 2 des Protokolls). Eine frische Kultur von M. Smegmatis, die mit den Reportern Nluc und GFP umgewandelt wird, wird auf ein ausreichendes Volumen für alle zu prüfenden Platten angewachsen (Vorausgesetzt ~ 10 mL/96-well plate). Unmittelbar vor der Abpfügung der Bakterienkultur in jeden Brunnen, induzieren die Äußerung der Reporter mit ATC hinzugefügt, um die Massenkultur. Inkubieren Sie die Brunnen, indem Sie sie über Nacht schütteln. Um die relative Fehlverwechselung zu messen, übertragen Sie die Kulturen auf eine schwarze Platte (um die Empfindlichkeit der Fluoreszenzerkennung zu erhöhen), messen Sie die GFP-Fluoreszenz und drehen Sie dann die Platten nach unten, um die Bakterien zu plündern. Übertragen Sie das Supernatant auf eine weiße Platte für die Nluc Aktivitätsmessung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig4.jpg"> Bild 4 : Repräsentatives Ergebnis der Verwendung von Renilla-Firefly-Reporterin, die die Fehlerrutation in Anwesenheit von Kasugamycin in verschiedenen Stämmen misst. Fehlverwertungsraten von Aspartat für Spargel in (A) Wildtyp M. Smegmatis und (B) eine Sorte, die nach der Behandlung mit Kasugamycin (ksg), gemessen durch das Renila-Schwarz-Doppel-Dual, für ksgA ("ksgA") gelöscht wurde. Reporter. Die Kulturen wurden mit Kasugamycin bei angegebenen Dosen (in Micrograms/Milliliter) für 6 Stunden vor der Zelllyse und Messungen behandelt. Die korrigierten Ren/FF-Verhältnisse (y-Achsen) sind ein Indikator für das Aspartat für Spargel-Misterraten. Die Streichung von ksgA führt zu einer höheren Basismisierungsrate, die durch Kasugamycin widerstandsfähiger gegen Modulation ist. Die Balken geben die Mittelwerte an, wobei die Standardabweichung als Fehler gilt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig5.jpg"> Bild 5 : Repräsentatives Ergebnis der Verwendung von Nluc-GFP-Reportern, die die Fehlerrationsrate in Anwesenheit von Kasugamycin messen. Relative Fehlerrationsraten von Aspartat für Spargel in Wildart M. smegmatis , gemessen durch den Nluc/GFP-Reporter, nach der Behandlung mit Kasugamycin (ksg) über Nacht (16 Uhr). Die Balken geben die Mittelwerte an, wobei die Standardabweichung als Fehler gilt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

In diesem Artikel stellen wir zwei ergänzende Methoden vor, um spezifische Raten von translationalem Fehler und Fehlinterpretation im Modell mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, mitGain-of-Funktions-Reporter-Systemen zu messen. Die Methoden können eingesetzt werden, um genaue Fehlerraten bei geringem Durchsatz oder relative Fehlerraten in einer höheren Durchsatzeinstellung zu messen.

Messung spezieller mycobakterieller Mistranslation-Raten mit Funktionsfunktionen

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

Die Proteinsynthese ist fehleranfällig. Fehler können jedoch unter physiologischem Stress adaptiv sein. Wir haben bereits gezeigt, dass spezifische Übersetzungsfehler in Mycobacterium zur Antibiotikatoleranz beigetragen haben.Die Möglichkeit, bestimmte Fehlerraten zu messen, ermöglicht es uns, diesen bakterienadaptiven Mechanismus ins Visier zu nehmen. Die Hauptvorteile dieser Techniken sind, dass die Gain-of-Funktion-Reporter bei der Messung kleiner Fehlerraten, die durch Massenspektrometrie nicht leicht zu erkennen sind, exquisit sensibel sein können. Der Nluc/GFP-Assay ermöglicht das Mitteldurchsatz-Screening, da er eine übermäßige Handhabung und Lyse der Bakterien vermeidet.Demonstriert wird das Verfahren von Doktorand Yue-Meng Chen. Heute werden wir das Verfahren der Verwendung dieser beiden Reporter durch dieses Video demonstrieren. Zunächst impfen Sie zwei Milliliter 7H9 Medium mit wildtypigen und mutierten mykobakteriellen Reporterstämmen.Schütteln Sie bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Tage oder bis die OD bei 600 Nanometern die stationäre Phase erreicht. Aliquot und verdünnen, um eine OD bei 600 Nanometern um 0,5 bis 1 zu erhalten. Fügen Sie dann ATC zu einer Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter hinzu.Fügen Sie der Kultur sofort verschiedene Dosen von ksg nach dem Manuskript hinzu, um ihre Auswirkungen auf die Fehlübersetzungsraten zu messen. Bei 37 Grad Celsius mit Schütteln vier bis sechs Stunden bebrüten. Als nächstes übertragen Sie die Bakterienkulturen auf eine Zwei-Milliliter-Röhre.Und Zentrifuge bei 3, 220 mal g bei Raumtemperatur für fünf Minuten, um die Bakterien zu pellet. Nach dem Zentrifugationsschritt den Überstand entsorgen und die Bakterien stören, indem Sie 40 Mikroliter des 1x passiven Lysepuffers hinzufügen. Übertragen Sie das resuspendierte bakterielle Lysat auf eine weiße 96-Well-Platte, eine gut pro Probe, und schütteln Sie bei Raumtemperatur für 20 Minuten.Fügen Sie 80 Mikroliter Gallesubstrat zu jedem Brunnen hinzu. 15 Sekunden schütteln und die Lumineszenz mit einem Leuchtkraftmesser messen. Dann fügen Sie 80 Mikroliter Renilla Substrat zu jedem Brunnen.15 Sekunden schütteln und die Leuchtkraft am Luminometer messen. Verwenden Sie die korrigierten Werte, um die Fehlübersetzungsraten jeder Bedingung zu berechnen. Zunächst impfen Sie zwei Milliliter 7H9 Medium mit dem bakteriellen Reporterstamm.Schütteln Sie bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Tage oder bis die OD bei 600 Nanometern die stationäre Phase erreicht. Dann, Subkultur in 50 Milliliter von 7H9 medium und wachsen, bis die OD bei 600 Nanometern erreicht die späte stationäre Phase. Bevor Sie die Bakterien zu einer 96-Well-Platte aliquotieren, fügen Sie ATC mit einer Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter hinzu und mischen Sie sie gut.Fügen Sie 100 Mikroliter pro Brunnen zu einer klaren, runden 96-Well-Platte hinzu. Als nächstes fügen Sie verschiedene Dosen von ksg zu ausgewählten Brunnen hinzu, um ihre Auswirkungen auf die Fehlübersetzungsraten zu überprüfen. Fügen Sie 200 Mikroliter steriles Wasser in randbrunnen der Platte hinzu, um die Verdunstung aus den Probenbrunnen zu begrenzen.Versiegeln Sie die Platte, schütteln sie und induzieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für 16 bis 20 Stunden. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 80 Mikroliter aus jedem Brunnen zu nehmen. Übertragen Sie die Proben auf eine 96-Well-Platte mit schwarzem Boden und messen Sie das GFP-Signal am Luminometer.Zentrifugieren Sie nach der Messung des GFP-Signals die Platte 10 Minuten lang bei 3, 220 mal g. Dann 50 Mikroliter des Überstandes auf eine 96-Well-Platte mit weißem Boden übertragen. Dann fügen Sie 50 Mikroliter Nluc Substrat zu jedem Brunnen.Gut mischen und die Lumineszenz am Luminometer messen. Schließlich bestimmen Sie das Nluc/GFP-Verhältnis, indem Sie den korrigierten Nluc-Lumineszenzwert durch GFP-Fluoreszenz dividieren. In dieser Arbeit wurde das Renilla Firefly Reportersystem verwendet, um die Fehlübersetzungsrate in Gegenwart von Kasugamycin in Wildtyp und in einem Stamm von S.Smegmatis zu messen, die ksgA gelöscht wurde.Die Ergebnisse zeigten eine klare dosisabhängige Art und Weise der ksg abnehmenden Fehlübersetzungsrate, während ksg im ksgA-Deletion-Stamm weniger potent war und die Ausgangsbasis der Fehlübersetzungsrate aufgrund der Resistenz gegen Modulation durch Kasugamycin höher war. Kasugamycin-Aktion auf Fehlübersetzung wurde auch mit dem Nluc/GFP-Reporter gemessen. Sowohl Renilla Firefly als auch Nluc/GFP Reporter beinhalten die Messung der Luziferase-Aktivität.Kleine Pipettierfehler können große Schwankungen bei den Auslesungen verursachen. Zunächst einmal empfehlen wir, die Anzahl der einzelnen Replikationen zu erhöhen, um die Wahrscheinlichkeit zu minimieren, dass unzuverlässige Auslesungen erhalten werden.

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