Name: measurement of specific mycobacterial mistranslation rates with gain-of-function reporter systems
Uploaded: 2019-04-26T13:30:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems at JoVE.com

עבודה זו היתה בחלק נתמך על ידי מענקים מקרן ביל ומלינדה גייטס (OPP1109789), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31570129), והתחל כספים מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת Tsinghua כדי ג'יי ג'יי הוא אמון ברוכים ה חוקר (207487/Z/17/ז).

1. רנלה-גחלילית כפולה לוציפראז כתב
הערה: לקבלת ייצוג חזותי של שיטה זו, ראה איור 2.
<ol><li>אינוייחסן העיתונאי מפטרת זנים מ-80 מלאי ° c עם 2 מ ל של 7H9 בינוני. פראי סוג הלוציפראז כפול, כמו גם Renilla מוטציה (עיתונאי) זנים, צריך לשמש כדי לאפשר את החישוב של שיעורי טעויות (ראה שלב 1.7). ללחוץ על 37 ° c עבור 1 עד 2 ימים עד OD600 מגיע השלב הנייח (OD > 3).</li>
	<li>הורדה ולדלל כדי OD600nm סביב 0.1-0.5. עבור ניסויים טיפוסיים, השתמש בשלוש תרבויות עצמאיות של שכפול ביולוגי. Anhydrotetracycline (האווירית), טטרציקלין אנלוגי של ביטוי הכתב (אשר נשלט על ידי inducible מיזם טטרציקלין) לריכוז הסופי של 50 ng/mL.</li>
	<li>כדי למדוד את ההשפעות של קסוגממיצין על טעויות שיעורי21, להוסיף מינונים שונים של קסוגממיצין לתרבות (ראה איור 4 עבור מינונים המצוין) באותו זמן (במינון נבדק, קסוגממיצין אין פעילות מיקרוביאלית). שים לב שחשוב לכלול לפחות פקד אחד שאינו מושרה עבור כל עיתונאי. תרביות לגרום לתרבות עבור 4-6 h ב 37 ° צ' עם רעד.</li>
	<li>להעביר את התרבויות החיידקי לצינור 2 מ"ל, ו צנטריפוגה ב 3,220 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להוריד את החיידקים. . מחק את הסופרנטאנט</li>
	<li>לשבש את החיידקים על ידי הוספת 40 μL של 1x מאגר לפירוק פסיבי (שסופקו על ידי ערכת כפולה לוציפראז), אשר כבר מדולל (1:1) מים כפולים מזוקקים. העבר את החיידק מושעה מחדש ללוח 96 לבן-באר, אחד טוב לכל מדגם, ולנענע בטמפרטורת החדר עבור 20 דקות. זהירות: אין להתגבר על החיידקים במאגר הליזה (במשך יותר מ -30 דקות).</li>
	<li>הוסף 80 μL של המצע גחלילית לכל טוב, לנער עבור 15 s, ולמדוד את האור על ידי לומימטר עם 1,000 ms כמו זמן אינטגרציה. השתמש או מזרק אוטומטי או בפיפטה רב ערוצי כדי למנוע שגיאות ליטוף.</li>
	<li>הוסף 80 μL של המצע Renilla לכל טוב, לנער עבור 15 s, ולמדוד את האור על ידי לומימטר עם 1,000 ms כמו זמן אינטגרציה.</li>
	<li>הפחת את מאור הרקע שנמדד באמצעות מסוג M. סמיגטיס (כלומר, לא מכיל כתבים) או כתב לא מושרה-מהערכים הנמדדים. השתמש בערכים המתוקנים כדי לחשב את התעריפים הטעויות של כל תנאי באמצעות המשוואה הבאה11,25, כאשר DN מתייחסת לפעילות במאמץ העיתונאי המוטציה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59453/59453eq1.jpg">
</li>
</ol>2. nluc/כתבת GFP
הערה: לקבלת ייצוג חזותי של שיטה זו, ראה איור 3.
<ol><li>איחסן העיתונאי החיידקי להתאמץ מ-80 מלאי ° c עם 2 מ ל של 7H9 בינוני. ללחוץ על 37 ° c עבור 1 עד 2 ימים עד OD600 מגיע השלב הנייח (OD > 3).</li>
	<li>תת-תרבות ל 50 mL של 7H9 בינונית ולגדול עד OD600 מגיע לשלב מאוחר נייח (> 4).</li>
	<li>לפני שאתה מצטט את החיידקים לצלחת 96-באר, להוסיף האווירית בריכוז סופי של 50 ng/mL ומערבבים היטב. אינדוקציה של התרבות הגורפת מבטיח כי כל הבארות מכילים את אותה כמות של אינדוקציה וכי האינדוקציה של העיתונאי מסונכרן. מחלק את החיידקים כדי ברור, התחתית עגול 96-צלחת, עם 100 μL של נפח בכל טוב.</li>
	<li>על המסך עבור מולקולות קטנות המשפיעים על שיעורי טעויות, להוסיף את המתחם על הריכוז המצוין כדי לבחור בארות. למטרות פרוטוקול זה, השתמש בקסוגממיצין (במינונים המצוינים באיור 5) כאיור. הוסף מינונים שונים של קסוגממיצין כדי לבחור בארות (כל קבוצה ניסיונית צריכה להכיל לפחות שני משכפל ביולוגי).</li>
	<li>לנער ולזרז את הדגימות ב 37 ° c עבור 16-20 h. הערה: יש צורך לאטום את הצלחת בסרט. כמו כן, כל הבארות קצה צריך להתמלא לפחות 200 μL של מים סטריליים כדי להגביל את האידוי מבארות הבדיקה.</li>
	<li>לקחת 80 μL מכל באר, באמצעות הפיפטה רב ערוצי, ולהעביר את הדגימות לצלחת שחור 96-באר (אשר מגדיל את מדידת אות הזריחה). מדוד את אות ה-GFP באמצעות לומימטר עם 20 אלפיות הזמן לאינטגרציה.</li>
	<li>לאחר מדידת האות GFP, צנטריפוגה את הצלחת ב 3,220 x g עבור 10 דקות. העברה 50 μl של supernatant ללבן תחתית 96-צלחת הבאר (אשר מגדיל את מדידת אות האור), להוסיף 50 μl של המצע nluc כל טוב, לערבב אותם היטב, ולמדוד את האור על ידי לומילומטר עם 1,000 ms כמו זמן אינטגרציה.</li>
	<li>קבע את היחס nluc/gfp על-ידי חלוקת ערכי האור הרגילים של nluc על-ידי הקרינה הפלואורסצנטית מתוקנת: מידה זו (ביחידות שרירותיות) היא מדד יחסי של אספרטט עבור אספרגין טעויות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+mistranslation:+friend+or+foe.">Protein mistranslation: friend or foe.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 355-362 (2014).</li><li>Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+misreading+in+Mycobacterium+smegmatis+increases+in+stationary+phase.">Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase.</a> Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).</li><li>Manickam, N., Nag, N., Abbasi, A., Patel, K., Farabaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+translational+misreading+in+vivo+show+that+the+ribosome+very+efficiently+discriminates+against+most+potential+errors.">Studies of translational misreading in vivo show that the ribosome very efficiently discriminates against most potential errors.</a> RNA. 20 (1), 9-15 (2014).</li><li>Netzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+and+chemically+triggered+oxidative+stress+modifies+translational+fidelity.">Innate immune and chemically triggered oxidative stress modifies translational fidelity.</a> Nature. 462 (7272), 522-526 (2009).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+mycobacterial+amidotransferase+GatCAB+is+a+modulator+of+specific+translational+fidelity.">The essential mycobacterial amidotransferase GatCAB is a modulator of specific translational fidelity.</a> Nature Microbiology. 1 (11), 16147 (2016).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+aminoacyl-tRNA+synthetases+editing-domain+mutations+that+cause+mistranslation+in+Mycoplasma+parasites.">Naturally occurring aminoacyl-tRNA synthetases editing-domain mutations that cause mistranslation in Mycoplasma parasites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9378-9383 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+editing+domain+functions+as+a+molecular+rheostat+to+control+codon+ambiguity+in+Mycoplasma+pathogens.">Leucyl-tRNA synthetase editing domain functions as a molecular rheostat to control codon ambiguity in Mycoplasma pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3817-3822 (2013).</li><li>Ling, J., Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+oxidative+stress+induces+protein+mistranslation+through+impairment+of+an+aminoacyl-tRNA+synthetase+editing+site.">Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4028-4033 (2010).</li><li>Raina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+amino+acid+specificity+of+mammalian+tyrosyl-tRNA+synthetase+is+associated+with+elevated+mistranslation+of+Tyr+codons.">Reduced amino acid specificity of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is associated with elevated mistranslation of Tyr codons.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li><li>Wu, J., Fan, Y., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+oxidant-induced+mistranslation+by+threonyl-tRNA+synthetase.">Mechanism of oxidant-induced mistranslation by threonyl-tRNA synthetase.</a> Nucleic Acids Research. 42 (10), 6523-6531 (2014).</li><li>Kramer, E. B., Farabaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+translational+misreading+errors+in+E.+coli+is+largely+determined+by+tRNA+competition.">The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition.</a> RNA. 13 (1), 87-96 (2007).</li><li>Evans, C. R., Fan, Y., Weiss, K., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+during+Gene+Expression:+Single-Cell+Heterogeneity,+Stress+Resistance,+and+Microbe-Host+Interactions.">Errors during Gene Expression: Single-Cell Heterogeneity, Stress Resistance, and Microbe-Host Interactions.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li><li>Mohler, K., Ibba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+fidelity+and+mistranslation+in+the+cellular+response+to+stress.">Translational fidelity and mistranslation in the cellular response to stress.</a> Nature Microbiology. 2, 17117 (2017).</li><li>Bullwinkle, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+cellular+amino+acid+pools+leads+to+cytotoxic+mistranslation+of+the+genetic+code.">Oxidation of cellular amino acid pools leads to cytotoxic mistranslation of the genetic code.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Stop+Codon+Readthrough+in+Single+Bacterial+Cells+and+Implications+for+Population+Fitness.">Heterogeneity of Stop Codon Readthrough in Single Bacterial Cells and Implications for Population Fitness.</a> Molecular Cell. 67 (5), 826-836 (2017).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+mistranslation+protects+bacteria+against+oxidative+stress.">Protein mistranslation protects bacteria against oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1740-1748 (2015).</li><li>Schwartz, M. H., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependent+mistranslation+in+a+hyperthermophile+adapts+proteins+to+lower+temperatures.">Temperature dependent mistranslation in a hyperthermophile adapts proteins to lower temperatures.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 294-303 (2016).</li><li>Schwartz, M. H., Waldbauer, J. R., Zhang, L., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tRNA+misacylation+induced+by+anaerobiosis+and+antibiotic+exposure+broadly+increases+stress+resistance+in+Escherichia+coli.">Global tRNA misacylation induced by anaerobiosis and antibiotic exposure broadly increases stress resistance in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. , (2016).</li><li>Curnow, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glu-tRNAGln+amidotransferase:+a+novel+heterotrimeric+enzyme+required+for+correct+decoding+of+glutamine+codons+during+translation.">Glu-tRNAGln amidotransferase: a novel heterotrimeric enzyme required for correct decoding of glutamine codons during translation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (22), 11819-11826 (1997).</li><li>Rathnayake, U. M., Wood, W. N., Hendrickson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+tRNA+aminoacylation+during+accurate+translation+and+phenotypic+mistranslation.">Indirect tRNA aminoacylation during accurate translation and phenotypic mistranslation.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 41, 114-122 (2017).</li><li>Chaudhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kasugamycin+potentiates+rifampicin+and+limits+emergence+of+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis+by+specifically+decreasing+mycobacterial+mistranslation.">Kasugamycin potentiates rifampicin and limits emergence of resistance in Mycobacterium tuberculosis by specifically decreasing mycobacterial mistranslation.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Toosky, M., Javid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+diagnostics+and+therapeutics+for+drug-resistant+tuberculosis.">Novel diagnostics and therapeutics for drug-resistant tuberculosis.</a> British Medical Bulletin. 110 (1), 129-140 (2014).</li><li>Robinson, N. E., Robinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deamidation+of+human+proteins.">Deamidation of human proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12409-12413 (2001).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urate+oxidase+is+imported+into+peroxisomes+recognizing+the+C-terminal+SKL+motif+of+proteins.">Urate oxidase is imported into peroxisomes recognizing the C-terminal SKL motif of proteins.</a> European Journal of Biochemistry. 223 (1), 141-146 (1994).</li><li>Javid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+mistranslation+is+necessary+and+sufficient+for+rifampicin+phenotypic+resistance.">Mycobacterial mistranslation is necessary and sufficient for rifampicin phenotypic resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 1132-1137 (2014).</li><li>Wong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+methylation+of+G518+of+the+16S+rRNA+530+loop+by+GidB+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Functional role of methylation of G518 of the 16S rRNA 530 loop by GidB in Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (12), 6311-6318 (2013).</li><li>Wiker, H. G., Harboe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antigen+85+complex:+a+major+secretion+product+of+Mycobacterium+tuberculosis.">The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis.</a> Microbiological Reviews. 56 (4), 648-661 (1992).</li><li>Roberts, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterisation+of+a+pH-stable+GFP.">Identification and Characterisation of a pH-stable GFP.</a> Scientific Reports. 6, 28166 (2016).</li><li>Li, H., Wu, M., Shi, Y., Javid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-Expression+of+the+Mycobacterial+Trehalose-Phosphate+Phosphatase+OtsB2+Results+in+a+Defect+in+Macrophage+Phagocytosis+Associated+with+Increased+Mycobacterial-Macrophage+Adhesion.">Over-Expression of the Mycobacterial Trehalose-Phosphate Phosphatase OtsB2 Results in a Defect in Macrophage Phagocytosis Associated with Increased Mycobacterial-Macrophage Adhesion.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1754 (2016).</li><li>Aldridge, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetry+and+aging+of+mycobacterial+cells+lead+to+variable+growth+and+antibiotic+susceptibility.">Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility.</a> Science. 335 (6064), 100-104 (2012).</li><li>Rego, E. H., Audette, R. E., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+a+mycobacterial+divisome+factor+collapses+single-cell+phenotypic+heterogeneity.">Deletion of a mycobacterial divisome factor collapses single-cell phenotypic heterogeneity.</a> Nature. 546 (7656), 153-157 (2017).</li><li>Zhu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rifampicin+can+induce+antibiotic+tolerance+in+mycobacteria+via+paradoxical+changes+in+rpoB+transcription.">Rifampicin can induce antibiotic tolerance in mycobacteria via paradoxical changes in rpoB transcription.</a> Nature Communications. 9 (1), 4218 (2018).</li><li>Lant, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+tRNA-dependent+mistranslation+in+human+cells.">Visualizing tRNA-dependent mistranslation in human cells.</a> RNA Biology. 15 (4-5), 567-575 (2018).</li><li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals.">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4 (4), 479-486 (1998).</li><li>Melnikov, S. V., van den Elzen, A., Stevens, D. L., Thoreen, C. C., Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+protein+synthesis+quality+control+in+host-restricted+organisms.">Loss of protein synthesis quality control in host-restricted organisms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מותאם למדידה של שיעורי טעויות במגוון רחב של אורגניזמים. יש מספר שיקולים שיש לזכור בעת התאמת הפרוטוקול למערכות אחרות. ראשית, יש לשקול את מטרת המדידה. עבור המדידה המדויקת של התעריפים הטעויות באמצעות כתבים של הגברה, מה שנדרש הוא (א) שיטת בדיקה איתנה (לדוגמה, פונקציה אנזימטית [במקרה זה, פעילות לוציפראז] עם טווח ליניארי רחב). כמו כן, לחפש (ב) אובדן של מוטציה פונקציה בשאריות קריטי של חלבון העיתונאי שתוצאתו אובדן משמעותי מאוד של הפונקציה, מתחת לקצב הצפוי של טעויות. לדוגמה, אם קצב הטעויות הצפוי נמדד כ-10-3/codon, ההפסד של מוטציה בפונקציה צריך להיות גדול מ-1,000-קיפול; אחרת, הטווח התחתון של אירועים טעויות לא יזוהה ברגישות. לבסוף, עבור המדידה המדויקת של התעריפים טעויות באמצעות כתבים הרווח לתפקד, (ג) כתבת בחינת ביצועים חזקה – במקרה זה, גחלילית ללוציפראז עבור סעיף 1 של הפרוטוקול. באופן אידיאלי, כתב בחינת ביצועים צריך להיות מחובר לכתב האנזימטי המוטציה, המבטיח (לכל הדעות והמטרות) ששניהם מבוטאים ביחס שווה. הבדיקה (והעיתונאי הראשי) צריכה להיות איתנה כדי לרטבאליות לסביבות חשופות. לדוגמה, הזריחה של מסוג פראי gfp הוא רגיש מאוד הפרטורציה על ידי שינויים ב-pH28, מה שהופך אותו בלתי מתאים בחינת ביצוע עבור המדידה של שיעורי טעויות בחיידקים phagocytosed ב מקרופאגים, אשר מתגוררים ב phagosomes כי הם מתחת pH 729. מצד שני, עבור יישומים כגון הקרנת מולקולה קטנה, השיקולים החשובים ביותר עבור המסך הראשי יהיה השגות של המידות (כלומר, דיוק, בניגוד לדיוק), מזעור של טיפול ידני, קטן כרכים לתרבות. המידות המדויקות של התעריפים הטעויות הינן פחות חשובות וניתן לבצעו כתנאי משני. לבסוף, יש לציין כי הכתבים המתוארים בפרוטוקול זה, מבוסס על תפקוד אנזימטי של אנזימים לוציפראז, רק למדוד ממוצע שיעורי טעויות של אוכלוסייה חיידקית, אבל לא יכול לתת מידע על תא יחיד טרוגניות וריאציה בקצבי טעויות. בהתחשב בחשיבות של השתנות תא בודד ב פנוטיפים גמישים30,31,32, כתבים פלורסנט למדידה של אירועים טעויות פותחו12,33 , כולל עבור מדידה של טעויות ב בפטרת5.
לאחר שנחשב את הדרישות למדידה של טעויות, יש לציין כי הכתבים הגנטי של הפונקציה כמתואר בפרוטוקול זה יכול רק למדוד סוג אחד של טעויות (כלומר, אחד החלפת חומצת אמינו עבור אחד codon) לכל עיתונאי. לכן, למדידה של אירועים טעויות שונים, נדרשים כתבים מרובים. לדוגמה, עבור המדידה של טעויות על ידי שגיאות פענוח הריבוזומבית של כמעט cognate coדונים על ידי lysyl-trna בתנוחה אחת, לפחות 16 כתבים נדרשים2,3,11. הספקטרומטר מסה בדיוק גבוה וביואינפורמטיקה מאפשרים זיהוי פוטנציאלי של סוגים שונים של אירועים טעויות בו18; עם זאת, שיטות אלה מגיעות גם עם אזהרות. באופן כללי, הם פחות מדויקים מאשר כתבים של הזכות לתפקד. יתר על כן, כפי שצוין קודם לכן, הם מתאימים פחות לאיתור סוגים מסוימים של טעויות, כלומר אלה שיכולים להיות מואבקים עם חוסר אנזימטיות של23. לבסוף, הספקטרומטר המסה אינו מתאים לקריאה עבור הקרנת בינונית או תפוקה גבוהה.
להתאמת כתבים ופרוטוקולים אלה למדידת טעויות במערכות אחרות, שיקולים נוספים כוללים ביטוי חזק של העיתונאי במערכת המודל הרצויה. בתחילה ניסינו להשתמש כפול לוציפראז מערכת שפותחה על ידי Farabaugh עמיתים ועמיתיו במערכת שלנו מפטרת ללא שינויים אבל לא היה הצלחה, בשל חוסר הביטוי כתב. פתרון בעיות נרחב המזוהה כי הן מיטוב והן שינוי רצף מזערי של הכתבים נדרשו כדי לאפשר ביטוי חזק25 (וראה לעיל). הדבר מתקבל על העובדה שעיבודים דומים של הכתבים יידרשו לשימוש במערכות אחרות.
לבסוף, יש להעניק שיקול לסוג האירוע הטעויות שנמדד. לדוגמה, אם יש צורך למדוד לעצור-codon קריאה (הדיכוי שטויות), הפסד של codon להפסיק של מוטציה פונקציה צריך להיות הציג בתוך אזור לא קריטי של הכתב הראשי חלבון34. אחרת, רק אירועים מסוימים של דיכוי שטויות שקיבלו מחדש את השאריות הקריטיות (ומכאן, הפונקציה העיתונאית) נמדדת על ידי האפשרות, אשר עלולה להוביל להערכה משמעותית של התעריפים הטעויות האמיתיים. יש הוכחה גוברת כי שגיאה טרנסלבותית משחק תפקיד אדפטיבית אפשרי במספר רב של אורגניזמים1,12,13,35. עם זאת, המדידה של אירועים טעויות הוא עדיין מוגבל למספר קטן, אם כי גדל של מינים מודל. הסתגלות של שיטות רגישות למדוד טעויות יש את הפוטנציאל להגדיל עוד יותר את ההבנה של המדענים של התפקיד של שגיאת תרגום בפיזיולוגיה ופתולוגיה.

זרימת המידע בביולוגיה מולקולרית דורשת תרגום של מידע גנטי לחלבונים פונקציונליים. כמו בכל מערכות ביולוגיות, תרגום גנטי כרוך גם שגיאות מדידה. הערכות של שיעורי השגיאה בתרגום מצוטטים בדרך כלל כ-1/10000 לכל קודון (ביקורת על ידי ribas דה pouפלנה ואח '1). עם זאת, שיעורי השגיאה משתנים במידה רבה, מפחות מ-10-5 ליותר מ-0.05/codon1,2,3,4,5. מגוון רחב של שיעורי שגיאה, המשתרעים על פני יותר משלוש הזמנות של סדר גודל, נובע מהעובדה ששגיאות יכולות לנבוע ממספר שלבים במסלול התרגום: משגיאות סטוכסטיים, מודסות, או שגיאות במצבי מתח בעמינח של הספר6, מיכל סבן , בן שמונה , מיכל בן 10 , 10, שגיאות פיזיולוגיות של asparaginyl-ו-glutaminyl-trnas5, או מפענח הריבוזומיום2,3,11. שיעורי שגיאה גבוהים למדי, המייצגים מעל 0.01/codon, הציע שגיאות טרנסלtional עשויות לבצע פונקציות פיזיולוגיות1,12 וכי טעויות עשוי להיות ספציפי להקשר13.
אנחנו ואחרים הראו כי באופן טבעי שגיאות בתרגום גנטי עשוי להיות מותאם, במיוחד במהלך הלחץ הסביבתי1,5,12,14,15,16 ,17,18. ב פטרת, שגיאות שנוצרו על ידי שני צעד עקיף גלוטמין/אספרגין trna עמינח מסלול19,20 התוצאה רגישות מוגברת להפליא עבור אנטיביוטיקה השורה הראשונה antituberculosis גריסופלובין 5. לכן, אנו העריכו כי הפחתת טעויות בקטריאליים עם מולקולה קטנה עשויה להיות פוטנציאל להרוג על ידי גריסופלובין. הוקרנו וזיהינו את החומר הטבעי המגליציאני בצורה טבעית, כתרכובת שעלולה להקטין את הטעויות החיידקים, מסוגל להרוג גריסופלובין-בתיווך הריגת בקטריות הן במבחנה והן בvivo-21, ולהגביל את ה הופעתה של גריסופלובין ההתנגדות21, אשר מאיימת על השליטה הגלובלית של שחפת22 -הפתוגן הקטלני ביותר בעולם.
כדי ללמוד שגיאה טרנסלבותית, שיטות למדידה של טעויות צריך להיות מועסק. ישנן מספר שיטות שפותחו למדידת טעויות, כל אחד עם יתרונות וחסרונות. בקצרה, שיטות מבוססות מאוד על המסה מבוססת על מספר יתרונות, החשובה ביותר היא כי עם אלגוריתמים חדשים יותר לאיתור סוגים מרובים של שגיאה translational, מדידה משוחדת יחסית של טעויות יכול להיות שבוצעה18. עם זאת, הספקטרומטר ההמוני אינו מתאים מאוד למדידה של טעויות אירועים בלתי-הולמים – בדיוק סוג הטעויות המתרחש בחיידק הנובע ממסלול הדרך העקיף של tRNA עמינח שגיאות. הסיבה לכך היא בתדירות גבוהה ובלתי אנזימטית, המתרחשת בעיבוד דגימות עבור ספקטרומטר המסה23, והתוצאה היא אות ברקע גבוה במיוחד. לכן, לאיתור שגיאות בנתיב זה, הרווח הגנטי כתבים הפונקציה מציעים יתרונות שונים. באופן ספציפי, כתבים בעלי תפקוד מתאים יכולים להיות בעלי שיעורי רקע נמוכים במיוחד, המאפשרים את המדידה של שיעורי שגיאה נמוכים מאוד11.
מאז ביצוע ניסויים עם השחפת הפתוגניים שחפת דורש מתקנים מיוחדים ואמצעי זהירות נוספים, אנו מבצעים את רוב הניסויים בפטרת שאינו פתוגניים M. סמיגטיס — והראו מוקדם יותר כי התוצאות בין שני המינים הן בהיקף רחב של5,21. כדי למדוד שיעורי טעויות בתוך פטרת שנוצר על ידי מסלול בלתי ישיר tRNA עמינח, שינו מערכת Renilla-גחלילית כפולה שפותחה בעבר כדי למדוד שגיאות פענוח הריבוזומבית E. coli 11 לשימוש בפטרת. עשינו שלושה שינויים ספציפיים: הכתב המקורי לא הביע ביעילות בפטרת, ולכן, הרצף היה ממוטב מאוד, ואת C-טרמינל שלוש חומצות אמינו של לוציט גחלילית, סרין-ליזין-leucine, אשר כבר מסומן כאות סחר בכמה מערכות24, שונה ל isoleucine-אלנין-valine25. לכתב המקורי היה שאריות ליזין קריטיים במקום זאת, אנו מוטציה או שמרו באופן ביקורתי (D120) או גלוטמט (E144) שאריות ב Renilla לוציפראז כדי אספרגין ו גלוטמין, בהתאמה25 (איור 1). העיתונאי היה משוכפל טטרציקלין האפיזומאין-inducible באמצע pUV-tetOR (לראות את הטבלה של חומרים). כתבים בעלי תפקוד מוטציה שמרו באופן ביקורתי על משקעים פונקציונליים בפרוטאינים של אנזימים/פלורסנט המעבדת אותם באופן שאינו פונקציונלי11,26. טרנסלליזם (או תיאורטית, באופן תיאורטי) שגיאות לסנתז את הגרסה הפונקציונלית של החלבון יגרום לפעילות אנזימים מדידה בקבוצת משנה של חלבונים מתורגמים. כדי לתקן את הווריאציה בשפע החלבון, הכתב המוטציה מבוטא בחלבון פונקציונלי הפועל בתור בחינת ביצועים ומאפשר כימות מדויקת של רווח של הפונקציה11. בעוד renilla-גחלילית כתב כפול לוציפראז מותר עבור מדידה מדויקת של שיעורי טעויות מסוימים מפטרת מסוים5,25 (איור 2 וסעיף 1 של הפרוטוקול), אנחנו מהר הבינו כי הוא אינו מתאים הקרנת בינונית/תפוקה גבוהה של מולקולות שישנה את קצב טעויות. זה נובע בעיקר שתי סיבות, כלומר, א ' העדר היחסי של העוצמה של Renilla לוציפראז התכוון כי מינימום של 1 מ ל של התרבות הפטרת/מדגם נדרש כדי למדוד שיעורי טעויות, ו b) הדרישה לפירוק התאים לפני למדידת פעילות האנזים נדרש טיפול ידני מוגזם: בתאי פטרת יש קיר עבה, רב שכבתית תא ומעטפה כי הוא עמיד יחסית לליזה. לכן, חיפשנו לפתח מערכת חדשה של העיתונאי הרווח, כי ניתן להשתמש עם כרכים קטנים (למשל, במערכת 96-הצלחת לוחית) ולא היתה צורך בפירוק תאים עבור מדידות. השתמשנו החזק ביותר nluc ללוציפראז וזיהה שאריות aspart קריטי כי, כאשר מוטציה אספרגין, הביא 2 יומני הפסד של פונקציה (איור 1). יתר על כן, גודל קטן של Nluc איפשר לו להיות מסוף N-טרמינל תג אות — מן אנטיגן 85 a, האנטיגן הגדול המופרש ב-פטרת בקטריה27 -זה יאפשר nluc להיות מופרש לתוך התרבות supernatant ולעקוף את הדרישה פירוק תאים. חלבון בחינת ביצועים, GFP, התבטא מיזם אותו כמו Nluc מוטציה, אבל מתוך וקטור משולב (לראות את הטבלה של חומרים), וניתן למדוד בתאים שלמים21 (איור 3). למרות יתרונות אלה, הכתב Nluc/GFP (סעיף 2 של הפרוטוקול) יש גם חסרונות: הפחתת צנוע יחסית בפעילות Nluc (100-קיפול) עם D140N מוטציה לא לאפשר את המדידה של שיעורי טעויות נמוך ביותר, הפיכת העיתונאי למתאים יותר ככלי הקרנה מאשר למדידות המדויקות של שגיאת הטרנסלבותית. יתר על כן, Nluc אין שאריות גלוטמט קריטי; לכן, ניתן למדוד רק שיעורי שגיאה אספרגין-to-aspartate. העקרונות הכלליים המתוארים בעבודה זו צריכים לאפשר לחוקרים להשתמש בכתבים האלה כפי שעשינו או לשנות כתבים בהתאם למדידה מדויקת ו/או מדידה של שיעורי שגיאה ספציפיים אחרים בשיטת המודל של רירה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Middlebrook 7H9</td>
			<td style="width:103px;">BD Difco</td>
			<td style="width:136px;">271310</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">anhydrotetracycline</td>
			<td style="width:103px;">Cayman Chemical&#160;</td>
			<td style="width:136px;">10009542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">kasugamycin</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:136px;">K4013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Dual-luciferase reporter assay system</td>
			<td style="width:103px;">promega</td>
			<td style="width:136px;">E1960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nano-Glo luciferase assay</td>
			<td style="width:103px;">promega</td>
			<td style="width:136px;">N1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Fluoroskan Ascent FL luminometer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo</td>
			<td style="width:136px;">/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid</td>
			<td style="width:103px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:136px;">3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid</td>
			<td style="width:103px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:136px;">3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid</td>
			<td style="width:103px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:136px;">3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Non-commercial reagents (plasmids)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:247px;">pUV-TetOR-RenFF</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:136px;">NA</td>
			<td style="width:169px;">episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">pUV-TetOR-Ren-D120N-FF</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>dual-luciferase reporter with mutated Renilla</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:247px;">pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:136px;">NA</td>
			<td style="width:169px;">episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:247px;">pMC1S-GFP</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:136px;">NA</td>
			<td style="width:169px;">Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of specific mycobacterial mistranslation rates with gain-of-function reporter systems

התרגום של גנים לחלבונים הוא נוטה לשגיאות. למרות ששיעור השינוי הממוצע במערכות מודל מוערך כ-1/10000 לכל codon, שיעורי השגיאה בפועל משתנים באופן נרחב, בהתאם למין, לסביבה ולמחקר. בעבר הצגנו כי בקטריה משתמשים מסלול שני שלבים עבור הדור של גלוטמין אספרגין tRNAs והוא משויך במיוחד עם שיעורי שגיאה גבוהה יחסית עקב אפנון של שיעורי טעויות על ידי רכיב חיוני של השביל. שנינו מועסק בעבר Renilla-גחלילית מערכת כפולה לוציפראז שנעשה שימוש כדי למדוד שיעורי טעויות ב es, coli לשימוש ב פטרת למדוד שיעורי טעויות מסוימים של גלוטמט ב גלוטמין בעלי-מאספרגין. למרות שמערכת עיתונאי זו התאימה להערכה מדויקת של שיעורי שגיאה ספציפיים, חוסר רגישות ודרישות עבור שלבי מניפולציה מוגזמת הפכו אותו למתאים ליישומים בעלי תפוקה גבוהה. לכן, פיתחנו מערכת רווח השני של הפונקציה הכתב, באמצעות Nluc לוציפראז וחלבון פלורסנט ירוק (GFP), אשר קלה יותר להגדרות בינונית/תפוקה גבוהה. השתמשנו במערכת זו כדי לזהות את קגממיצין כמולקולה קטנה שיכולה להקטין את טעויות בקטריות. למרות הכתבים שאנו מתארים כאן השתמשו כדי למדוד סוגים ספציפיים של טעויות בקטריאלי, הם עשויים להיות שונה כדי למדוד סוגים אחרים של טעויות במספר מערכות מודל.

קריקטורה המדגימה את המתאר הכללי של שתי מערכות העיתונאי המשמשות בעבודה זו מוצגות באיור 1. מבט כולל על סעיף 1 של הפרוטוקול מוצג באיור 2 ומבט כולל על סעיף 2 באיור 3. ההשפעה של קסוגממיצין על טעויות בקטריאלי מוצג באיור 4, כפי שנמדד על ידי מערכת הכתבת renilla-גחלילית. כדי להראות את הספציפיות של הפעולה של קאסגממיצין, העיתונאי גם התבטא בנבג של מ. סמגטיס שבהם נמחק ksga (∆ ksga). Ksga הוא מעביר דימתיל תיל, ו- ksgaשנמחקו זנים הם עמידים יחסית כדי קסוגממיצין. הפעולה של קסוגממיצין ב-טעויות נמדדה גם באמצעות כתב Nluc/GFP, כפי שמוצג באיור 5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig1.jpg"> איור 1 : הקריקטורה המדגימה את שתי מערכות העיתונאי הרווח. (א) המערכת העיתונאית renillaמורכבת משני אנזימים לוציפראז הביע חלבון היתוך תחת שליטה של מקדם טטרציקלין-inducible. ביטוי של האנזים כפול מסוג פראי תוצאות פעילות מדידה גבוהה של Renilla ו גחלילית לוציי (למעלה). מוטציה של שאריות אספרטט קריטי, D120, ב renilla כדי אספרגין מעבד את האנזים renilla (D120N) לא פעיל, אבל לוציו גחלילית עדיין פעיל. טעויות של אספרגין לאספרטט (במקרה זה, מבחינה פיזיולוגית, Asp-trnaAsn trna5,21) תוצאות חלק קטן של החלבונים renilla מתורגמת צובר פעילות, שניתן למדוד. השוואה של הפעילות Renilla/גחלילית של הכתב מוטציה לעומת האנזים כפול מסוג פראי מאפשר את החישוב של אספרגין טעויות rate. (ב) מערכת הכתב NLUC/gfp פועלת בעיקרון דומה. המוטציה Nluc (D140N) גן יש אות N מסוף הפרשת נגזר אנטיגן 85 a, חלבון מופרש הגדול המפריש. הן nluc ו- gfp גנים מבוטא טטרציקלין זהה-inducible היזמים, כדי לאפשר את השימוש ב-gfp כמו ביטוי יחסי ביצועים. שימו לב להיעדר זן פראי בקרת Nluc: עיתונאי זה משמש בעיקר בהקרנה, שם מדידות של שיעורי טעויות יחסיים מספיקים עבור המסך הראשי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig2.jpg"> איור 2 : חלוקה לרמות של מדידת שיעור טעויות באמצעות renilla-גחלילית כתב (סעיף 1 של הפרוטוקול). תרבויות טריות של מ. סמגטיס, שהפכו בעזרת פלסטלינה המבטאת את הכתבים הלוציתיים הכפולים, גדלו. הביטוי העיתונאי הוא המושרה, ותרכובות לבדיקה או תנאים נבדקים. בעקבות 4-6 h של ביטוי העיתונאי, התרבויות הם מחורץ ולאחר והליצטים נבדקים לפעילות לוציפראז כפול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig3.jpg"> איור 3 : חלוקה לרמות של מדידת הטעויות שיעור Nluc-GFP (סעיף 2 של הפרוטוקול). תרבות טרייה של מ. סמגטיס, הפכה עם הכתבים nluc ו-gfp, גדל לנפח מספיק עבור כל הלוחות כדי להיבדק (בהנחה ~ 10 מ"ל/96-באר צלחת). מיד לפני ללטף את התרבות החיידקית לתוך כל באר, לגרום לביטוי של הכתבים עם הפיקוח האווירית הוסיף לתרבות הגורפת. מודדים את הבארות. ע י ניעור הלילה כדי למדוד את התעריפים טעויות יחסיים, להעביר את התרבויות ללוח שחור (כדי להגביר את הרגישות של גילוי הזריחה), למדוד את הזריחה GFP, ולאחר מכן, לסובב את לוחיות למטה כדי להוריד את החיידקים. העבר את הסופרנטנט לצלחת לבנה עבור מדידת פעילות Nluc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig4.jpg"> איור 4 : תוצאת הנציג של שימוש renillaכתבת גחלילית מדידת קצב טעויות בנוכחות של קסוגמצין בזנים שונים. שערי טעויות של אספרטט עבור אספרגין ב(א) מסוג פראי M. סמיגטיס ו (ב) זן נמחק עבור ksga (∆ ksga) בעקבות הטיפול עם קסוגממיצין (ksga) כפי שנמדד על ידי renilla-גחלילית כפולה כתב. התרבויות טופלו עם קגממיצין במינונים מצוין (במיקרוגרמות/מיליליטר) עבור 6 h לפני הליזה תאים ומדידות. יחסי ה-Ren/FF המתוקן (ציר y) מצביעים על הaspart עבור תעריפי אספרגין טעויות. מחיקת ה- Ksga גורמת לקצב טעויות בסיסי גבוה יותר, שהוא עמיד יותר לאפנון על-ידי קסוגממיצין. הסרגלים מציינים את הערכים הרעים, עם סטיית תקן כשגיאה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig5.jpg"> איור 5 : תוצאת הנציג של שימוש בכתב Nluc-GFP מדידת קצב טעויות בנוכחות של קסוגממיצין. שיעורי הטעויות יחסיים של אספרטט עבור אספרגין בטבע מסוג M. סמיגטיס כפי שנמדד על ידי כתב nluc/gfp, לאחר הטיפול עם קסוגממיצין (ksg) לילה (16 h). הסרגלים מציינים את הערכים הרעים, עם סטיית תקן כשגיאה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems at JoVE.com

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

במאמר זה, אנו מציגים שתי שיטות משלימות כדי למדוד שיעור ספציפי של שגיאה טרנסלבותית ו טעויות במודל הדגם, פטרת סמגטיס, באמצעות מערכות העיתונאי רווח. ניתן ליישם את השיטות כדי למדוד שיעורי שגיאה מדויקים בתפוקה נמוכה או בשיעורי שגיאה יחסיים בהגדרת תפוקה גבוהה יותר.

מדידה של שיעורי הטעויות הספציפיים של פטרת מערכות כתבת

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

סינתזת חלבונים נוטה לטעויות. עם זאת, שגיאות עשויות להיות אדפטיביות תחת לחץ פיזיולוגי. הוכחנו בעבר ששגיאות תרגום ספציפיות במיקובקטריום תורמות לסובלנות אנטיביוטית.היכולת למדוד שיעורי שגיאה ספציפיים מאפשרת לנו למקד את המנגנון הזה של הסתגלות חיידקים. היתרונות העיקריים של טכניקות אלה הם רווח של כתבים פונקציה יכול להיות רגיש להפליא במדידת שיעורי שגיאה קטנים שאינם קלים לגילוי על ידי ספקטרומטריית מסה. מבדיקה Nluc / GFP מאפשר הקרנת תפוקה בינונית שכן הוא נמנע טיפול מוגזם תזה של החיידקים.הדגמת ההליך תהיה דוקטורנט יואה-מנג צ'ן. היום נדגים את הנוהל של שימוש בשני הכתבים האלה דרך הסרטון הזה. כדי להתחיל, לחסן שני מיליליטר של מדיום 7H9 עם סוג פראי מוטציה זני כתב mycobacterial.לנער ב 37 מעלות צלזיוס במשך יום עד יומיים או עד OD ב 600 ננומטר מגיע לשלב נייח. Aliquot ולדלל כדי לקבל OD ב 600 ננומטר סביב 0.5 כדי 1. לאחר מכן, להוסיף ATC לריכוז סופי של 50 ננוגרם למיליליטר.מיד להוסיף מינונים שונים של ksg לתרבות על פי כתב היד כדי למדוד את השפעותיו על שיעורי בטעות. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות במשך ארבע עד שש שעות. לאחר מכן, להעביר את תרבות החיידקים לצינור שני מיליליטר.וצנטריפוגה ב 3, 220 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי גלולה למטה החיידקים. לאחר שלב הצנטריפוגה, השלך את העל-טבעי ושבש את החיידקים על-ידי הוספת 40 מיקרוליטרים של חיץ תמוגה פסיבי פי 1. מעבירים את החיידק המתודלק מחדש לצלחת לבנה של 96 בארות, באר אחת לכל דגימה, ומנערים בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.מוסיפים 80 מיקרוליטרים של מצע גחלילית לכל באר. לנער במשך 15 שניות ולמדוד את הזוהר על ידי לומינומטר. לאחר מכן, להוסיף 80 microliters של מצע רנילה לכל באר.לנער במשך 15 שניות ולמדוד את הזוהר על ידי luminometer. השתמש בערכים מתוקנים כדי לחשב את שיעורי העריכה שגויה של כל תנאי. כדי להתחיל, לחסן שני מיליליטר של מדיום 7H9 עם זן הכתב חיידקי.לנער ב 37 מעלות צלזיוס במשך יום עד יומיים או עד OD ב 600 ננומטר מגיע לשלב נייח. לאחר מכן, תת תרבות ב 50 מיליליטר של מדיום 7H9 לגדול עד OD ב 600 ננומטר מגיע לשלב נייח מאוחר. לפני aliquoting את החיידקים לצלחת 96-well, מוסיפים ATC בריכוז סופי של 50 ננוגרם למיליליטר ומערבבים היטב.הוסיפו 100 מיקרוליטרים ל הבאר לצלחת ברורה עם תחתית עגולה של 96 בארות. לאחר מכן, להוסיף מינונים שונים של ksg ל בארות נבחרות כדי לסנן את השפעותיו על שיעורי mistranslation. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של מים סטריליים לקורות של הצלחת כדי להגביל את האידוי מ בארות הדגימה.לאטום את הצלחת, לנער, ולעורר את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 20 שעות. השתמש פיפטה רב ערוצית לקחת 80 microliters מכל באר. מעבירים את הדגימות לצלחת 96 באר עם תחתית שחורה ומודדים את אות ה-GFP לפי מד הזוהר.לאחר מדידת אות GFP, צנטריפוגה הצלחת ב 3, 220 פעמים גרם במשך 10 דקות. לאחר מכן, להעביר 50 microliters של supernatant לצלחת לבן תחתית 96 היטב. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של מצע Nluc לכל באר.מערבבים היטב ומודדים את הזוהר לפי הלומינומטר. לבסוף, לקבוע את יחס Nluc / GFP על ידי חלוקת ערך זוהר Nluc מתוקן על ידי פלואורסצנטיות GFP. בעבודה זו, מערכת כתב גחלילית רנילה שימש כדי למדוד את שיעור בטעות בנוכחות kasugamycin ב סוג פראי בזן של S.Smegmatis אשר ksgA נמחק.התוצאות הראו אופן ברור תלוי מינון של ksg הפחתת שיעור mistranslation בעוד בזן המחיקה ksgA, ksg היה פחות חזק ואת הבסיס של שיעור mistranslation היה גבוה יותר בשל ההתנגדות אפנון על ידי kasugamycin. פעולת Kasugamycin על לשון הרע נמדדה גם באמצעות כתב Nluc / GFP. גם רנילה פיירפליי וגם כתב Nluc / GFP כרוכים במדידת פעילות לוציפראז.שגיאות צינורות קטנות עלולות לגרום לתנודות גדולות בהקראות. בתור התחלה, אנו ממליצים להגדיל את מספר השכפולים של כל אחד מהם כדי למזער את הסיכוי לקבל נתונים לא מהימנים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

מדידה של זיהום γHV68 ב עכברים

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

CRISPR-Cas9 מבוססי הגנום הנדסה ליצירת מודלים Jurkat כתב להידבקות ב- HIV-1 עם אתרים שנבחרו אינטגרציה Proviral

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

יישום של רטבאליות העיסוי העקבי של העכבר וניטור השינויים הנובעים בלחץ שרירי

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...