Name: multi-locus variable-number tandem-repeat analysis of the fish-pathogenic bacterium yersinia ruckeri by multiplex pcr and capillary electrophoresis
Uploaded: 2019-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis at JoVE.co

De huidige studie werd gefinancierd door het Noorse Seafood Research Fund, FHF (project nrs. 901119 en 901505). We willen alle bijdragers van bacteriële isolaten en monsters die worden gebruikt tijdens de ontwikkeling van de methode bedanken.

Let op: voor het geheel van het protocol is het raadzaam om alle natte laboratorium procedures sterilely uit te voeren door het gebruik van Labjassen, wegwerphandschoenen en steriele reagentia en apparatuur. Het is ook raadzaam om PCR-reacties te bereiden in een aparte ruimte (pre-PCR) die niet wordt gebruikt voor PCR-amplificatie en/of behandeling van PCR-producten (post-PCR). Bewaar alle reagentia zoals aanbevolen door de fabrikant. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de gebruikte reagentia, apparatuur en software.
1. bacteriële teelt en extractie van genomisch DNA
<ol><li>Zaaien Y. ruckeri zuivere culturen op elk geschikt agar-type (de auteurs gebruikten 5% runderbloed agar) en incuberen bij 22 °c gedurende 1-2 dagen, of 15 °c gedurende 3-4 dagen.</li>
	<li>Kies van elke agar-plaat één representatieve kolonie met een inoculatie-lus en breng deze over naar 1,5 mL centrifugebuizen met 50 μL ultrapurificeerd water. Onderbreken, Vortex kort, en inincuberen gedurende 7 minuten op een verwarmingsblok bij 100 °C.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 16 000 x g en gebruik een pipet om het supernatant voorzichtig over te brengen naar een lege centrifugebuis van 1,5 ml. Ga door naar de volgende stap met behulp van de supernatant als template DNA of Bewaar bij-20 °C tot die tijd.</li>
</ol>2. multiplex PCR Setup en fiets condities
Opmerking: Elke multiplex PCR-reactie (twee per Y. ruckeri -isolaat) moet 12,5 μL van 2X multiplex PCR plus Master mix, 0,1 tot 0,2 μM van elk geschikt primer paar (tabel 1) en 3 μL template DNA bevatten, aangepast aan een laatste reactievolume van 25 μL door toevoeging van RNase-vrij water. Streef ernaar om de licht blootstelling van de fluorescentiet gelabelde voorwaartse primers minimaal te houden (bijv. door de opslag buizen in aluminiumfolie te wikkelen).
<ol><li>Voor elk van de twee multiplex PCR-testen (tabel 1), bereiden Master mixen zoals hierboven beschreven (zonder template DNA) volgens het aantal monsters plus één positieve en één negatieve controle. Bovendien, toestaan 10% overschot volume. Vortex de bereide meester mengt zachtjes bij lage snelheid.</li>
	<li>Verdeel 22 μL van elk Master mengsel afzonderlijk in afzonderlijke putjes op PCR-strips of-platen, naargelang het aantal monsters, en voeg 3 μL van de sjabloon toe aan elk putje (voor respectievelijk positieve en negatieve controles gebruikt u DNA van een geverifieerde Y. ruckeri spanning en ultrapurificeerd water). Kort afdichten en centrifugeren.</li>
	<li>Voer alle monsters uit op een PCR-thermische cycler met het volgende programma: (i) 5 min bij 95 °C (II) 30 cycli van 0,5 min bij 95 °C, 1,5 min bij 60 °C, en 1 minuut bij 72 °C, en (III) 60 min bij 68 °C, gevolgd door koeling tot 4 °C voor onbepaalde tijd. Het programma zal in minder dan 3 uur worden voltooid.</li>
</ol>3. PCR Amplicon bevestiging door gel elektroforese
<ol><li>Bereid volgens de aanbevelingen van de fabrikant een volume van 1,5% (w/v) agarose-gel in 1x tris-borate-EDTA-buffer (TBE) geschikt voor het aantal te testen PCR-reacties. Voeg vóór het gieten 5 μL fluorescerende nucleïnezuur kleurstof toe per 50 μL gel-oplossing en meng. Gebruik trays en kammen waar nodig voor het gieten, waardoor een passend aantal putten vrij is voor DNA-referentie ladders.</li>
	<li>Na het instellen, dompel de gel in 1x TBE-buffer in een GE-systeem. Meng 5 μL PCR-product samen met 2 μL lading kleurstof en breng over naar de gel putten. Voeg 5 μL DNA-ladder toe in lege putten ter referentie.</li>
	<li>Voer de gel op 110 V per 15 cm voor ongeveer 1 uur en gebruik een UV-gebaseerd gel Imaging/visualisatie systeem om de aanwezigheid van meerdere (maximaal vijf) banden die PCR-amplicons vertegenwoordigen te controleren (zie voorbeeld in Figuur 1). Gooi de gel weg. Ga verder met de volgende stap of bewaar resterende PCR-producten bij 4 °C tot verdere verwerking.</li>
</ol>4. capillaire elektroforese Setup en run voorwaarden
<ol><li>Verdun PCR-producten 1:10 (v/v) in gezuiverd water na bevestiging van de PCR-amplicons. Afdichting, meng en centrifugeer kort.</li>
	<li>Als u in een zuurkast werkt, bereidt u een volume Master mix voor van 9 μL formamide en 0,5 μL standaard per PCR-product (voor een overschot van 10%). Vortex kort en verdeel 9,5 μL in putjes op een plaat die geschikt is voor het beschikbare CE-systeem, alvorens 0,5 μL verdund PCR-product toe te voegen. Afdichting, meng en centrifugeer kort. Let op: Voorzichtig behandelen. Het mengen van formamide met water genereert mierenzuur, wat giftig is.</li>
	<li>Gebruik een PCR-thermische cycler, denatureren de monsters bij 95 °C gedurende 3 minuten voor de koeling tot 4 °C voor onbepaalde tijd. Centrifugeer kort en laad de plaat op een gekalibreerd CE-systeem volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Voer fragment analyse CE uit met reagentia die geschikt zijn voor het apparaat naar keuze en de volgende instellingen: 60 °C; 5 s injecties bij 1,6 kV (32 V per cm); 32 min uitvoeringstijd bij 15 kV (300 V per cm). CE-fragment analyse van 24 putjes op een 24-capillair (50 cm) duurt meestal ongeveer 50 min.</li>
</ol>5. VNTR grootte aanroepen, herhaal Count berekening en MLVA profilering
Opmerking: Stap 5,1 beschrijft Y. ruckeri VNTR CE grootte aanroepen van elektroferogram bestanden, met behulp van de specifieke software vermeld in de tabel van de materialen. Raadpleeg de software handleiding voor meer informatie en het oplossen van problemen. Voor het gebruik van andere software raadpleegt u de juiste handleidingen.
<ol><li>
Importeer CE-resultaat bestanden (twee per Y. ruckeri -isolaat). Stel de analysemethode in op Microsatellite standaard en selecteer de juiste productkeuze onder maat standaard, voordat u op de knop analyseren drukt. Controleer de juiste identificatie van grootte standaard fragmenten door de formaat match editor en corrigeer alle zichtbaar foutieve toewijzingen.
	<ol>
<li>Nadat u de te lezen sample (s) hebt geselecteerd, klikt u op de knop Toon plots en drukt u op CTRL + A om de weergave van de formaat tabelin te schakelen. Houd in het bovenste deelvenster CTRL ingedrukt terwijl u klikt op de vijf pieken die de VNTR amplicons vertegenwoordigen (gebruik de zoomfunctie indien nodig). Opmerking: Voor elk van de multiplex-PCR-producten toont het elektroforen gram vijf pieken verdeeld over de drie gebruikte kleurstoffen (zie 5 ' kleurstof etikettering van voorwaartse primers in tabel 1 en de twee voorbeelden in Figuur 2).</li>
		<li>Druk op CTRL + G om de formaat tabelte filteren, alleen de kenmerken van de vijf gemarkeerde pieken weer te geven en voor elke VNTR Locus (met verwijzing naar tabel 1) voor de downstream-toepassing de CE-grootte aanroepen op te nemen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om rekening te houden met partijdige ampliconlengte voor temp mobiliteitspatronen tijdens de CE, berekent u nauwkeurige VNTR-herhalings tellingen volgens de onderstaande formule, waarbij VNTR CE-formaat aanroepen samen met Locus-specifieke variabelen worden ingeschakeld (Zie tabel 1). Voor efficiëntie is het raadzaam om dit proces te automatiseren (bijvoorbeeld door een spreadsheet sjabloon te gebruiken). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59455/59455eq1.jpg">
</li>
	<li>Ronde berekende VNTR-herhalingen tellen af naar het dichtstbijzijnde gehele getal en worden samengevoegd tot tien cijferreeksen, die elk het MLVA-Profiel van een enkele Y. ruckeri -isolaat vertegenwoordigen.</li>
</ol>6. minimale spanning boom cluster analyse van MLVA gegevens
Opmerking: Stap 6 beschrijft het maken van MST-diagrammen van Y. ruckeri mlva-gegevens, met behulp van de specifieke software die wordt vermeld in de tabel met materialen. Raadpleeg de software handleiding voor meer informatie en het oplossen van problemen. Voor het gebruik van andere software raadpleegt u de juiste handleidingen.
<ol><li>Maak een nieuwe database en kies ervoor om de MLVA-plugin te activeren.</li>
	<li>Importeer Y. ruckeri mlva-profielen en metagegevens door gegevens van het type teken te selecteren, gevolgd door import velden en-tekens (verdere Subselectie afhankelijk van de opslagindeling). Wanneer u hierom wordt gevraagd, geeft u import regels op volgens de inhoud van het importbestand: in de kolom doeltype classificeren VNTR REPEAT telt als tekenwaarde: VNTR, en de diverse metagegevens als vermeldsinformatie: iteminfo veld . Opmerking: Voor vergelijking en context is het ook mogelijk om de volledige gegevensset (Open Access) te importeren, samen met het originele papier dat het huidige MLVA-protocol14in gebruik heeft. MLVA-profielen en metagegevens over de diverse verzameling van Y. ruckeri isolaten (n = 484) gecontroleerd in die studie is beschikbaar via het aanvullende materiaal (tabellen S1 en S2) door middel van de volgende link: https://AEM.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files</li>
	<li>Open in het deelvenster experiment type de vermelding VNTR en stel de minimum-en maximumwaarden voor elke VNTR-Locus in op respectievelijk 0 en 100. Stel onder algemene instellingenhet aantal decimale cijfers in op 0 en selecteer getallen onder gegevenstype. Controleer om afwezige waarden als nul te beschouwen.</li>
	<li>
Selecteer geïmporteerde monsters bestemd voor MST-clusteranalyse en klik op de knop nieuwe vergelijking maken (in vergelijkings venster).
	<ol>
<li>Indien gewenst voor de visuele presentatie van het MST, wijst u de monsters toe aan gekleurde groepen (bijvoorbeeld volgens een bepaalde metagegevenseigenschap) door gebruik te maken van de verschillende opties die beschikbaar zijn in het deelvenster groepen . Opmerking: Groepen kunnen ook achteraf worden gemaakt/gewijzigd, na de volgende stappen.</li>
		<li>Selecteer Geavanceerde clusteranalyse... en MST voor categorische gegevens om een MST-diagram te genereren op basis van de gekozen voorbeelden.</li>
		<li>De visuele presentatie van het MST naar voorkeur verder aanpassen (bijvoorbeeld door het toevoegen van partitioneringsparameters, het labelen van een knooppunt/filiaal, crosslinks, legenda's, enz.). Zie voorbeeld in Figuur 3. Opmerking: Een cluster (clonal complex) partitioneringsdrempel van ≤ 4/10 niet-identieke VNTR loci, naast het verbergen van vertakkings verbindingen die > 5/10 niet-identieke VNTR loci vertegenwoordigen, eerder is gebruikt voor MST-clusteranalyse op basis van MLVA-gegevens die zijn gegenereerd met dit protocol14. Mits de bovengenoemde gegevensset van 484 Y. ruckeri mlva profielen werd geïmporteerd, kunnen deze monsters ook worden opgenomen voor MST clusteranalyse (zoals hierboven beschreven) om een globale en historische context te bieden. Dit zal bijvoorbeeld de identificatie vergemakkelijken van alle monsters die zijn aangesloten bij eerder beschreven van klonen-complexen, evenals die welke nog niet-beschreven kilometerstanden vertegenwoordigen. Afhankelijk van de beschikbare metagegevens kan het resulterende MST-diagram op verschillende manieren worden gecontroleerd, bijvoorbeeld om de uiteindelijke clustering patronen te ontdekken die zijn gekoppeld aan bepaalde eigenschappen (geografie, host, tijd enz.).</li>
		<li>Exporteer indien nodig de gefinaliseerde MST in de gewenste indeling met de optie afbeelding exporteren .</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+redmouth+disease+(ERM)+(Yersinia+ruckeri).">Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri).</a> Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).</li><li>Barnes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+analysis+of+Yersinia+ruckeri+isolated+over+27+years+in+Australia+and+New+Zealand+reveals+geographical+endemism+over+multiple+lineages+and+recent+evolution+under+host+selection.">Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection.</a> Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).</li><li>Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis+and+multi+locus+sequence+typing+for+characterizing+genotype+variability+of+Yersinia+ruckeri+isolated+from+farmed+fish+in+France.">Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France.</a> Veterinary Research. 46, 73 (2015).</li><li>Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+reveals+high+genetic+diversity+and+epidemic+population+structure+for+the+fish+pathogen+Yersinia+ruckeri.">Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri.</a> Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).</li><li>Wheeler, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+ruckeri+biotype+2+isolates+from+mainland+Europe+and+the+UK+likely+represent+different+clonal+groups.">Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).</li><li>Eyre, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multilocus+variable-number+tandem-repeat+analysis+and+whole-genome+sequencing+for+investigation+of+Clostridium+difficile+transmission.">Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Locus+Variable-Number+Tandem-Repeat+and+Single-Nucleotide+Polymorphism-Based+Brucella+Typing+Reveals+Multiple+Lineages+in+Brucella+melitensis+Currently+Endemic+in+China.">Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China.</a> Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).</li><li>Bouchouicha, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+performances+of+MLVA+vs.+the+main+other+typing+techniques+for+Bartonella+henselae.">Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae.</a> Clinical Microbiology and Infection. 15, 104-105 (2009).</li><li>Dahyot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-Locus+Variable+Number+Tandem+Repeat+Analysis+(MLVA)+and+Tandem+Repeat+Sequence+Typing+(TRST),+helpful+tools+for+subtyping+Staphylococcus+lugdunensis.">Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis.</a> Scientific Reports. 8 (1), (2018).</li><li>Elberse, K. E. M., Nunes, S., S&#225;-Le&#227;o, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-locus+variable+number+tandem+repeat+analysis+for+Streptococcus+pneumoniae:+Comparison+with+PFGE+and+MLST.">Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST.</a> PLoS ONE. 6 (5), (2011).</li><li>Matejusova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable-number+tandem-repeat+genotyping+of+Renibacterium+salmoninarum,+a+bacterium+causing+bacterial+kidney+disease+in+salmonid+fish.">Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish.</a> BMC microbiology. 13, 285 (2013).</li><li>Duodu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+multiple-locus+variable-number+of+tandem+repeat+analysis+(MLVA)+for+the+fish+pathogen+Francisella+noatunensis+using+capillary+electrophoresis.">An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis.</a> BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).</li><li>Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., S&#248;rum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable+number+tandem+repeat+analysis+of+Edwardsiella+piscicida+isolates+pathogenic+to+fish.">Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish.</a> Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).</li><li>Gulla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable-number+tandem-repeat+analysis+of+Yersinia+ruckeri+confirms+the+existence+of+host+specificity,+geographic+endemism,+and+anthropogenic+dissemination+of+virulent+clones.">Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).</li><li>Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cautionary+tale:+Lack+of+consistency+in+allele+sizes+between+two+laboratories+for+a+published+multilocus+microsatellite+typing+system.">A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).</li><li>Lista, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+Bacillus+anthracis+strains+based+on+automated+capillary+25-loci+multiple+locus+variable-number+tandem+repeats+analysis.">Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis.</a> BMC Microbiology. 6, 33 (2006).</li><li>. Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf</a> (2014)</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Beide multiplex PCRs gepresenteerd hier zijn relatief robuust verschenen in het gezicht van slechte template DNA-kwaliteit, maar een gebrek aan PCR-versterking werd toch af en toe waargenomen bij het gebruik van sjablonen met extreem hoge DNA-concentraties. Deze problemen werden gemakkelijk opgelost door de templates vóór PCR te verdunen. Andere methoden voor DNA-extractie dan degene die hier werkzaam zijn, kunnen ook worden gebruikt (bijv. commerciële Kits).
Hoewel vijf amplicons worden verwacht van elke multiplex-PCR-reactie, moeten vijf visueel te onderscheiden banden niet altijd van GE worden verwacht, omdat sommige (verschillend gelabelde) VNTR loci binnen dezelfde reactie overlappende grootte bereiken hebben. De uiteindelijke PCR-Verleng tijd van 60 min kan indien nodig worden verkort, maar zal waarschijnlijk resulteren in het toegenomen optreden van gespleten pieken in daaropvolgende CE-elektroforgrammen (zie hieronder). Met name omdat het doel van de GE-stap puur voor kwalitatieve verificatie van PCR-amplicons is, kan de uitvoeringstijd, het voltage en/of het gelrecept als voorkeur worden aangepast. Indien GE in het bijzonder zwakke banden opmerkt, kan het raadzaam zijn de verdunningsfactor van die monsters vóór de CE te verlagen.
Hoewel het hier beschreven CE-protocol werd uitgevoerd op een specifiek commercieel capillair elektroforeseapparaat (Zie tabel van de materialen), kunnen verschillende CE-systemen verschillende monster vereisten hebben, wat op zijn beurt een aantal wijzigingen aan het protocol kan . Raadpleeg de handleiding van de betreffende CE-systeemfabrikant voor instructies over geschikte reagentia/apparatuur, kalibratie etc. voor fragment analyse. Er is ook een mogelijkheid dat de vooringenomen ampliconlengte voor temp mobiliteitspatronen die tijdens de CE-markering zijn waargenomen, relatief kunnen verschillen tussen de CE-systemen en/of machines, zoals eerder is gedocumenteerd voor andere mlva-protocollen15,16. Als de uiteindelijke (afgeronde) VNTR-herhalings aantallen zich voordoen in een mate waarin dit wordt beïnvloed, betekent dit dat de Locus-specifieke variabelen s en i (tabel 1), die worden gebruikt om het aantal herhalingen van VNTR te bepalen, opnieuw moeten worden gekalibreerd. Dit betreft een lineaire regressie op percelen met een vergelijking van nauwkeurige sequentie groottes versus CE-grootte aanroepen, zoals beschreven door Gulla et al. 201814.
Split pieken en stotter pieken, beide bekende artefacten in CE gebaseerd MLVA typing17, kan worden waargenomen in electropherogrammen tijdens het aanroepen van de grootte (Figuur 4). Hoewel haperingen pieken moeten worden genegeerd, moet de langere piek consistent worden geselecteerd voor downstreamtoepassingen in het geval van gesplitste pieken gescheiden door een enkel basis paar. Bovendien zijn afwezige pieken die duiden op een gebrek aan specifieke VNTR loci zeldzaam, maar kunnen zich voordoen, in welk geval een herhalings telling van ' 0 ' moet worden toegewezen. Als de start cultuur waaruit DNA wordt geëxtraheerd niet zuiver is (d.w.z. meer dan één Y. ruckeri -subtype bevat), kunnen meerdere hoge pieken die overeenkomen met verschillende allelen van dezelfde Locus/loci worden waargenomen na de CE. Secundaire cultivaties moeten dan worden uitgevoerd van enkele kolonies voorafgaand aan nieuwe DNA-extractie voor opnieuw typen.
Zoals vermeld in het Protocol, moet template DNA voor PCR standaard worden geëxtraheerd uit zuivere culturen van Y. ruckeri. In enkele gevallen, echter, eieren-vloeistofmonsters testen positief voor Y. ruckeri door qPCR (CT-waarden < 27) werden met succes mlva direct getypt, zonder voorafgaande kweek, met behulp van een verhoogde hoeveelheid GENOMISCH DNA (geëxtraheerd met commerciële Kit) als sjabloon. Hoewel deze aanpak niet uitgebreid is getest en niet is geverifieerd, geeft dit wel het potentieel van deze MLVA-test aan voor onderzoek van complexe biologische matrices die DNA uit een reeks verschillende organismen bevatten, naast Y. ruckeri.
De gehele MLVA-type procedure die hier wordt gepresenteerd, van DNA-extractie tot epizootiologische evaluatie, kan in één werkdag worden voltooid. Het aantal onderzochte monsters is echter in een sublineaire relatie met de tijd die nodig is voor DNA-extractie, PCR en CE, en de methode is daarom veel meer tijd efficiënt bij het gelijktijdig uitvoeren van meerdere monsters. Dit is niettemin het geval voor de meeste Lab-gebaseerde methoden, en als een instrument voor epidemiologische ondertypen van Y. ruckeri, de combinatie van hoge resolutie, eenvoud en draagbaarheid maakt deze mlva assay superieur aan eerder gepubliceerde protocollen4 ,5. Het is ook gebruikt om te controleren of de beperkte epidemiologische relevantie van Y. ruckeri sero typing14.
Door middel van een uitgebreid MLVA-gebaseerd bevolkingsonderzoek met 484 Y. ruckeri isolaten teruggewonnen uit een reeks spatiotemporele oorsprong en habitats (gastheer vis, milieu, enz.), ons begrip met betrekking tot de epizoötiologie en de populatie structuur van dit belangrijke vispathogeen werd aanzienlijk verhoogd14. MLVA typing kon de tracering van klonen gedissemineerde in tientallen jaren, vermoedelijk door het vervoer van vis, evenals de identificatie van lokaal gesloten stammen. Bovendien, terwijl sommige klonale complexen van de bacterie duidelijk zou kunnen worden geassocieerd met ziekte in het bijzonder vissen gastheren (regenboogforel en Atlantische zalm, respectievelijk), anderen werden alleen teruggewonnen uit milieubronnen en/of klinisch onaangetast vis Specimens. De toepasselijkheid van de methode is dus niet alleen beperkt tot het opsporen van infecties, omdat zij ook informatie kan verschaffen over mogelijke relevantie, bijvoorbeeld voor de ontwikkeling van vaccins, de risicobeoordeling en het onderhoud van de nationale bioveiligheid. Het is momenteel actief in gebruik bij het Noorse veterinaire Instituut als een instrument voor het onderzoeken van Y. ruckeri diagnoses in de Noorse aquacultuur.

Yersinia ruckeri, een gram-negatieve bacterie en lid van de yersiniaceae familie, veroorzaakt Yersiniose in gekweekte zalmachtigen vissen wereldwijd1. Het is gemakkelijk gediagnosticeerd van besmette vis door teelt op vele soorten agar media, maar tot voor kort was er weinig bekend over de bevolkingsstructuur en epizootiologie van Y. ruckeri over de hele wereld en in verschillende habitats (gastheer soorten, enz.). Bestaande serotype systemen voor Y. ruckeri zijn inconsistent, gebrek aan wederzijdse compatibiliteit en bieden een lage epidemiologische resolutie. Sommige moleculaire studies op de bacterie zijn uitgevoerd, met technieken zoals multilocus sequentie typen (mlst), gepulseerde veld gel elektroforese (PFGE) of whole-genoom sequentie (WGS) analyse2,3,4 ,5. MLST biedt echter geen voldoende hoge resolutie voor routine infectie tracering, terwijl PFGE arbeids veeleisend is en resultaten oplevert die niet gemakkelijk overdraagbaar zijn in laboratoria. Terwijl de WGS-analyse een nabije eindresolutie zou opleveren, zou het opzetten en uitvoeren van dergelijke analyses een voorwaarde zijn voor technische-en bioinformatica capaciteiten die nog steeds beperkt blijven tot een relatief klein aantal laboratoria.
Multi-Locus variabele-nummer tandem-repeat analyse (mlva) vertegenwoordigt een eenvoudig en gemakkelijk toegankelijk moleculair type gereedschap, dat een genetische resolutie biedt in sommige gevallen die bijna overeenkomen met die van WGS-analyse6,7. De techniek is gebaseerd op herhalings getalvariatie in geselecteerde variabele-nummer tandem-repeat (VNTR) loci, resulterend in uitvoergegevens die zeer transporteerbaar zijn, waardoor vergelijking van geprofileerde isolaten naar online databases en over Labs eenvoudig is. Hoewel mlst blijft de gouden standaard voor epidemiologische typen van veel bacteriële pathogenen, een toenemend aantal studies identificeren een significant hogere discriminerende kracht van mlva8,9,10. Er zijn ook verschillende protocollen gepubliceerd die gericht zijn op vispathogene bacteriën, zoals Francisella noatunensis, edwardsiella en Renibacterium salmoninarum11,12, 13.
Het ten-loci MLVA-protocol dat hier werd gepresenteerd, dat onlangs de basis vormde voor een uitgebreide Y. ruckeri populatie studie14, omvat extractie van DNA uit agar-gekweekte kolonies, multiplex PCR en capillaire ELEKTROFORESE (CE), gevolgd door downstream in silico-toepassingen. Voor elk onderzocht isolaat worden twee multiplex PCRs, beide met vijf fluorescently gelabelde primer paren (6FAM, NED of VIC), elk gericht op individuele VNTR-gebieden, parallel uitgevoerd onder identieke omstandigheden. Na verificatie van de PCR-amplicons door gelelektroforese (GE) worden PCR-producten vóór de CE-analyse verdund en pieken die de respectieve VNTR loci vertegenwoordigen, worden van de resulterende electropherogrambestanden de grootte genoemd. Samen met Locus-specifieke formules accounting voor kleine, sequentie-specifieke verschillen in CE migratiepatronen, VNTR CE grootte aanroepen worden vervolgens gebruikt voor het berekenen van VNTR REPEAT tellingen die worden samengevoegd in tien-cijferige MLVA-profielen. Deze worden gebruikt als input voor epizoötiologische evaluaties (bijvoorbeeld door clusteranalyse in minimum spanning tree (MST) diagrammen).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >22&#176;C/15&#176;C incubator</td>
			<td >As preferred.</td>
			<td >NA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5&#39; Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>450007</td>
			<td>Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agarose, universal, peqGOLD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789P/732-2788</td>
			<td>Used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avant 3500xL Genetic Analyzer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30469</td>
			<td>Used for capillary electrophoresis fragment analysis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BioNumerics7 modules</td>
			<td>Applied Maths</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge(s)</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15612</td>
			<td>Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Loading dye used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Centrifuge tubes used during DNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freezer</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fume cupboard</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel electrophoresis system</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneMapper Software 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4475073</td>
			<td>Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0373</td>
			<td>DNA ladder used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4408399</td>
			<td>Size standard used during capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311320/4440753</td>
			<td>Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Milli-Q water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multiplex PCR&#160;Plus&#160;Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>206151/206152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR thermal cycler</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26077/4393713/4393709</td>
			<td>Separation matrix used during capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pure culture Yersinia ruckeri</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>E.g. cryopreserved or fresh.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>NA</td>
			<td>In: Multiplex PCR&#160;Plus&#160;Kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-borate-EDTA (TBE)&#160; buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsine soy agar/bovine blood agar</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-based gel imaging/visualisation system</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortexer</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-locus variable-number tandem-repeat analysis of the fish-pathogenic bacterium yersinia ruckeri by multiplex pcr and capillary electrophoresis

Yersinia ruckeri is een belangrijk pathogeen van gekweekte zalmachtigen wereldwijd, maar eenvoudige hulpmiddelen geschikt voor epizootiologische onderzoeken (infectie tracing, enz.) van deze bacterie ontbreken. Een multi-Locus variabele-nummer tandem-repeat analyse (MLVA) test werd daarom ontwikkeld als een gemakkelijk toegankelijk en eenduidig instrument voor het met hoge resolutie genotypering van teruggewonnen isolaten. Voor de hier gepresenteerde MLVA-assay wordt DNA geëxtraheerd uit gekweekte Y. ruckeri monsters door het koken van bacteriële cellen in water, gevolgd door het gebruik van supernatant als sjabloon voor PCR. Primer-paren gericht op tien variabele-nummer tandem-repeat (VNTR) loci, afgewisseld door de Y. ruckeri genoome, worden gelijkelijk verdeeld over 2 5-Plex PCR-reacties die onder identieke fiets condities lopen. Voorwaartse primers worden geëtiketteerd met een van de drie fluorescerende kleurstoffen. Na ampliconlengte voor temp bevestiging door gel elektroforese, worden PCR-producten verdund en onderworpen aan capillaire elektroforese. Van de resulterende elektroferogram profielen, pieken die elk van de VNTR loci zijn grootte-genoemd en gebruikt voor het berekenen van VNTR herhaling graven in silico. Resulterende tien-cijferige MLVA-profielen worden vervolgens gebruikt voor het genereren van minimale spanning bomen waardoor epizootiologische evaluatie door clusteranalyse. De zeer draagbare uitvoergegevens, in de vorm van numerieke MLVA-profielen, kunnen snel worden vergeleken tussen Labs en geplaatst in een spatiotemporele context. De hele procedure van gekweekte kolonie tot epizoötiologische evaluatie kan worden voltooid voor maximaal 48 j. ruckeri isolaten binnen één werkdag.

Volgens multiplex PCR zoals hier beschreven, wordt in Figuur 1een typisch ge-beeld van de aanwezigheid van meerdere amplicons van elke PCR-reactie weergegeven. Downstream CE-fragment analyse uitgevoerd op geverifieerde PCR-producten zal, voor elke Y. ruckeri isolaat onderzocht, resulteren in twee elektroferogram bestanden die worden gebruikt voor het aanroepen van de grootte van de respectieve VNTR loci (Figuur 2). Uit analyse van 484 diverse Y. ruckeri isolaten, geen overlap in ampliconlengte voor temp groottebereik werd waargenomen tussen VNTR loci geëtiketteerd met dezelfde kleurstof in dezelfde multiplex reactie (tabel 1)14. Elk van de electrophoretische pieken kan daarom ondubbelzinnig worden geïdentificeerd door kleur.
Na invoer van MLVA-profielen en relevante metagegevens in de voorkeurs software, kunnen MST-diagrammen worden geconstrueerd zoals beschreven voor de toetsing van epidemiologische patronen van belang in het materiaal. Raadpleeg de juiste handleidingen voor aanvullende opties die beschikbaar zijn in de respectieve software. Als voorbeeld toont Figuur 3 vergelijking met MST van mlva profielen voor Y. ruckeri isolaten hersteld van vis in verband met vijf verschillende zalmkwekerijen in Noorwegen.
De consistente herhalings grootten van de ten VNTR loci, evenals hun in vitro en in vivo stabiliteit, zijn eerder geverifieerd in de oorspronkelijke studie op basis van dit protocol14. Kort, dit werd gedaan met behulp van Sanger sequencing (REPEAT grootte), en door MLVA het typen van meerdere isolaten volgende seriële passages (in vitro) en van binnen individuele ziekte uitbraken (in vivo). Bovendien werd de milieu stabiliteit van de loci na verloop van tijd onderzocht door meerdere ' huis stam ' isolaten te typen die gedurende meerdere jaren zijn teruggewonnen uit aanhoudend besmette zoet waterproductie locaties voor Atlantische zalm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig1.jpg"> Figuur 1 : Gel elektroforese die de aanwezigheid van meerdere PCR-producten verifieert. De afbeelding bevestigt de aanwezigheid van meerdere PCR-amplicons in alle 12-Lanes die samples bevatten, met de eerste rijstrook die de gebruikte DNA-ladder weergeeft. De afmetingen van geselecteerde ladder fragmenten zijn aangegeven, evenals de PCR-test en de stam (zie tabel S1 in Gulla et al. 201814) van elke rijstrook. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig2.jpg"> Figuur 2 : Electropherogrammen tonen pieken overeenkomend met VNTR amplicons. Namen van de verschillende VNTR loci zijn aangegeven, met kleurstof etiketten (VIC = groen; NED = zwart; 6FAM = blauw) tussen haakjes. De twee electropherogrammen (PCR-assay 1 Top; PCR-assay 2 onder) zijn afkomstig van het typen van een enkele Y. ruckeri -isolaat. Oranje pieken (kleurstof LIZ) vertegenwoordigen de grootte standaard gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig3.jpg"> Figuur 3 : Voorbeeld minimale spanning boom voor epidemiologische evaluatie. Het diagram is gebaseerd op MLVA profielen van Y. ruckeri isolaten teruggewonnen uit Atlantische zalm in vijf verschillende Noorse boerderijen (1-5; Zie legende) ervaren recidiverende yerisniose uitbraken. Er kan een duidelijke clustering tendens in verband met de oorsprong van de boerderij worden waargenomen. Kruis links tonen alle mogelijke verbindingen met ≤ 1/10 niet-identieke VNTR loci (Zie legenda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig4.jpg"> Figuur 4 : Electropherogram visualiseert haperingen en gespleten pieken. In dit geval worden beide gelijktijdig uitgevoerd, wat niet altijd het geval is. De langere en hogere piek, die de YR1070 VNTR Locus vertegenwoordigt, kan gemakkelijk worden onderscheiden. Het display wordt vergroot en toont alleen blauwe kleurstof pieken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59455/59455table1.jpg"> Tabel 1: kenmerken van VNTR Locus. Relevante kenmerken van de ten Y. ruckeri VNTR regio's die zijn gericht op het huidige mlva-protocol.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis at JoVE.co

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

De multi-Locus variabele-aantal tandem-repeat analyse (MLVA) assay hier gepresenteerd maakt goedkope, robuuste en draagbare hoge-resolutie genotypering van de vis-pathogene bacterie Yersinia ruckeri. Beginnend bij zuivere culturen, gebruikt de assay multiplex PCR en capillaire elektroforese om tien-loci MLVA-profielen voor downstreamtoepassingen te produceren.

Multi-Locus variabele-nummer tandem-herhaling analyse van de vis-pathogene bacterie Yersinia ruckeri door multiplex PCR en capillaire elektroforese

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Dit MLB genotyping protocol heeft ons begrip van de epidemiologie en de wereldwijde bevolkingsstructuur van Yersinia ruckeri, een internationaal belangrijke vispathogene bacterie, sterk vergroot. In vergelijking met eerder opgerichte Yersinia ruckeri typeschema's, biedt het een zeer hoge spanningsresolutie. De procedure is eenvoudig, goedkoop, en kent draagbare resultaten toe die gemakkelijk over laboratoria kunnen worden vergeleken.De techniek verbetert de diagnostische specificiteit aanzienlijk en maakt infectietracering mogelijk. Zo kunnen we nu vaak virulente Yersinia ruckeri klonen bestaande tegen de achtergrond van niet-virulente milieustammen onderscheiden. Het demonstreren van de procedure zal Saima Nasrin Mohammad, een technicus in ons laboratorium.Om te beginnen, gebruik steriele inentingslussen te zaaien uit Yersinia ruckeri pure culturen op een geschikte agar type op petrischaaltjes. Incubeer op 22 graden Celsius gedurende een tot twee dagen of 15 graden Celsius gedurende drie tot vier dagen. Daarna, met behulp van inentingslussen, kies een representatieve kolonie uit elke petrischaal en breng over naar 1,5-milliliter centrifugebuizen, met 50 microliter ultra gezuiverd water om opnieuw te besteden.Vortex kort en zeven minuten uitbroeden op een verwarmingsblok bij 100 graden Celsius. Dan, centrifuge op 16,000 g gedurende drie minuten en gebruik een pipet om zorgvuldig de supernatant sjabloon DNA over te zetten in lege 1,5-milliliter centrifugebuizen. Ga naar de volgende stap of bewaar het DNA op 20 graden Celsius.Om mastermixen voor te bereiden, bereken je eerst reagente volumes op basis van het aantal te analyseren bacteriële monsters, waarbij ook één negatieve en één positieve controle en een uiteindelijk overschotvolume van 10% worden weergegeven, zoals beschreven in het manuscript. Houd er rekening mee dat er verschillende primerconcentraties worden gebruikt. In twee afzonderlijke centrifugebuizen, een per PCR-test, voeg multiplex PCR plus master mix, primers, en RNase-vrij water.Vortex de geprepareerde master mengt voorzichtig bij lage snelheid en vervolgens, distribueren 22 microliters van elke master mix afzonderlijk in individuele putten op ofwel PCR strips of platen. Voeg vervolgens drie microliters van de voorbereide DNA-sjabloon toe aan elke put met mastermix;twee putten per bacteriemonster, één voor elke test. Gebruik DNA van een geverifieerde Yersinia ruckeri stam voor een positieve controle, en ultra gezuiverd water voor een negatieve controle.Verzegel en centrifuge kort. Laad de voorbereide reacties op een PCR thermo cycler en stel het programma op volgens het manuscript. Het programma wordt voltooid in minder dan drie uur.Volgens de aanbevelingen van de fabrikant, voeg agarose gel poeder in een keer TBE buffer te bereiken 1,5 gewicht / volume procent en warmte op te lossen. Voorafgaand aan het gieten, chill de opgeloste gel oplossing kort onder stromend water, voeg 5 microliter van fluorescerende nucleïnezuur kleurstof per 50 microliter gel oplossing en meng. Monteer en nivellering van de gietlade.Voeg kegels toe naar gelang van het geval voor het aantal monsters. Giet de geloplossing in de cast en wacht tot deze stolt. Daarna dompelt u de gietvorm met de gel in één keer TBE-buffer onder in een gelelektroforesesysteem.Meng vijf microliter van de PCR-producten samen met twee microliters van lading kleurstof in nieuwe PCR strips. Breng vijf microliter van de mengsels naar de putten in de gel. Bespaar ten minste een goed leeg.Voeg vijf microliter dna-ladder in de lege put toe als referentie. Sluit de elektroden aan en voer de gel ongeveer een uur op 110 volt per 15 centimeter. Gebruik een UV-gebaseerd gelbeeldvormingssysteem om de aanwezigheid van meerdere banden die PRC-amplicons vertegenwoordigen te verifiëren.Gebruik na bevestiging van PCR-amplicons nieuwe PCR-strips of -platen om PCR-producten één tot 10 in gezuiverd water te verdunnen. Vortex en centrifuge kort. Bereid tijdens het werken in een rookkast een mastermix in een centrifugebuis bestaande uit formamide en referentieformaat standaardoplossing.Gebruik het aantal te analyseren PCR-producten reagensvolumes zoals beschreven in het manuscript. Laat een overschot van 10% toe. Vortex kort en distribueren 9,5 microliter in individuele putten op een PCR-plaat geschikt voor de beschikbare capillaire elektroforese systeem.Voeg vervolgens 0,5 microliter verdund PCR-product toe. Verzegel en centrifuge kort. Laad vervolgens de plaat met de monsters in een PCR thermo cycler en denature de monsters op 95 graden Celsius gedurende drie minuten voordat koeling tot vier graden Celsius voor onbepaalde tijd.Centrifugeer gedurende een minuut op 1000 g, verwijder de afdichting voorzichtig en laad de plaat op een gekalibreerd capillaire elektroforesesysteem volgens de instructies van de fabrikant. Voer fragmentanalyse capillaire elektroforese uit, met behulp van reagentia naar keuze voor het apparaat van keuze, en pas de run voorwaarden aan de beschrijving in het manuscript. Voor Yersinia ruckeri VNTR capillaire elektroforese grootte bellen, eerste import capillaire elektroforese resultaat bestanden in Gene Mapper 5 software.Stel de analysemethode in op Microsatellite Default, selecteer de juiste productkeuze onder maatstandaard en druk vervolgens op de knop Analyseren. Door middel van de grootte match editor, controleer de juiste identificatie van de grootte standaard fragmenten en corrigeer eventuele zichtbaar onjuiste toewijzingen. Selecteer vervolgens het te lezen voorbeeld, druk op de knop Plot weergeven en druk op Control A om de weergave van de groottetabel in te schakelen.Houd in het bovenste paneel Control ingedrukt terwijl u op de vijf pieken klikt die de VNTR-amplicons vertegenwoordigen. Druk op Control G om de groottetabel te filteren, met alleen kenmerken van de vijf gemarkeerde pieken en de grootteoproepen voor elke VNTR-locus voor downstream-toepassing vast te leggen. Om rekening te houden met bevooroordeelde amplicon mobiliteitspatronen tijdens capillaire elektroforese, bereken nauwkeurige VNTR herhalingstellingen door gebruik te maken van de verworven grootte oproepen in combinatie met de locus specifieke variabelen.De formule kan worden geïmplementeerd in een spreadsheetsjabloon voor automatisering. In de spreadsheet telt ronde berekende VNRT-herhaling af voor het dichtstbijzijnde gehele getal voorafgaand aan downstream-analyse. Maak in de BioNumerics-software een nieuwe database en kies ervoor om de MLVA-plug-in te activeren.Druk in het deelvenster experimenttype op Nieuw experimenttype maken, kies Tekentype en gebruik de standaardinstellingen wanneer daarom wordt gevraagd. Selecteer vervolgens het nieuwe experiment en voeg nieuwe tekens toe voor elk van de 10 VNTR loci, waarbij nul tot 100 als waardebereik wordt gebruikt. Terug in het hoofdpaneel importeert u Yersinia ruckeri VNTR herhalingstellingen en methodegegevens door importvelden en tekens te selecteren.Zoek het bestand waar dit is opgeslagen en maak selecties in de kolom Doeltype. Voor de VNTRs betekent dit het selecteren van de juiste tekenwaarde, terwijl de verschillende metagegevens worden geclassificeerd als invoerinfovelden. De gemaakte keuzes kunnen worden opgeslagen als een sjabloon om het proces voor later te vergemakkelijken.Selecteer geïmporteerde voorbeelden die zijn bestemd voor MST-clusteranalyse en klik vervolgens op de knop Nieuwe vergelijking maken in het deelvenster Vergelijkingen. Indien gewenst voor de visuele presentatie van het MST, wijs de monsters toe aan gekleurde groepen, bijvoorbeeld volgens een bepaalde metagegevensfunctie. Selecteer vervolgens Geavanceerde clusteranalyse en MST voor categorische gegevens om een MST-diagram te genereren op basis van de gekozen voorbeelden.Wijzig verder de visuele presentatie van het MST door partitieparameters, kruislengtes, node branch labeling, enz. Exporteer indien nodig het afgeronde MST in een gewenste indeling met de afbeeldingsselectie exporteren. Na multiplex PCR, de gel elektroforese beeld controleert de aanwezigheid van meerdere amplicons in alle 12 rijstroken met monsters, met de eerste rijstrook die de DNA-ladder gebruikt.In elektroferogrammen als gevolg van capillaire elektroforese kan de verschillende VNTR loci worden geïdentificeerd aan de hand van een combinatie van grootte en kleurstoflabeling. Oranje pieken vertegenwoordigen de grootte standaard gebruikt. Een voorbeeld minimale spanning boom, op basis van MLVA profielen van Yersinia Ruckeri isolaten teruggewonnen uit Atlantische zalm in vijf verschillende Noorse boerderijen wordt getoond.Een duidelijke clustering tendens in verband met de oorsprong van de boerderij kan worden waargenomen. De identificatie door MLVA van verschillende Yersinia ruckeri klonen domineert, bijvoorbeeld, met name geografische regio's van vissoorten, is al benut voor het verbeteren van vaccinatiestrategieën tegen deze ziekteverwekker.

Research

JoVE Journal

Genetics

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse van de c-KIT Ligand Promoter Gebruik van Chromatine Immunoprecipitatie

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Het bestuderen van celcyclusreguleerde genuitdrukking door twee complementaire celsynchronisatieprotocollen

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformeren, genoom bewerking en Fenotyping de stikstoffixatie tropische Cannabaceae boom Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discriminatie en mapping van de primaire en verwerkte transcripten in maïs-mitochondrion met behulp van een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Onderzoek naar de transcriptionele rol van een RUNX1 Intronic geluiddemper door crispr/Cas9 Ribonucleoprotein in acute myeloïde leukemie cellen

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke RT-PCR

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Karakterisering van in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door RNA-Seq Analyse

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...