Name: multi-locus variable-number tandem-repeat analysis of the fish-pathogenic bacterium yersinia ruckeri by multiplex pcr and capillary electrophoresis
Uploaded: 2019-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis at JoVE.co

Die vorliegende Studie wurde vom Norwegian Seafood Research Fund, FHF (Projekt-Nr. 901119 und 901505) finanziert. Wir möchten uns bei allen Mitwirkenden von Bakteriellen Isolaten und Proben bedanken, die bei der Methodenentwicklung verwendet werden.

VORSICHT: Für das gesamte Protokoll ist es ratsam, alle Nasslabor-Verfahren steril mit Laborlacken, Einweghandschuhen und sterilen Reagenzien und Geräten durchzuführen. Es ist auch ratsam, PCR-Reaktionen in einem separaten Raum (Pre-PCR) vorzubereiten, der nicht für die PCR-Verstärkung und/oder handhabung von PCR-Produkten (Post-PCR) verwendet wird. Bewahren Sie alle Reagenzien gemäß der vom Hersteller empfohlenen Aufbewahren auf. Weitere Informationen zu den verwendeten Reagenzien, Geräten und Software finden Sie in der Tabelle der Materialien.
1. Bakterielle Kultivierung und Extraktion genomischer DNA
<ol><li>Säen Sie Y. ruckeri reine Kulturen auf jedem geeigneten Agar-Typ (die Autoren verwendeten 5% Rinderblut-Agar) und inkubieren bei 22 °C für 1-2 Tage, oder 15 °C für 3-4 Tage.</li>
	<li>Von jeder Agarplatte eine einzelne repräsentative Kolonie mit einer Impfschleife pflücken und in 1,5 ml Zentrifugenrohre übertragen, die 50 l ultragereinigtes Wasser enthalten. Kurz aufsetzen, wirbeln und 7 min auf einem Heizblock bei 100 °C inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 16 000 x g für 3 min und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand vorsichtig in ein leeres 1,5 ml Zentrifugenrohr zu übertragen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, indem Sie den Überstand als Vorlagen-DNA verwenden oder bei -20 °C speichern, bis dieser Zeitpunkt.</li>
</ol>2. Multiplex PCR-Setup und Cycling-Bedingungen
HINWEIS: Jede Multiplex-PCR-Reaktion (zwei pro Y. Ruckeri-Isolat) sollte 12,5 L des 2x Multiplex PCR Plus Master-Mix, 0,1 bis 0,2 m jedes geeigneten Primer-Paares (Tabelle1) und 3 l Vorlagen-DNA enthalten, angepasst auf ein endliegendes Reaktionsvolumen von 25 RNase-freies Wasser. Ziel ist es, die Lichteinwirkung der fluoreszierend gekennzeichneten Vorwärtsprimer auf ein Minimum zu beschränken (z. B. durch Umwickeln der Lagerrohre in Aluminiumfolie).
<ol><li>Für jeden der beiden Multiplex-PCR-Assays (Tabelle 1) bereiten Sie Mastermischungen wie oben beschrieben (ohne Vorlagen-DNA) entsprechend der Anzahl der Proben plus einer positiven und einer negativen Kontrolle vor. Lassen Sie außerdem ein Überschussvolumen von 10 % zu. Vortex mischt sich der vorbereitete Master sanft bei niedriger Geschwindigkeit.</li>
	<li>Verteilen Sie 22 L jedes Master-Mix separat in einzelne Brunnen auf PCR-Streifen oder Platten, je nach Anzahl der Proben, und fügen Sie jedem Bohrkörper 3 L Schablone hinzu (für positive bzw. negative Kontrollen verwenden Sie DNA aus einem verifizierten Y. ruckeri und ultrarifiziertem Wasser). Kurz versiegeln und zentrifugieren.</li>
	<li>Führen Sie alle Proben auf einem PCR-Thermocycler mit folgendem Programm aus: (i) 5 min bei 95 °C (ii) 30 Zyklen von 0,5 min bei 95 °C, 1,5 min bei 60 °C und 1 min bei 72 °C und (iii) 60 min bei 68 °C, gefolgt von einer Abkühlung auf 4 °C auf unbestimmte Zeit. Das Programm wird in weniger als 3 h abgeschlossen.</li>
</ol>3. PCR Amplicon Bestätigung durch Gelelektrophorese
<ol><li>Nach den Empfehlungen des Herstellers, bereiten Sie ein Volumen von 1,5% (w/v) Agarose Gel in 1x Tris-Borate-EDTA (TBE) Puffer geeignet für die Anzahl der PCR-Reaktionen getestet werden. Vor dem Gießen 5 l fluoreszierender Nukleinsäurefarbstoff pro 50 l Gellösung hinzufügen und mischen. Verwenden Sie Schalen und Kämme, je nach geeignetem Gießen, so dass eine angemessene Anzahl von Brunnen für DNA-Referenzleitern frei bleibt.</li>
	<li>Tauchen Sie das Gel nach der Einstellung in den 1x TBE-Puffer in ein GE-System. Mischen Sie 5 l PCR-Produkt zusammen mit 2 l Ladefarbstoff und Transfer zu Gelbrunnen. Fügen Sie als Referenz 5 l DNA-Leiter in leere Brunnen ein.</li>
	<li>Führen Sie das Gel mit 110 V pro 15 cm für ca. 1 h aus und verwenden Sie ein UV-basiertes Gel-Bildgebungs-/Visualisierungssystem, um das Vorhandensein mehrerer (bis zu fünf) Bänder zu überprüfen, die PCR-Amplicons darstellen (siehe Beispiel in Abbildung 1). Entsorgen Sie das Gel. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie die verbleibenden PCR-Produkte bei 4 °C bis zur weiteren Verarbeitung.</li>
</ol>4. Kapillarelektrophorese Setup und Laufbedingungen
<ol><li>Nach Bestätigung von PCR-Amplicons, verdünnen PCR-Produkte 1:10 (v/v) in gereinigtem Wasser. Kurz versiegeln, mischen und zentrieren.</li>
	<li>In einem Rauchschrank arbeiten, bereiten Sie ein Volumen des Master-Mix, bestehend aus 9 l Formamid und 0,5 l der Größe Standard pro PCR-Produkt (erlauben 10% Überschussvolumen). Vortex kurz und verteilen Sie 9,5 l in Brunnen auf einer Platte, die für das verfügbare CE-System geeignet ist, bevor Sie 0,5 l des verdünnten PCR-Produkts hinzufügen. Kurz versiegeln, mischen und zentrieren. ACHTUNG: Behandeln Sie mit Sorgfalt. Das Mischen von Formamid mit Wasser erzeugt Ameisensäure, die giftig ist.</li>
	<li>Mit Einem PCR-Thermocycler denaturieren Sie die Proben bei 95 °C für 3 min vor dem Abkühlen auf 4 °C unbegrenzt. Zentrifugieren Sie kurz und laden Sie die Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers auf ein kalibriertes CE-System.</li>
	<li>Fragmentanalyse CE mit Reagenzien entsprechend dem Gerät der Wahl und den folgenden Einstellungen: 60 °C; 5 s Injektionen bei 1,6 kV (32 V pro cm); 32 min Laufzeit bei 15 kV (300 V pro cm). Die CE-Fragmentanalyse von 24 Brunnen auf einer 24-Kapillare (50 cm) dauert in der Regel ca. 50 min.</li>
</ol>5. VNTR-Größenaufruf, Wiederholungszählerberechnung und MLVA-Profilierung
HINWEIS: Schritt 5.1 beschreibt Y. ruckeri VNTR CE Größe Aufrufen aus Elektropherogramm-Dateien, mit der spezifischen Software in Tabelle der Materialienaufgeführt . Weitere Informationen und Zur Problembehandlung finden Sie im Softwarehandbuch. Für die Verwendung anderer Software konsultieren Sie die entsprechenden Handbücher.
<ol><li>
Importieren Sie CE-Ergebnisdateien (zwei pro Y. ruckeri isolieren). Legen Sie die Analysemethode auf Microsatellite Default fest, und wählen Sie die entsprechende Produktauswahl unter Größenstandard aus, bevor Sie die Schaltfläche Analysieren drücken. Überprüfen Sie die korrekte Identifizierung von Größenstandardfragmenten über den Size Match Editor, und korrigieren Sie sichtbar fehlerhafte Zuordnungen.
	<ol>
<li>Nachdem Sie die zu lesenden Stichproben ausgewählt haben, drücken Sie die Schaltfläche Diagramme anzeigen, und drücken Sie Strg+A, um die Ansicht der Größentabellezu aktivieren. Halten Sie im oberen Bereich Strg gedrückt, während Sie auf die fünf Spitzen klicken, die die VNTR-Amplicons darstellen (zoomen Sie nach Bedarf). HINWEIS: Für jedes Multiplex-PCR-Produkt zeigt das Elektropherogramm fünf Spitzen, die auf die drei verwendeten Farbstoffe verteilt sind (siehe 5' Farbkennzeichnung von Vorwärtsprimern in Tabelle 1 und die beiden Beispiele in Abbildung 2).</li>
		<li>Drücken Sie Strg+G, um die Größentabellezu filtern, wobei nur die Merkmale der fünf hervorgehobenen Peaks angezeigt werden, und zeichnen Sie CE-Größenaufrufe für jeden VNTR-Lokus (mit Bezug auf Tabelle 1) für die nachgelagerte Anwendung auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um verzerrte Amplicon-Mobilitätsmuster während der CE zu berücksichtigen, berechnen Sie genaue VNTR-Wiederholungszahlen nach der nachstehenden Formel, wobei VNTR CE-Größenaufrufe zusammen mit ortsspezifischen Variablen verwendet werden (siehe Tabelle 1). Aus Gründen der Effizienz ist es ratsam, diesen Prozess zu automatisieren (z. B. mithilfe einer Tabellenvorlage). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59455/59455eq1.jpg">
</li>
	<li>Rund berechnete VNTR-Wiederholung zählt zur nächsten ganzzahligen Zahl und verketten sich in zehnstellige Zeichenfolgen, die jeweils das MLVA-Profil eines einzelnen Y.-Ruckeri-Isolats darstellen.</li>
</ol>6. Minimale Spanning Tree Cluster-Analyse von MLVA-Daten
HINWEIS: Schritt 6 beschreibt die Erstellung von MST-Diagrammen aus Y. ruckeri MLVA-Daten unter Verwendung der spezifischen Software, die in der Tabelle der Materialienaufgeführt ist. Weitere Informationen und Zur Problembehandlung finden Sie im Softwarehandbuch. Für die Verwendung anderer Software konsultieren Sie die entsprechenden Handbücher.
<ol><li>Erstellen Sie eine neue Datenbank und aktivieren Sie das MLVA-Plugin.</li>
	<li>Importieren Sie Y. ruckeri MLVA-Profile und Metadaten, indem Sie Zeichentypdaten gefolgt von Importfeldern und Zeichen auswählen (weitere Unterauswahl je nach Speicherformat). Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie Importregeln entsprechend dem Inhalt der Importdatei an: Klassifizieren Sie in der Spalte Zieltyp VNTR-Wiederholungszahlen als Zeichenwert: VNTRund die verschiedenen Metadaten als Eingabeinformationen: Eingabeinfofeld . HINWEIS: Zum Vergleich und Kontext ist es auch möglich, den gesamten veröffentlichten Datensatz (Open Access) zusammen mit dem Originalpapier unter Verwendung des vorliegenden MLVA-Protokolls14zu importieren. MLVA-Profile und Metadaten zur vielfältigen Sammlung von Y. ruckeri Isolaten (n = 484), die in dieser Studie untersucht werden, sind aus ihrem ergänzenden Material (Tabellen S1 und S2) unter folgendem Link erhältlich: https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files</li>
	<li>Öffnen Sie im Bedienfeld "Experiment" den VNTR-Eintrag, und legen Sie die Minimal- und Maximalwerte für jeden VNTR-Lokus auf 0 bzw. 100fest. Legen Sie unter Allgemeine Einstellungendie Anzahl der Dezimalstellen auf 0 fest, und wählen Sie Unter Datentyp Zahlen aus. Aktivieren Sie diese Option, um fehlende Werte als Null zu betrachten.</li>
	<li>
Wählen Sie importierte Stichproben aus, die für die MST-Clusteranalyse bestimmt sind, und klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Vergleicherstellen erstellen (im Vergleichsfenster).
	<ol>
<li>Ordnen Sie die Samples auf Wunsch für die visuelle Darstellung des MST farbigen Gruppen (z. B. nach einem bestimmten Metadatenmerkmal) zu, indem Sie die verschiedenen Optionen im Gruppenbedienfeld nutzen. HINWEIS: Gruppen können nach den folgenden Schritten auch nachträglich erstellt/verändert werden.</li>
		<li>Wählen Sie Erweiterte Clusteranalyse... und MST für kategoriale Daten aus, um ein MST-Diagramm basierend auf den ausgewählten Stichproben zu generieren.</li>
		<li>Ändern Sie die visuelle Darstellung des MST weiterhin als bevorzugt (z. B. durch Hinzufügen von Partitionierungsparametern, Knoten-/Zweigbeschriftung, Querverbindungen, Legenden usw.). Siehe Beispiel in Abbildung 3. HINWEIS: Ein Cluster-Partitionierungsschwellenwert (klonaler Komplex) von 4/10 nicht identischen VNTR-Loci wurde zusätzlich zum Ausblenden von Zweigverbindungen, die >5/10 nicht identische VNTR-Loci darstellen, zuvor für die MST-Clusteranalyse auf der Grundlage von MLVA-Daten verwendet. mit diesem Protokoll14. Sofern der oben genannte Datensatz von 484 Y. ruckeri MLVA-Profilen importiert wurde, können diese Beispiele auch für die MST-Clusteranalyse (wie oben beschrieben) eingeschlossen werden, um einen globalen und historischen Kontext zu liefern. Dies erleichtert z. B. die Identifizierung von Proben, die mit zuvor beschriebenen klonalen Komplexen verbunden sind, sowie von Proben, die noch unbeschriebene Abstammungslinien darstellen. Je nach verfügbaren Metadaten kann das resultierende MST-Diagramm auf unterschiedliche Weise überprüft werden, z. B. um eventuelle Clustering-Muster zu ermitteln, die mit bestimmten Merkmalen (Geographie, Host, Zeit usw.) verknüpft sind.</li>
		<li>Exportieren Sie bei Bedarf den fertigen MST in ein gewünschtes Format mit der Auswahl des Exportbilds.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+redmouth+disease+(ERM)+(Yersinia+ruckeri).">Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri).</a> Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).</li><li>Barnes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+analysis+of+Yersinia+ruckeri+isolated+over+27+years+in+Australia+and+New+Zealand+reveals+geographical+endemism+over+multiple+lineages+and+recent+evolution+under+host+selection.">Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection.</a> Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).</li><li>Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis+and+multi+locus+sequence+typing+for+characterizing+genotype+variability+of+Yersinia+ruckeri+isolated+from+farmed+fish+in+France.">Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France.</a> Veterinary Research. 46, 73 (2015).</li><li>Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+reveals+high+genetic+diversity+and+epidemic+population+structure+for+the+fish+pathogen+Yersinia+ruckeri.">Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri.</a> Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).</li><li>Wheeler, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+ruckeri+biotype+2+isolates+from+mainland+Europe+and+the+UK+likely+represent+different+clonal+groups.">Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).</li><li>Eyre, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multilocus+variable-number+tandem-repeat+analysis+and+whole-genome+sequencing+for+investigation+of+Clostridium+difficile+transmission.">Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Locus+Variable-Number+Tandem-Repeat+and+Single-Nucleotide+Polymorphism-Based+Brucella+Typing+Reveals+Multiple+Lineages+in+Brucella+melitensis+Currently+Endemic+in+China.">Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China.</a> Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).</li><li>Bouchouicha, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+performances+of+MLVA+vs.+the+main+other+typing+techniques+for+Bartonella+henselae.">Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae.</a> Clinical Microbiology and Infection. 15, 104-105 (2009).</li><li>Dahyot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-Locus+Variable+Number+Tandem+Repeat+Analysis+(MLVA)+and+Tandem+Repeat+Sequence+Typing+(TRST),+helpful+tools+for+subtyping+Staphylococcus+lugdunensis.">Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis.</a> Scientific Reports. 8 (1), (2018).</li><li>Elberse, K. E. M., Nunes, S., S&#225;-Le&#227;o, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-locus+variable+number+tandem+repeat+analysis+for+Streptococcus+pneumoniae:+Comparison+with+PFGE+and+MLST.">Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST.</a> PLoS ONE. 6 (5), (2011).</li><li>Matejusova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable-number+tandem-repeat+genotyping+of+Renibacterium+salmoninarum,+a+bacterium+causing+bacterial+kidney+disease+in+salmonid+fish.">Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish.</a> BMC microbiology. 13, 285 (2013).</li><li>Duodu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+multiple-locus+variable-number+of+tandem+repeat+analysis+(MLVA)+for+the+fish+pathogen+Francisella+noatunensis+using+capillary+electrophoresis.">An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis.</a> BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).</li><li>Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., S&#248;rum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable+number+tandem+repeat+analysis+of+Edwardsiella+piscicida+isolates+pathogenic+to+fish.">Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish.</a> Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).</li><li>Gulla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable-number+tandem-repeat+analysis+of+Yersinia+ruckeri+confirms+the+existence+of+host+specificity,+geographic+endemism,+and+anthropogenic+dissemination+of+virulent+clones.">Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).</li><li>Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cautionary+tale:+Lack+of+consistency+in+allele+sizes+between+two+laboratories+for+a+published+multilocus+microsatellite+typing+system.">A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).</li><li>Lista, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+Bacillus+anthracis+strains+based+on+automated+capillary+25-loci+multiple+locus+variable-number+tandem+repeats+analysis.">Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis.</a> BMC Microbiology. 6, 33 (2006).</li><li>. Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf</a> (2014)</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Beide multiplexPCRs, die hier vorgestellt wurden, erschienen angesichts der schlechten DNA-Qualität der Schablone relativ robust, aber der Mangel an PCR-Verstärkung wurde dennoch gelegentlich beobachtet, wenn Vorlagen mit extrem hohen DNA-Konzentrationen verwendet wurden. Diese Probleme wurden leicht gelöst, indem die Vorlagen vor pcR verdünnt wurden. Es können auch andere Methoden zur DNA-Extraktion als die hier verwendeten verwendet werden (z. B. kommerzielle Kits).
Obwohl von jeder Multiplex-PCR-Reaktion fünf Amplicons erwartet werden, sollten von GE nicht immer fünf visuell unterscheidbare Bänder erwartet werden, da einige (anders beschriftete) VNTR-Loci innerhalb derselben Reaktion überlappende Größenbereiche aufweisen. Die endgültige PCR-Verlängerungszeit von 60 min kann bei Bedarf verkürzt werden, wird aber wahrscheinlich zu einem erhöhten Auftreten von Splitpeaks in nachfolgenden CE-Elektropherogrammen führen (siehe unten). Da der Zweck des GE-Schritts ausschließlich der qualitativen Überprüfung von PCR-Amplicons dient, können die Laufzeit, die Spannung und/oder das Gelrezept wie gewünscht angepasst werden. Wenn GE besonders schwache Bänder beobachtet, kann es ratsam sein, den Verdünnungsfaktor dieser Proben vor CE zu reduzieren.
Während das hier beschriebene CE-Protokoll auf einem bestimmten kommerziellen Kapillarelektrophoresegerät ausgeführt wurde (siehe Materialtabelle),können verschiedene CE-Systeme unterschiedliche Probenanforderungen aufweisen, was wiederum zu einigen Änderungen am Protokoll führen kann. . Hinweise zur Fragmentanalyse finden Sie im Handbuch des jeweiligen CE-Systemherstellers. Es besteht auch die Möglichkeit, dass sich die während des CE beobachteten voreingenommenen Amplicon-Mobilitätsmuster relativ erweise zwischen CE-Systemen und/oder Maschinen unterscheiden, wie zuvor für andere MLVA-Protokolle15,16dokumentiert wurde. Wenn die stritten den letzten (gerundeten) VNTR-Wiederholungszähler, so müssen die ortsspezifischen Variablen s und i (Tabelle 1), die zur Bestimmung der VNTR-Wiederholungszahlen verwendet werden, neu kalibriert werden. Dies beinhaltet eine lineare Regression auf Diagrammen, die genaue Sequenzgrößen mit CE-Größenaufrufen vergleichen, wie von Gulla et al. 201814beschrieben.
Split-Peaks und Stotterspitzen, beides bekannte Artefakte in CE-basierter MLVA-Typisierung17, können bei Elektropherogrammen während des Größenaufrufs beobachtet werden (Abbildung 4). Während Stotterspitzen unberücksichtigt bleiben sollten, sollte der längere Peak bei geteilten Spitzen, die durch ein einzelnes Basispaar getrennt sind, konsequent für nachgeschaltete Anwendungen ausgewählt werden. Darüber hinaus sind fehlende Spitzen, die auf das Fehlen bestimmter VNTR-Loci hinweisen, selten, können jedoch auftreten, wobei eine Wiederholungszahl von '0' zugewiesen werden sollte. Wenn die Ausgangskultur, aus der DNA extrahiert wird, nicht rein ist (d.h. mehr als einen Y. ruckeri Subtyp enthält), können nach CE mehrere hohe Spitzen beobachtet werden, die verschiedenen Allelen desselben Lokus/Loci entsprechen. Sekundäre Kultivierungen müssen dann aus einzelnen Kolonien durchgeführt werden, bevor neue DNA-Extraktion für die Wiedertypisierung erfolgt.
Wie im Protokoll angegeben, sollte Die Vorlagen-DNA für PCR standardmäßig aus reinen Kulturen von Y. ruckeriextrahiert werden. In einigen Fällen wurden jedoch eifluidische Proben, die positiv auf Y. ruckeri durch qPCR (Ct-Werte < 27) getestet wurden, erfolgreich MLVA direkt, ohne vorherige Kultivierung, unter Verwendung einer erhöhten Menge an genomischer DNA (extrahiert mit kommerziellem Kit) als Vorlage. Obwohl dieser Ansatz nicht ausgiebig getestet oder verifiziert wurde, weist er auf das Potenzial dieses MLVA-Assays zur Untersuchung komplexer biologischer Matrizen hin, die neben Y. ruckeriauch DNA-haltige DNA aus einer Reihe verschiedener Organismen enthalten.
Das gesamte hier vorgestellte MLVA-Typisierungsverfahren, von der DNA-Extraktion bis zur epizootiologischen Auswertung, kann an einem einzigen Arbeitstag abgeschlossen werden. Die Anzahl der untersuchten Proben steht jedoch in einer sublinearen Beziehung zur Zeit, die für DNA-Extraktion, PCR und CE benötigt wird, und die Methode ist daher viel zeiteffizienter, wenn mehrere Proben gleichzeitig ausgeführt werden. Dies ist jedoch der Fall für die meisten Labor-basierten Methoden, und als Werkzeug für die epidemiologische Subtypisierung von Y. ruckerimacht die Kombination aus hoher Auflösung, Einfachheit und Portabilität diesen MLVA-Assay den zuvor veröffentlichten Protokollen überlegen4 ,5. Es wurde auch verwendet, um die begrenzte epidemiologische Relevanz von Y. ruckeri serotyping14zu überprüfen.
Durch eine umfassende MLVA-basierte Populationsstudie mit 484 Y. ruckeri Isolaten, die aus einer Reihe von raumzeitlichen Ursprüngen und Lebensräumen (Wirtsfische, Umwelt usw.) gewonnen wurden, haben wir verständnisvolle Informationen über die Epizootiologie und die Population Struktur dieses wichtigen Fischpathogens wurde deutlich erhöht14. Die MLVA-Typisierung ermöglichte die Rückverfolgung von Klonen, die über Jahrzehnte anthropogen verbreitet wurden, vermutlich durch den Transport von Fischen, sowie die Identifizierung lokal begrenzter Stämme. Während einige klonale Komplexe des Bakteriums eindeutig mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden könnten, insbesondere mit Fischwirten (Regenbogenforelle bzw. Atlantischer Lachs), wurden andere nur aus Umweltquellen und/oder klinisch nicht betroffenen Fischen geborgen. Exemplare. Die Anwendbarkeit des Verfahrens beschränkt sich daher nicht nur auf die Rückverfolgung von Infektionen, da sie auch Informationen von potenzieller Relevanz liefern kann, z. B. für die Entwicklung von Impfstoffen, die Risikobewertung und die Aufrechterhaltung der nationalen Biosicherheit. Es ist derzeit im aktiven Einsatz am Norwegischen Veterinärinstitut als Werkzeug zur Untersuchung von Y. ruckeri Diagnosen in der norwegischen Aquakultur.

Yersinia ruckeri, ein gramnegatives Bakterium und Mitglied der Familie der Yersiniaceae, verursacht Yersiniose bei Zuchtlachsfischen weltweit1. Es wird leicht von infizierten Fischen durch Anbau auf vielen Arten von Agar-Medien diagnostiziert, aber bis vor kurzem war wenig über die Populationsstruktur und Epizootiologie von Y. ruckeri auf der ganzen Welt und in verschiedenen Lebensräumen (Wirtsarten, etc.) bekannt. Bestehende Serotypisierungssysteme für Y. ruckeri sind inkonsistent, haben keine gegenseitige Kompatibilität und bieten eine geringe epidemiologische Auflösung. Einige molekulare Studien am Bakterium wurden durchgeführt, wobei Techniken wie Multilocus-Sequenztypisierung (MLST), Gepulste Gelelektrophorese (PFGE) oder Ganzgenomsequenzanalyse (WGS)2,3,4 ,5. MLST bietet jedoch keine ausreichend hohe Auflösung für die routinemäßige Infektionsverfolgung, während PFGE arbeitslastig ist und Ergebnisse liefert, die nicht ohne weiteres über Labors hinweg tragbar sind. Während die WGS-Analyse eine nahezu endgültige Lösung bringen würde, würde die Einrichtung und Durchführung solcher Analysen technische und bioinformatische Fähigkeiten voraussetzungen, die noch auf eine relativ kleine Anzahl von Laboratorien beschränkt bleiben.
Die Multi-Locus-Variablen-Zahlen-Tandem-Wiederholungsanalyse (MLVA) stellt ein einfaches und leicht zugängliches molekulares Typisierungswerkzeug dar, das in einigen Fällen eine genetische Lösung bietet, die fast der der WGS-Analyse6,7entspricht. Die Technik basiert auf der Wiederholungszahlvariation in ausgewählten VNTR-Loci (Variable Number Tandem-Repeat), was zu Ausgabedaten führt, die stark transportabel sind, wodurch der Vergleich von profilierten Isolaten mit Online-Datenbanken und über Labors hinweg einfach ist. Obwohl MLST nach wie vor der Goldstandard für die epidemiologische Typisierung vieler bakterieller Krankheitserreger ist, identifizieren immer mehr Studien eine signifikant höhere diskriminierende Leistung von MLVA8,9,10. Mehrere Protokolle wurden auch veröffentlicht, die auf fischpathogene Bakterien abzielen, wie Francisella noatunensis, Edwardsiella piscicida und Renibacterium salmoninarum11,12, 13.
Das hier vorgestellte MLVA-Protokoll von ten loci, das vor kurzem die Grundlage für eine umfangreiche Y. ruckeri Populationsstudie14bildete, beinhaltet die Extraktion von DNA aus agar-kultivierten Kolonien, Multiplex-PCR und Kapillarelektrophorese (CE), gefolgt von downstream in Silico-Anwendungen. Für jedes untersuchte Isolat werden zwei Multiplex-PCRs, die beide fünf fluoreszierend markierte Primerpaare (6FAM, NED oder VIC) enthalten, jeweils für einzelne VNTR-Regionen parallel unter identischen Bedingungen ausgeführt. Nach der Überprüfung von PCR-Amplicons durch Gelelektrophorese (GE) werden PCR-Produkte vor der CE-Analyse verdünnt, und Spitzen, die die jeweiligen VNTR-Loci darstellen, werden aus den resultierenden Elektropherogramm-Dateien größenmäßig bezeichnet. Zusammen mit ortsspezifischen Formeln, die kleinere, sequenzspezifische Abweichungen in CE-Migrationsmustern berücksichtigen, werden dann VNTR CE-Größenaufrufe zur Berechnung von VNTR-Wiederholungszahlen verwendet, die in zehnstellige MLVA-Profile verkettet sind. Diese werden als Eingabe für epizootiologische Auswertungen verwendet (z. B. durch Clusteranalyse in MST-Diagrammen (Minimum Spanning Tree).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >22&#176;C/15&#176;C incubator</td>
			<td >As preferred.</td>
			<td >NA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5&#39; Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>450007</td>
			<td>Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agarose, universal, peqGOLD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789P/732-2788</td>
			<td>Used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avant 3500xL Genetic Analyzer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30469</td>
			<td>Used for capillary electrophoresis fragment analysis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BioNumerics7 modules</td>
			<td>Applied Maths</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge(s)</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15612</td>
			<td>Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Loading dye used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Centrifuge tubes used during DNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freezer</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fume cupboard</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel electrophoresis system</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneMapper Software 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4475073</td>
			<td>Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0373</td>
			<td>DNA ladder used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4408399</td>
			<td>Size standard used during capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311320/4440753</td>
			<td>Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Milli-Q water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multiplex PCR&#160;Plus&#160;Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>206151/206152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR thermal cycler</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26077/4393713/4393709</td>
			<td>Separation matrix used during capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pure culture Yersinia ruckeri</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>E.g. cryopreserved or fresh.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>NA</td>
			<td>In: Multiplex PCR&#160;Plus&#160;Kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-borate-EDTA (TBE)&#160; buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsine soy agar/bovine blood agar</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-based gel imaging/visualisation system</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortexer</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-locus variable-number tandem-repeat analysis of the fish-pathogenic bacterium yersinia ruckeri by multiplex pcr and capillary electrophoresis

Yersinia ruckeri ist ein wichtiger Erreger von Zuchtsalmoniden weltweit, aber einfache Werkzeuge, die für epizootiologische Untersuchungen (Infektionsverfolgung, etc.) dieses Bakteriums geeignet sind, haben gefehlt. Ein Multi-Locus-System zur Variablenzahl (MLVA) wurde daher als leicht zugängliches und eindeutiges Werkzeug zur hochauflösenden Genotypisierung von wiedergewonnenen Isolaten entwickelt. Für den hier vorgestellten MLVA-Assay wird DNA aus kultivierten Y. ruckeri Proben extrahiert, indem Bakterienzellen in Wasser gekocht werden, gefolgt von der Verwendung von Überstand als Vorlage für PCR. Primer-Paare, die auf zehn Variable-Number Tandem-Repeat (VNTR) loci abzielen, die im gesamten Y. ruckeri-Genom durchsetzt sind, sind gleichmäßig auf zwei fünfplexe PCR-Reaktionen verteilt, die unter identischen Zyklusbedingungen laufen. Vorwärtsprimer sind mit einem der drei fluoreszierenden Farbstoffe gekennzeichnet. Nach Amplicon-Bestätigung durch Gelelektrophorese werden PCR-Produkte verdünnt und einer kapillaren Elektrophorese unterzogen. Aus den resultierenden Elektropherogrammprofilen werden Spitzen, die die einzelnen VNTR-Loci darstellen, größenmäßig bezeichnet und zur Berechnung der VNTR-Wiederholungszahlen in Silico verwendet. Daraus resultierende zehnstellige MLVA-Profile werden dann verwendet, um minimale Spannbäume zu generieren, die eine epizootiologische Auswertung durch Clusteranalyse ermöglichen. Die hochportablen Ausgabedaten in Form von numerischen MLVA-Profilen können schnell über Labore hinweg verglichen und in einen raumzeitlichen Kontext gestellt werden. Das gesamte Verfahren von der Kulturkolonie bis zur epizootiologischen Bewertung kann für bis zu 48 Y. ruckeri Isolate innerhalb eines einzigen Arbeitstages abgeschlossen werden.

Nach Multiplex-PCR, wie hier beschrieben, wird in Abbildung 1ein typisches GE-Bild gezeigt, das das Vorhandensein mehrerer Amplicons aus jeder PCR-Reaktion überprüft. Die nachgeschaltete CE-Fragmentanalyse, die an verifizierten PCR-Produkten durchgeführt wird, führt für jedes untersuchte Y. ruckeri-Isolat zu zwei Elektropherogrammdateien, die für den Größenaufruf der jeweiligen VNTR-Loci verwendet werden ( Abbildung2). Bei der Analyse von 484 verschiedenen Y. ruckeri Isolaten wurde keine Überlappung im Amplicon-Größenbereich zwischen VNTR-Loci beobachtet, die mit demselben Farbstoff in derselben Multiplexreaktion gekennzeichnet waren (Tabelle 1)14. Jeder der elektrophoretischen Spitzen kann daher eindeutig durch Farbe identifiziert werden.
Nach dem Import von MLVA-Profilen und relevanten Metadaten in die bevorzugte Software können MST-Diagramme wie beschrieben für die Prüfung etwaiger epidemiologischer Muster erstellt werden, die für das Material von Interesse sind. Weitere Optionen finden Sie in den entsprechenden Handbüchern der jeweiligen Software. Als Beispiel zeigt Abbildung 3 den Vergleich von MLVA-Profilen für Y. ruckeri-Isolate, die von Fischen gewonnen wurden, die mit fünf verschiedenen Lachsfarmen in Norwegen in Verbindung gebracht wurden, anhand von MST.
Die konsistenten Wiederholungsgrößen der zehn VNTR-Loci sowie deren In-vitro- und In-vivo-Stabilität wurden zuvor in der ursprünglichen Studie auf der Grundlage dieses Protokolls14überprüft. Kurz gesagt, wurde dies mit Sanger-Sequenzierung (Wiederholungsgröße) und durch MLVA-Typisierung mehrerer Isolate nach seriellen Passagen (in vitro) und innerhalb einzelner Krankheitsausbrüche (in vivo) durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Umweltstabilität der Loci im Laufe der Zeit untersucht, indem mehrere "Hausstamm"-Isolate eingegeben wurden, die über mehrere Jahre von anhaltend infizierten Süßwasserproduktionsstätten für Atlantischen Lachs geborgen wurden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig1.jpg"> Abbildung 1 : Gelelektrophorese zur Überprüfung des Vorhandenseins mehrerer PCR-Produkte. Das Bild bestätigt das Vorhandensein mehrerer PCR-Amplicons in allen 12 Bahnen, die Proben enthalten, wobei die erste Spur die verwendete DNA-Leiter darstellt. Die Größen ausgewählter Leiterfragmente wurden angegeben, ebenso wie der PCR-Assay und die Dehnung (siehe Tabelle S1 in Gulla et al. 201814) Zugehörigkeit jeder Spur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig2.jpg"> Abbildung 2 : Elektropherogramme, die Spitzen zeigen, die VNTR-Ampliconsentsprechen. Die Namen der verschiedenen VNTR-Loci sind mit Farbstoffetiketten (VIC = grün; NED = schwarz; 6FAM = blau) in Klammern. Die beiden Elektropherogramme (PCR-Assay 1 oben; PCR-Assay 2 unten) stammen aus der Eingabe eines einzelnen Y. ruckeri Isolat. Orange Peaks (Dye LIZ) stellen den verwendeten Größenstandard dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig3.jpg"> Abbildung 3 : Beispiel Mindestspannbaum für die epidemiologische Bewertung. Das Diagramm basiert auf MLVA-Profilen von Y. ruckeri Isolaten, die in fünf verschiedenen norwegischen Farmen (1-5; siehe Legende) von atlantischen Lachsen gewonnen wurden und wiederkehrende Yerisnioseausbrüche erfahren. Eine deutliche Cluster-Tendenz, die mit dem Ursprung landwirtschaftlicher Betriebe verbunden ist, ist zu beobachten. Querlinks zeigen alle möglichen Verbindungen mit nicht identischen VNTR-Loci mit der Größe 1/10 (siehe Legende). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig4.jpg"> Abbildung 4 : Elektropherogramm visualisiert Stotter- und Split-Peaks. In diesem Fall treten beide gleichzeitig auf, was nicht immer der Fall ist. Die längere und höhere Spitze, die den YR1070 VNTR-Lokus darstellt, lässt sich leicht unterscheiden. Das Display ist vergrößert und zeigt nur blaue Färbespitzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59455/59455table1.jpg"> Tabelle 1: Eigenschaften des VNTR-Lokus. Relevante Merkmale der zehn Y. ruckeri VNTR-Regionen, die im vorliegenden MLVA-Protokoll zum Ziel sind.

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Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Der hier vorgestellte Multi-Locus Variable-number Tandem-Repeat Analysis (MLVA)-Assay ermöglicht eine kostengünstige, robuste und tragbare hochauflösende Genotypisierung des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri. Ausgehend von reinen Kulturen verwendet der Assay Multiplex-PCR- und Kapillarelektrophorese, um zehn Loci MLVA-Profile für nachgelagerte Anwendungen zu erstellen.

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analyse des Fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri durch Multiplex-PCR und Kapillarelektrophorese

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Dieses MLB-Genotypisierungsprotokoll hat unser Verständnis der Epidemiologie und der globalen Populationsstruktur von Yersinia ruckeri, einem international wichtigen Fischpathogenbakterium, erheblich verbessert. Im Vergleich zu den zuvor etablierten Yersini ruckeri Typisierungsschemata bietet es eine sehr hohe Dehnungsauflösung. Das Verfahren ist einfach, billig und vergibt tragbare Ergebnisse, die leicht in Laboratorien verglichen werden können.Die Technik verbessert die diagnostische Spezifität erheblich und ermöglicht die Rückverfolgung von Infektionen. Zum Beispiel können wir jetzt oft virulente Yersinia ruckeri Klone unterscheiden, die vor dem Hintergrund nicht-virulenter Umweltbelastungen existieren. Demonstriert wird das Verfahren von Saima Nasrin Mohammad, einer Technikerin in unserem Labor.Um zu beginnen, verwenden Sie sterile Impfschlaufen, um Yersinia ruckeri reine Kulturen auf jedem geeigneten Agar-Typ auf Petri-Gerichte zu säen. Bei 22 Grad Celsius für ein bis zwei Tage oder 15 Grad Celsius für drei bis vier Tage inkubieren. Danach, mit Impfschleifen, wählen Sie eine einzige repräsentative Kolonie aus jeder Petrischale und übertragen Sie auf 1,5-Milliliter Zentrifugenrohre, die 50 Mikroliter ultra gereinigtes Wasser enthalten, um wieder zu suspendieren.Wirbel kurz und inkubieren für sieben Minuten auf einem Heizblock bei 100 Grad Celsius. Dann zentrifugieren Sie bei 16.000 g für drei Minuten und verwenden Sie eine Pipette, um die überstande Schablonen-DNA sorgfältig in leere 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhren zu übertragen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder speichern Sie die DNA bei 20 Grad Celsius.Zur Herstellung von Mastermischungen berechnen Sie zunächst die Reagenzvolumina nach der Anzahl der zu analysierenden Bakterienproben, wobei auch eine negative und eine positive Kontrolle und ein endgültiges Überschussvolumen von 10 %, wie im Manuskript beschrieben, berücksichtigt werden. Beachten Sie, dass unterschiedliche Primerkonzentrationen verwendet werden. In zwei separaten Zentrifugenröhren, einer pro PCR-Assay, multiplex PCR plus Master-Mix, Primer und RNase-freies Wasser hinzufügen.Vortex mischt der vorbereitete Master sanft bei niedriger Geschwindigkeit und verteilt dann 22 Mikroliter jedes Master-Mix separat in einzelne Brunnen auf PCR-Streifen oder Platten. Fügen Sie dann drei Mikroliter der vorbereiteten DNA-Vorlage zu jedem Brunnen enthaltenden Master-Mix hinzu;zwei Brunnen pro Bakterienprobe, einer für jeden Test. Verwenden Sie DNA von einem verifizierten Yersinia ruckeri Stamm für eine positive Kontrolle, und ultra gereinigtes Wasser für eine negative Kontrolle.Kurz versiegeln und zentrifugieren. Laden Sie die vorbereiteten Reaktionen auf einen PCR-Thermocycler und richten Sie das Programm entsprechend dem Manuskript ein. Das Programm wird in weniger als drei Stunden abgeschlossen.Nach den Empfehlungen des Herstellers, fügen Sie Agarose GelPulver in einem Mal TBE Puffer zu erreichen 1,5 Gewicht / Volumen Prozent und Wärme zu lösen. Vor dem Gießen die gelöste Gellösung kurz unter fließendem Wasser abkühlen lassen, 5 Mikroliter fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff pro 50 Mikroliter Gellösung hinzufügen und mischen. Montieren und nivellieren Sie das Gussfach.Fügen Sie entsprechend der Anzahl der Proben Kegel hinzu. Gießen Sie die Gellösung in den Guss und warten Sie, bis sie erstarrt. Danach tauchen Sie den Guss, der das Gel enthält, in einem TBE-Puffer in einem Gelelektrophoresesystem unter.Mischen Sie fünf Mikroliter der PCR-Produkte zusammen mit zwei Mikrolitern Ladefarbstoff in neuen PCR-Streifen. Fünf Mikroliter der Mischungen in die Brunnen im Gel geben. Sparen Sie mindestens einen gut leer.Fügen Sie fünf Mikroliter DNA-Leiter in den leeren Brunnen als Referenz. Stecken Sie die Elektroden ein und führen Sie das Gel mit 110 Volt pro 15 Zentimeter für etwa eine Stunde. Verwenden Sie ein UV-basiertes Gel-Bildgebungssystem, um das Vorhandensein mehrerer Bänder zu überprüfen, die PRC-Amplicons darstellen.Nach bestätigung von PCR-Amplicons verwenden Sie neue PCR-Streifen oder Platten, um PCR-Produkte eins bis zehn in gereinigtem Wasser zu verdünnen. Wirbel und Zentrifuge kurz. Bereiten Sie während der Arbeit in einem Rauchschrank eine Mastermischung in einem Zentrifugenrohr vor, das aus Formamid und Referenzgröße besteht.Verwenden Sie gemäß der Anzahl der zu analysierenden PCR-Produkte reagenzien, wie im Manuskript beschrieben. Erlauben Sie ein Überschussvolumen von 10 %. Wirbel kurz und verteilen Sie 9,5 Mikroliter in einzelne Brunnen auf einer PCR-Platte passend für das verfügbare Kapillarelektrophoresesystem.Fügen Sie dann 0,5 Mikroliter verdünntes PCR-Produkt hinzu. Kurz versiegeln und zentrifugieren. Dann laden Sie die Platte mit den Proben in einen PCR-Thermocycler und denaturieren Sie die Proben bei 95 Grad Celsius für drei Minuten, bevor Sie auf unbestimmte Zeit auf vier Grad Celsius abkühlen.Zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1000 g, entfernen Sie vorsichtig die Dichtung und laden Sie die Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers auf ein kalibriertes Kapillarelektrophoresesystem. Führen Sie die Kapillarelektrophorese der Fragmentanalyse mit Reagenzien entsprechend dem Gerät Ihrer Wahl durch und passen Sie die Laufbedingungen entsprechend der Beschreibung im Manuskript an. Für Yersinia ruckeri VNTR Kapillarelektrophorese Größe Aufrufen, importieren Sie zuerst Kapillarelektrophorese Ergebnisdateien in Gene Mapper 5 Software.Legen Sie die Analysemethode auf Microsatellite Default fest, wählen Sie die entsprechende Produktauswahl unter Größenstandard aus, und drücken Sie dann die Schaltfläche Analysieren. Überprüfen Sie im Größenübereinstimmungseditor die korrekte Identifizierung von Größenstandardfragmenten und korrigieren Sie sichtbar fehlerhafte Zuordnungen. Wählen Sie dann das zu lesende Beispiel aus, drücken Sie die Schaltfläche Plot anzeigen, und drücken Sie Control A, um die Ansicht der Größentabelle zu aktivieren.Halten Sie im oberen Bereich die Taste "Steuerung" gedrückt, während Sie auf die fünf Spitzen klicken, die die VNTR-Amplicons darstellen. Drücken Sie Control G, um die Größentabelle zu filtern, wobei nur die Merkmale der fünf hervorgehobenen Spitzen angezeigt werden, und notieren Sie die Größenaufrufe für jeden VNTR-Standort für die nachgelagerte Anwendung. Um verzerrte Amplikon-Mobilitätsmuster während der Kapillarelektrophorese zu berücksichtigen, berechnen Sie genaue VNTR-Wiederholungszahlen, indem Sie die erworbenen Größenaufrufe in Kombination mit den lokusspezifischen Variablen verwenden.Die Formel kann in einer Tabellenvorlage für die Automatisierung implementiert werden. In der Kalkulationstabelle zählt die runde berechnete VNRT-Wiederholung vor der Nachgelagerten Analyse auf die nächste ganze Zahl. Erstellen Sie in der BioNumerics-Software eine neue Datenbank, und aktivieren Sie das MLVA-Plugin.Drücken Sie im Experimenttypbedienfeld die Option Neuer Versuchstyp erstellen, wählen Sie Zeichentyp aus, und verwenden Sie die Standardeinstellungen, wenn Sie danach gefragt werden. Wählen Sie dann das neue Experiment aus, und fügen Sie für jeden der 10 VNTR-Loci neue Zeichen hinzu, wobei Null bis 100 als Wertebereich verwendet wird. Importieren Sie yersinia ruckeri VNTR-Wiederholungszahlen und Methodendaten, indem Sie Importfelder und Zeichen auswählen.Suchen Sie die Datei, in der diese gespeichert ist, und treffen Sie eine Auswahl in der Spalte Zieltyp. Für die VNTRs bedeutet dies, dass der entsprechende Zeichenwert ausgewählt wird, während die verschiedenen Metadaten als Eingabeinfofelder klassifiziert werden. Die getroffenen Entscheidungen können als Vorlage gespeichert werden, um den Prozess für später zu vereinfachen.Wählen Sie importierte Stichproben aus, die für die MST-Clusteranalyse bestimmt sind, und klicken Sie dann im Bereich Vergleiche auf die Schaltfläche Neue Vergleiche erstellen. Ordnen Sie die Samples bei Bedarf für die visuelle Darstellung des MST farbigen Gruppen zu, z. B. entsprechend einer bestimmten Metadatenfunktion. Wählen Sie dann Erweiterte Clusteranalyse und MST für kategoriale Daten aus, um ein MST-Diagramm basierend auf den ausgewählten Stichproben zu generieren.Ändern Sie die visuelle Darstellung des MST weiter, indem Sie Partitionsparameter, Querlängen, Knotenverzweigungsbeschriftungusw. hinzufügen. Exportieren Sie bei Bedarf den fertigen MST in ein gewünschtes Format mit der Auswahl des Exportbilds. Nach Multiplex-PCR überprüft das Gelelektrophoresebild das Vorhandensein mehrerer Amplicons in allen 12 Spuren, die Proben enthalten, wobei die erste Spur die verwendete DNA-Leiter darstellt.Bei Elektropherogrammen, die aus der Kapillarelektrophorese resultieren, können die verschiedenen VNTR-Loci anhand einer Kombination aus Größe und Farbstoffbeschriftung identifiziert werden. Orange Peaks stellen den verwendeten Größenstandard dar. Ein Beispiel für minimalen Spannbaum, basierend auf MLVA-Profilen von Yersinia Ruckeri Isolaten, die in fünf verschiedenen norwegischen Farmen aus atlantischem Lachs gewonnen wurden, wird gezeigt.Eine deutliche Cluster-Tendenz, die mit dem Ursprung landwirtschaftlicher Betriebe verbunden ist, ist zu beobachten. Die Identifizierung verschiedener Yersini-Ruckeri-Klone durch MLVA, die beispielsweise in bestimmten geographischen Regionen von Fischarten dominieren, wurde bereits genutzt, um die Impfstrategien gegen diesen Erreger zu verbessern.

Research

JoVE Journal

Genetics

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Forschung

Genetik

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, GenomEditing und Phenotypisierung der Stickstoff-fixierenden tropischen Cannabaceae Baum Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Diskrimintion und Mapping der primären und verarbeiteten Transkripte in Mais mitochondrion mit einer kreisförmigen RT-PCR-basierten Strategie

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Untersuchung der Transkriptionsrolle eines RUNX1 Intronic Schalldämpfers durch CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in akuten myeloischen Leukämiezellen

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Nachweis von Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts bei Patienten durch Strand-spezifische RT-PCR

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Charakterisierung der In-Vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch RNA-Seq-Analyse

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...