Name: multi-locus variable-number tandem-repeat analysis of the fish-pathogenic bacterium yersinia ruckeri by multiplex pcr and capillary electrophoresis
Uploaded: 2019-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis at JoVE.co

वर्तमान अध्ययन नार्वे समुद्री भोजन अनुसंधान कोष, FHF (परियोजना nos. 901119 और 901505) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम जीवाणु अलग और विधि विकास के दौरान इस्तेमाल नमूने के सभी योगदानकर्ताओं का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.

<ol>
	<li>Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+redmouth+disease+(ERM)+(Yersinia+ruckeri).">Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri).</a> Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).</li><li>Barnes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+analysis+of+Yersinia+ruckeri+isolated+over+27+years+in+Australia+and+New+Zealand+reveals+geographical+endemism+over+multiple+lineages+and+recent+evolution+under+host+selection.">Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection.</a> Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).</li><li>Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis+and+multi+locus+sequence+typing+for+characterizing+genotype+variability+of+Yersinia+ruckeri+isolated+from+farmed+fish+in+France.">Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France.</a> Veterinary Research. 46, 73 (2015).</li><li>Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+reveals+high+genetic+diversity+and+epidemic+population+structure+for+the+fish+pathogen+Yersinia+ruckeri.">Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri.</a> Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).</li><li>Wheeler, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+ruckeri+biotype+2+isolates+from+mainland+Europe+and+the+UK+likely+represent+different+clonal+groups.">Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).</li><li>Eyre, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multilocus+variable-number+tandem-repeat+analysis+and+whole-genome+sequencing+for+investigation+of+Clostridium+difficile+transmission.">Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Locus+Variable-Number+Tandem-Repeat+and+Single-Nucleotide+Polymorphism-Based+Brucella+Typing+Reveals+Multiple+Lineages+in+Brucella+melitensis+Currently+Endemic+in+China.">Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China.</a> Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).</li><li>Bouchouicha, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+performances+of+MLVA+vs.+the+main+other+typing+techniques+for+Bartonella+henselae.">Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae.</a> Clinical Microbiology and Infection. 15, 104-105 (2009).</li><li>Dahyot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-Locus+Variable+Number+Tandem+Repeat+Analysis+(MLVA)+and+Tandem+Repeat+Sequence+Typing+(TRST),+helpful+tools+for+subtyping+Staphylococcus+lugdunensis.">Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis.</a> Scientific Reports. 8 (1), (2018).</li><li>Elberse, K. E. M., Nunes, S., S&#225;-Le&#227;o, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-locus+variable+number+tandem+repeat+analysis+for+Streptococcus+pneumoniae:+Comparison+with+PFGE+and+MLST.">Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST.</a> PLoS ONE. 6 (5), (2011).</li><li>Matejusova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable-number+tandem-repeat+genotyping+of+Renibacterium+salmoninarum,+a+bacterium+causing+bacterial+kidney+disease+in+salmonid+fish.">Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish.</a> BMC microbiology. 13, 285 (2013).</li><li>Duodu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+multiple-locus+variable-number+of+tandem+repeat+analysis+(MLVA)+for+the+fish+pathogen+Francisella+noatunensis+using+capillary+electrophoresis.">An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis.</a> BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).</li><li>Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., S&#248;rum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable+number+tandem+repeat+analysis+of+Edwardsiella+piscicida+isolates+pathogenic+to+fish.">Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish.</a> Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).</li><li>Gulla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable-number+tandem-repeat+analysis+of+Yersinia+ruckeri+confirms+the+existence+of+host+specificity,+geographic+endemism,+and+anthropogenic+dissemination+of+virulent+clones.">Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).</li><li>Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cautionary+tale:+Lack+of+consistency+in+allele+sizes+between+two+laboratories+for+a+published+multilocus+microsatellite+typing+system.">A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).</li><li>Lista, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+Bacillus+anthracis+strains+based+on+automated+capillary+25-loci+multiple+locus+variable-number+tandem+repeats+analysis.">Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis.</a> BMC Microbiology. 6, 33 (2006).</li><li>. Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf</a> (2014)</li></ol>

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

यहाँ प्रस्तुत दोनों मल्टीप्लेक्स पीसीआर गरीब टेम्पलेट डीएनए गुणवत्ता के चेहरे में अपेक्षाकृत मजबूत दिखाई दिया है, लेकिन पीसीआर प्रवर्धन की कमी फिर भी कभी कभी जब अत्यंत उच्च डीएनए सांद्रता के साथ टेम्पलेट्स का उपयोग कर मनाया गया था. इन मुद्दों को आसानी से पीसीआर से पहले टेम्पलेट्स diluting द्वारा हल किया गया. डीएनए निष्कर्षण के लिए अन्य तरीकों से एक यहाँ कार्यरत भी इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, वाणिज्यिक किट).
हालांकि पांच amplicons प्रत्येक मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्रतिक्रिया से उम्मीद कर रहे हैं, पांच नेत्रहीन भेद करने योग्य बैंड हमेशा जीई से उम्मीद नहीं की जानी चाहिए, के रूप में कुछ (अलग लेबल) एक ही प्रतिक्रिया के भीतर VNTR loci आकार पर्वतमाला ओवरलैपिंग है. अंतिम पीसीआर विस्तार समय 60 मिनट के यदि आवश्यक हो तो छोटा किया जा सकता है, लेकिन संभावना बाद CE electropherograms में विभाजन चोटियों की वृद्धि हुई घटना में परिणाम होगा (नीचे देखें). विशेष रूप से, जीई कदम के उद्देश्य के रूप में पीसीआर amplicons के गुणात्मक सत्यापन के लिए विशुद्ध रूप से है, चलाने के समय, वोल्टेज और / यदि विशेष रूप से कमजोर बैंड जीई द्वारा मनाया जाता है, यह CE से पहले उन नमूनों के कमजोर पड़ने कारक को कम करने के लिए सलाह दी जा सकती है.
जबकि CE प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित एक विशिष्ट वाणिज्यिक केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस उपकरण पर चलाया गया था (सामग्री की तालिकादेखें), विभिन्न CE सिस्टम अलग नमूना आवश्यकताओं है, जो बारी में प्रोटोकॉल के लिए कुछ संशोधनों का संकेत हो सकता है हो सकता है . टुकड़ा विश्लेषण के लिए उपयुक्त अभिकर्मकों/उपकरण, अंशांकन आदि पर निर्देशों के लिए संबंधित सीई प्रणाली निर्माता के मैनुअल को देखें। यह भी संभावना है कि CE के दौरान मनाया पक्षपाती amplicon गतिशीलता पैटर्न अलग हो सकता है, अपेक्षाकृत, CE प्रणालियों और / यदि किसी सीमा तक होने वाली है जहाँ अंतिम (गोल) VNTR दोहराने की गणना प्रभावित हो जाती है, तो इसका अर्थ है कि टिड्डी-विशिष्ट चर s और I (तालिका1), VNTR दोहराने की गणना निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है, फिर से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। यह गुगल एट अल द्वारा वर्णित के रूप में सटीक अनुक्रम आकार बनाम CE आकार कॉलकी तुलना भूखंडों पर रैखिक प्रतिगमन शामिल है।
विभाजन चोटियों और हकलाना चोटियों, CE आधारित MLVA टाइपिंग17में दोनों प्रसिद्ध कलाकृतियों, आकार बुला के दौरान इलेक्ट्रोफेरोग्राम में मनाया जा सकता है (चित्र 4)। जबकि हकलाना चोटियों उपेक्षा की जानी चाहिए, लंबे समय तक चोटी लगातार एक एकल आधार जोड़ी द्वारा अलग विभाजित चोटियों के मामले में बहाव अनुप्रयोगों के लिए चुना जाना चाहिए. इसके अलावा, अनुपस्थित चोटियों विशेष VNTR loci की कमी का संकेत दुर्लभ हैं, लेकिन हो सकता है, जो मामले में '0' की एक दोहराने गिनती सौंपा जाना चाहिए. यदि प्रारंभिक संस्कृति जिससे डीएनए निकाला जाता है शुद्ध नहीं है (यानी, एक से अधिक वाई ruckeri उप-प्रकार शामिल हैं), कई लंबा चोटियों एक ही टिड्डी के विभिन्न alleles के लिए इसी / माध्यमिक खेती तो फिर पुन: टाइपिंग के लिए नए डीएनए निष्कर्षण से पहले एकल कालोनियों से किया जाना चाहिए.
जैसा कि प्रोटोकॉल में कहा गया है, पीसीआर के लिए टेम्पलेट डीएनए डिफ़ॉल्ट रूप से वाई ruckeriकी शुद्ध संस्कृतियों से निकाला जाना चाहिए। कुछ मामलों में, तथापि, अंडे तरल नमूने QPCR द्वारा वाई ruckeri के लिए सकारात्मक परीक्षण (Ct-values और lt; 27) सफलतापूर्वक MLVA सीधे टाइप किया गया, पूर्व culturing के बिना, जीनोमिक डीएनए की एक बढ़ी हुई राशि का उपयोग कर (वाणिज्यिक किट के साथ निकाला) टेम्पलेट के रूप में. हालांकि इस दृष्टिकोण का व्यापक रूप से परीक्षण नहीं किया गया है और न ही सत्यापित किया गया है, यह वाई ruckeriके अलावा विभिन्न जीवों की एक श्रृंखला से डीएनए युक्त जटिल जैविक matrices की परीक्षा के लिए इस MLVA परख की क्षमता का संकेत देता है.
डीएनए निष्कर्षण से एपिजोटोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए यहां प्रस्तुत पूरे MLVA टाइपिंग प्रक्रिया, एक ही कार्य दिवस में पूरा किया जा सकता है। हालांकि, जांच नमूनों की संख्या डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर और CE के लिए आवश्यक समय के साथ एक sublinear संबंध में है, और विधि इसलिए बहुत अधिक समय कुशल है जब एक साथ कई नमूने चल रहा है. यह फिर भी सबसे प्रयोगशाला आधारित तरीकों के लिए मामला है, और वाई ruckeriके महामारी विज्ञान subtyping के लिए एक उपकरण के रूप में, उच्च संकल्प, सादगी और पोर्टेबिलिटी के संयोजन इस MLVA परख पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल से बेहतर बनाता है4 ,5. यह भी वाई ruckeri serotyping14की सीमित महामारी विज्ञान प्रासंगिकता को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
एक व्यापक MLVA आधारित जनसंख्या अध्ययन के माध्यम से 484 Y. ruckeri अलग spatiotemporal मूल और निवास (होस्ट मछली, पर्यावरण, आदि) की एक श्रृंखला से बरामद, epizootiology और जनसंख्या के बारे में हमारी समझ इस महत्वपूर्ण मछली रोगजनक की संरचना में काफी वृद्धिहुईथी . MLVA टाइपिंग क्लोन के अनुरेखण सक्षम दशकों में मानववंशी प्रसारित, शायद मछली के परिवहन के माध्यम से, साथ ही स्थानीय रूप से सीमित उपभेदों की पहचान. इसके अलावा, जबकि जीवाणु के कुछ क्लोनल परिसरों स्पष्ट रूप से विशेष रूप से मछली मेजबान में रोग के साथ जुड़ा हो सकता है (रेनबो ट्राउट और अटलांटिक सामन, क्रमशः), दूसरों को केवल पर्यावरण ीय स्रोतों से बरामद किया गया और / नमूनों. इस विधि की प्रयोज्यता न केवल संक्रमण अनुरेखण तक ही सीमित है, क्योंकि यह वैक्सीन के विकास, जोखिम मूल्यांकन, और राष्ट्रीय जैव सुरक्षा के रखरखाव के लिए संभावित प्रासंगिकता जैसे की जानकारी भी प्रदान कर सकती है। यह वर्तमान में नार्वे जलकृषि में वाई ruckeri निदान की जांच के लिए एक उपकरण के रूप में नार्वे पशु चिकित्सा संस्थान में सक्रिय उपयोग में है.

Yersinia ruckeri,एक ग्राम नकारात्मक जीवाणु और Yersiniaceae परिवार के सदस्य, दुनिया भर में खेती salmonid मछली में yersiniosis का कारण बनताहै 1. यह आसानी से agar मीडिया के कई प्रकार पर खेती से संक्रमित मछली से निदान किया है, लेकिन हाल ही में जब तक, थोड़ा जनसंख्या संरचना और Y ruckeri के epizootiology के बारे में दुनिया भर में और विभिन्न निवास स्थानों (होस्ट प्रजातियों, आदि) के बारे में जाना जाता था. वाई ruckeri के लिए मौजूदा serotyping प्रणाली असंगत हैं, आपसी संगतता की कमी है और कम महामारी विज्ञान संकल्प की पेशकश. जीवाणु पर कुछ आणविक अध्ययन किए गए हैं, मल्टीलोकस अनुक्रम टाइपिंग (एमएलएसटी), स्पंदित क्षेत्र जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (पीएफजीई) या पूरे जीनोम अनुक्रम (डब्ल्यूजीएस) विश्लेषण2,3,4 जैसी तकनीकों को रोजगार देते हुए ,5. हालांकि, MLST नियमित संक्रमण अनुरेखण के लिए एक पर्याप्त उच्च संकल्प प्रदान नहीं करता है, जबकि PFGE श्रम की मांग है और परिणाम है कि प्रयोगशालाओं में आसानी से पोर्टेबल नहीं हैं पैदा करता है. जबकि WGS विश्लेषण एक निकट अंतिम संकल्प प्रदान करेगा, स्थापना और इस तरह के विश्लेषण के कार्यान्वयन के लिए आवश्यक तकनीकी और bioinformatics क्षमताओं है कि अभी तक प्रयोगशालाओं की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या तक ही सीमित रहना होगा.
मल्टी-लोक्स चर-संख्या अग्रानुक्रम-पुनरावृत्ति विश्लेषण (एमएलवीए) एक सरल और आसानी से सुलभ आणविक टाइपिंग उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, जो कुछ मामलों में आनुवंशिक संकल्प प्रदान करता है जो लगभग WGS विश्लेषण6,7के मिलान करता है। तकनीक चयनित चर संख्या अग्रानुक्रम-पुनरावृत्ति (VNTR) loci में दोहराने संख्या भिन्नता पर आधारित है, उत्पादन डेटा है कि अत्यधिक परिवहनीय है में जिसके परिणामस्वरूप, ऑनलाइन डेटाबेस की ओर profiled isolates की तुलना कर रही है और प्रयोगशालाओं में सीधा. यद्यपि एमएलएसटी कई जीवाणु रोगजनकों के महामारी विज्ञान के लिए स्वर्ण मानक बना हुआ है , फिर भी अध्ययनों की बढ़ती संख्या एमएलवीए8,9,10की काफी अधिक भेदभावपूर्ण शक्ति की पहचान करती है . कई प्रोटोकॉल भी मछली-रोगजनक बैक्टीरिया को लक्षित प्रकाशित किया गया है, जैसे फ्रांसिसेला नोटानुनेन्सिस, एडवर्ड्सीला पिसिसिडा और रेनीबैक्टीरियम सैल्मोनिनेरम11,12, 13.
दस-लोकी MLVA प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत किया है, जो हाल ही में एक व्यापक वाई ruckeri जनसंख्या अध्ययन14के लिए आधार का गठन, agar-कृषि कालोनियों, मल्टीप्लेक्स पीसीआर और केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस (सीई) से डीएनए की निकासी शामिल है, silico अनुप्रयोगों में बहाव के बाद. प्रत्येक जांचे गए अलग-अलग के लिए, दो मल्टीप्लेक्स पीसीआर, जिनमें पांच फ्लोरोसेंट लेबल प्राइमर जोड़े (6FAM, NED या VIC) शामिल हैं, प्रत्येक लक्षित अलग-अलग VNTR क्षेत्र, समान परिस्थितियों में समानांतर में चलाए जाते हैं। जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (जीई) द्वारा पीसीआर amplicons के सत्यापन के बाद, पीसीआर उत्पादों CE विश्लेषण से पहले पतला कर रहे हैं, और संबंधित VNTR loci का प्रतिनिधित्व चोटियों आकार जिसके परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोफेरोग्राम फ़ाइलों से कहा जाता है। सीई प्रवासी पैटर्न में लघु, अनुक्रम-विशिष्ट विसंगतियों के लिए लेखांकन टिड्डी-विशिष्ट सूत्रों के साथ, VNTR CE आकार कॉल तो VNTR दोहराने की गणना के लिए नियोजित कर रहे हैं जो दस अंकों MLVA प्रोफाइल में concatenated हैं. ये epizootiological मूल्यांकन के लिए इनपुट के रूप में उपयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, न्यूनतम फैले पेड़ (एमएसटी) आरेख में क्लस्टर विश्लेषण द्वारा).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >22&#176;C/15&#176;C incubator</td>
			<td >As preferred.</td>
			<td >NA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5&#39; Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>450007</td>
			<td>Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agarose, universal, peqGOLD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789P/732-2788</td>
			<td>Used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avant 3500xL Genetic Analyzer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30469</td>
			<td>Used for capillary electrophoresis fragment analysis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BioNumerics7 modules</td>
			<td>Applied Maths</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge(s)</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15612</td>
			<td>Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Loading dye used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Centrifuge tubes used during DNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freezer</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fume cupboard</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel electrophoresis system</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneMapper Software 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4475073</td>
			<td>Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0373</td>
			<td>DNA ladder used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4408399</td>
			<td>Size standard used during capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311320/4440753</td>
			<td>Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Milli-Q water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multiplex PCR&#160;Plus&#160;Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>206151/206152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR thermal cycler</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26077/4393713/4393709</td>
			<td>Separation matrix used during capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pure culture Yersinia ruckeri</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>E.g. cryopreserved or fresh.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>NA</td>
			<td>In: Multiplex PCR&#160;Plus&#160;Kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-borate-EDTA (TBE)&#160; buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsine soy agar/bovine blood agar</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-based gel imaging/visualisation system</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortexer</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-locus variable-number tandem-repeat analysis of the fish-pathogenic bacterium yersinia ruckeri by multiplex pcr and capillary electrophoresis

Yersinia ruckeri दुनिया भर में खेती salmonids का एक महत्वपूर्ण रोगज़नक़ है, लेकिन इस जीवाणु के epizootiological जांच (संक्रमण अनुरेखण, आदि) के लिए उपयुक्त सरल उपकरण की कमी रही है. एक बहु-लोकस चर संख्या अग्रानुक्रम-पुनरावृत्ति विश्लेषण (MLVA) परख इसलिए बरामद अलग के उच्च संकल्प जीनोटाइपिंग के लिए एक आसानी से सुलभ और स्पष्ट उपकरण के रूप में विकसित किया गया था. MLVA परख यहाँ प्रस्तुत के लिए, डीएनए पानी में जीवाणु कोशिकाओं को उबालने से सुसंस्कृत वाई ruckeri नमूने से निकाला जाता है, पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में supernatant के उपयोग के बाद. प्राइमर-नेल्स दस चर-संख्या अग्रानुक्रम-पुनरावृत्ति (VNTR) loci को लक्षित करते हैं, वाई ruckeri जीनोम भर interspersed, समान साइकिल की स्थिति के तहत चल रहे दो पांच-plex पीसीआर प्रतिक्रियाओं के बीच समान रूप से वितरित कर रहे हैं। फॉरवर्ड प्राइमर को तीन फ्लोरोसेंट रंगों में से किसी के साथ लेबल किया गया है। जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा amplicon पुष्टि के बाद, पीसीआर उत्पादों पतला कर रहे हैं और केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस के अधीन. परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोफेरोग्राम प्रोफाइल से, प्रत्येक VNTR loci का प्रतिनिधित्व चोटियों आकार कहा जाता है और silico में VNTR दोहराने मायने रखता है की गणना के लिए कार्यरत हैं. परिणामस्वरूप दस अंकों MLVA प्रोफाइल तो क्लस्टर विश्लेषण द्वारा epizootiological मूल्यांकन को सक्षम करने के न्यूनतम फैले पेड़ उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है. उच्च पोर्टेबल उत्पादन डेटा, संख्यात्मक MLVA प्रोफाइल के रूप में, तेजी से प्रयोगशालाओं भर में तुलना की जा सकती है और एक spatiotemporal संदर्भ में रखा. सुसंस्कृत कॉलोनी से epizootiological मूल्यांकन करने के लिए पूरी प्रक्रिया के लिए पूरा किया जा सकता है 48 Y. ruckeri एक ही काम के दिन के भीतर अलग.

यहाँ वर्णित के रूप में बहुसंकेतपीसीके बाद, एक ठेठ जीई छवि प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया से कई amplicons की उपस्थिति की पुष्टि चित्र 1में दिखाया गया है. डाउनस्ट्रीम CE टुकड़ा विश्लेषण सत्यापित PCR उत्पादों पर प्रदर्शन किया जाएगा, प्रत्येक वाई ruckeri अलग के लिए जांच की, दो इलेक्ट्रोफेरोग्राम फ़ाइलों में परिणाम संबंधित VNTR loci के आकार बुला के लिए इस्तेमाल किया (चित्र 2). 484 विविध वाई रूकरी आइसोलेट के विश्लेषण से, एक ही मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रिया (तालिका 1)14में एक ही डाई के साथ लेबल VNTR loci के बीच amplicon आकार रेंज में कोई ओवरलैप नहीं देखा गया था। विद्युत-उच्मुख चोटियों में से प्रत्येक, इसलिए, स्पष्ट रूप से रंग से पहचाना जा सकता है।
MLVA प्रोफाइल और पसंदीदा सॉफ्टवेयर में प्रासंगिक मेटाडाटा के आयात के बाद, एमएसटी आरेख सामग्री में ब्याज की किसी भी महामारी विज्ञान पैटर्न की जांच के लिए वर्णित के रूप में निर्माण किया जा सकता है. संबंधित सॉफ्टवेयर में उपलब्ध अतिरिक्त विकल्पों के लिए उपयुक्त मैनुअल से परामर्श करें. एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 3 Y. ruckeri अलग नॉर्वे में पांच अलग सामन खेतों के साथ जुड़े मछली से बरामद के लिए MLVA प्रोफाइल के MST द्वारा तुलना से पता चलता है.
दस VNTR loci के लगातार दोहराने आकार, साथ ही उनके इन विट्रो में और विवो स्थिरता में, पहले इस प्रोटोकॉल14पर आधारित मूल अध्ययन में सत्यापित किया गया है. संक्षेप में, यह Sanger अनुक्रमण (पुनरावृत्ति आकार) का उपयोग कर किया गया था, और कई अलग-अलग की MLVA टाइपिंग द्वारा सीरियल मार्ग के बाद (विट्रो में) और व्यक्तिगत रोग प्रकोप के भीतर से (विवो में). इसके अलावा, समय के साथ loci के पर्यावरण स्थिरता अटलांटिक सामन के लिए लगातार संक्रमित मीठे पानी के उत्पादन साइटों से कई वर्षों में बरामद कई 'घर तनाव' अलग टाइप करके जांच की गई थी.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig1.jpg"> चित्र 1 : कई पीसीआर उत्पादों की उपस्थिति की पुष्टि करने वाले जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस। छवि डीएनए सीढ़ी का प्रतिनिधित्व करने वाले डीएनए सीढ़ी का प्रतिनिधित्व करने वाली पहली लेन के साथ, नमूनों युक्त सभी 12 गलियों में कई पीसीआर amplicons की उपस्थिति की पुष्टि करता है। चयनित सीढ़ी टुकड़े के आकार संकेत दिया गया है, के रूप में पीसीआर परख और तनाव है (Gulla एट अल में तालिका S1 देखें 201814) प्रत्येक लेन की संबद्धता. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig2.jpg"> चित्र 2 : VNTR amplicons के लिए इसी चोटियों दिखा इलेक्ट्रोफेरोग्राम| विभिन्न VNTR loci के नाम, डाई लेबल के साथ संकेत दिए हैं (वीआईसी ] हरे; NED ] काला; 6FAM [ नीले) कोष्ठक में. दो इलेक्ट्रोफेरोग्राम (पीसीआर परख 1 शीर्ष; पीसीआर परख 2 नीचे) एक एकल वाई ruckeri अलग टाइप करने से उत्पन्न. ऑरेंज चोटियों (डीई लिज़) कार्यरत आकार मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig3.jpg"> चित्र 3 : उदाहरण न्यूनतम महामारी विज्ञान मूल्यांकन के लिए फैले पेड़. आरेख Y. ruckeri से MLVA प्रोफाइल पर आधारित है पांच अलग नार्वे खेतों में अटलांटिक सामन से बरामद (1-5; किंवदंती देखें) आवर्तक Yerisniosis प्रकोप का अनुभव. कृषि मूल से जुड़ी एक स्पष्ट गुच्छन प्रवृत्ति देखी जा सकती है। क्रॉसलिंक सभी संभव कनेक्शन दिखाते हैं, जिसमें $1/10 गैर-पहचानवाले VNTR loci (कथा देखें) शामिल हैं. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig4.jpg"> चित्र 4 : इलेक्ट्रोफेरोग्राम हकलाना और विभाजित चोटियों visualizing। इस मामले में, दोनों एक साथ होते हैं, जो हमेशा मामला नहीं होता है। अब और लम्बे शिखर, YR1070 VNTR टिड्डी का प्रतिनिधित्व, आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. प्रदर्शन बढ़ाया है और केवल नीले रंग चोटियों से पता चलता है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59455/59455table1.jpg"> तालिका 1: VNTR टिड्डी विशेषताओं. वर्तमान MLVA प्रोटोकॉल में लक्षित दस वाई ruckeri VNTR क्षेत्रों की प्रासंगिक विशेषताओं.

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Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

मल्टी-लोकस चर-संख्या अग्रानुक्रम-पुनरावृत्ति विश्लेषण (एमएलवीए) परख यहाँ प्रस्तुत मछली-रोगजनक जीवाणु Yersinia ruckeriकी सस्ती, मजबूत और पोर्टेबल उच्च संकल्प जीनोटाइपिंग सक्षम बनाता है। शुद्ध संस्कृतियों से शुरू, परख डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए दस-लोकी MLVA प्रोफाइल का उत्पादन करने के लिए मल्टीप्लेक्स पीसीआर और केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस कार्यरत हैं।

मल्टीप्लेक्स पीसीआर और कैपिलरी इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा मछली-रोगजनक जीवाणु येर्सिनिया रूकी के मल्टी-लोक्स चर-संख्या टैंडम-रिपीट विश्लेषण

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Research

JoVE Journal

Genetics

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