Name: multi-locus variable-number tandem-repeat analysis of the fish-pathogenic bacterium yersinia ruckeri by multiplex pcr and capillary electrophoresis
Uploaded: 2019-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis at JoVE.co

O presente estudo foi financiado pelo fundo norueguês de pesquisa de frutos do mar, FHF (projeto n º 901119 e 901505). Agradecemos a todos os contribuintes de isolados bacterianos e amostras utilizadas durante o desenvolvimento do método.

Cuidado: para a totalidade do protocolo, é aconselhável realizar todos os procedimentos de laboratório molhado de forma estéril pelo uso de casacos de laboratório, luvas descartáveis e reagentes estéreis e equipamentos. É igualmente aconselhável preparar reações do PCR em uma sala separada (pre-PCR) não usada para a amplificação do PCR e/ou o tratamento de produtos do PCR (borne-PCR). Guarde todos os reagentes recomendados pelo fabricante. Consulte a tabela de materiais para obter mais detalhes sobre reagentes, equipamentos e softwares usados.
1. cultivo bacteriano e extração de DNA genómico
<ol><li>Semeie as culturas puras de Y. ruckeri em todo o tipo apropriado do agar (os autores usaram o agar de sangue bovino de 5%) e incubar em 22 ° c por 1-2 dias, ou 15 ° c por 3-4 dias.</li>
	<li>De cada placa de agar, escolha uma colônia representativa única com um laço de inoculação e transfira para 1,5 mL tubos de centrifugação contendo 50 μL de água ultrapurificada. Suspender, vórtice brevemente, e incubar por 7 min em um bloco de aquecimento a 100 ° c.</li>
	<li>Centrifugue a 16 000 x g durante 3 min e utilize uma pipeta para transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de centrifugação vazio de 1,5 ml. Prossiga para o próximo passo usando o sobrenadante como DNA do modelo ou armazene a-20 ° c até o momento.</li>
</ol>2. configuração de PCR multiplex e condições de ciclismo
Nota: Cada reacção de PCR multiplex (dois por Y. ruckeri isolate) deve conter 12,5 μL de 2x multiplex PCR Plus Master mix, 0,1 a 0,2 μm de cada par primário apropriado (tabela 1) e 3 μL de ADN do modelo, ajustados a um volume de reacção final de 25 μL por adição de água RNase-livre. Visam manter a exposição à luz das primeiras iniciadores com rótulo fluorescentamente rotulados no mínimo (por exemplo, envolvendo os tubos de armazenamento em folha de alumínio).
<ol><li>Para cada um dos dois ensaios multiplex do PCR (tabela 1), prepare misturas mestras como descrito acima (sem ADN do molde) de acordo com o número de amostras mais um positivo e um controle negativo. Além disso, permitir 10% de volume excedente. Vortex o mestre preparado mistura suavemente em baixa velocidade.</li>
	<li>Distribuir 22 μL de cada mistura mestra separadamente em poços individuais em tiras ou placas de PCR, conforme apropriado para o número de amostras, e adicionar 3 μL de modelo a cada poço (para controles positivos e negativos, respectivamente, use DNA de um Y. ruckeri verificado estirpe e água ultrapurificada). Selar e centrifugar brevemente.</li>
	<li>Execute todas as amostras num termociclador de PCR com o seguinte programa: (i) 5 min a 95 ° c (II) 30 ciclos de 0,5 min a 95 ° c, 1,5 min a 60 ° c e 1 min a 72 ° c e (III) 60 min a 68 ° c, seguidos de arrefecimento a 4 ° c indefinidamente. O programa será concluído em menos de 3 h.</li>
</ol>3. confirmação do amplicon do PCR pela electroforese do gel
<ol><li>De acordo com as recomendações do fabricante, prepare um volume de 1,5% (w/v) gel de agarose em 1x Tris-borato-EDTA (TBE) tampão apropriado para o número de reações de PCR a ser testado. Antes da fundição, adicione 5 μL de corante ácido nucleico fluorescente por 50 μL de solução de gel e misture. Use bandejas e pentes como apropriado para a carcaça, deixando um número apropriado de poços livres para escadas da referência do ADN.</li>
	<li>Depois de definir, mergulhe o gel em 1x TBE-buffer em um sistema GE. Misture 5 μL de produto de PCR juntamente com 2 μL de corante de carga e transfira para poços de gel. Adicionar 5 μL de escada de DNA em poços vazios para referência.</li>
	<li>Execute o gel a 110 V por 15 cm por aproximadamente 1 h e use um sistema de imagem/visualização de gel com base em UV para verificar a presença de várias bandas (até cinco) representando amplicões de PCR (ver exemplo na Figura 1). Descarte o gel. Prossiga para a próxima etapa ou armazene os produtos restantes do PCR em 4 ° c até o processamento mais adicional.</li>
</ol>4. instalação de electroforese capilar e condições de funcionamento
<ol><li>Depois da confirmação de amplicons do PCR, diluir produtos do PCR 1:10 (v/v) na água purified. Selar, misturar e centrifugar brevemente.</li>
	<li>Trabalhando em um armário das emanações, prepare um volume da mistura mestra que consiste em 9 μL de formamida e de 0,5 μl do padrão do tamanho por o produto do PCR (permita o volume excedente de 10%). Vórtice brevemente e distribuir 9,5 μL em poços em uma placa apropriada para o sistema disponível do CE, antes de adicionar 0,5 μL do produto diluído do PCR. Selar, misturar e centrifugar brevemente. Atenção: Manuseie com cuidado. A mistura de formamida com água gera ácido fórmico, que é tóxico.</li>
	<li>Usando um termociclador de PCR, desnaturar as amostras a 95 ° c por 3 min antes de refrigerar a 4 ° c indefinidamente. Centrifugue brevemente e carregue a placa sobre um sistema calibrado CE de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Executar análise de fragmento CE usando reagentes conforme apropriado para o aparelho de escolha e as seguintes configurações: 60 ° c; injeções de 5 s a 1,6 kV (32 V por cm); 32 min tempo de execução em 15 kV (300 V por cm). A análise do fragmento do CE de 24 poços em um 24-capilar (50 cm) tomará tipicamente aproximadamente 50 minutos.</li>
</ol>5. VNTR tamanho chamando, repita contagem cálculo e MLVA perfilação
Nota: Etapa 5,1 descreve Y. ruckeri VNTR CE tamanho chamando de arquivos de electroferograma, usando o software específico listado na tabela de materiais. Consulte o manual do software para obter mais detalhes e resolução de problemas. Para o uso de outro software, consulte os manuais apropriados.
<ol><li>
Importe arquivos de resultado CE (dois por Y. ruckeri isolate). Defina o método de análise para o padrão de microssatélites e selecione a opção de produto apropriada em tamanho padrão, antes de pressionar o botão analisar. Verifique a identificação correta dos fragmentos padrão de tamanho por meio do editor de correspondência de tamanho e corrija quaisquer alocações visivelmente erradas.
	<ol>
<li>Tendo selecionado o exemplo (s) a ser lido, aperte o botão Exibir plotagens e pressione Ctrl + a para habilitar a exibição da tabela de dimensionamento. Enquanto estiver no painel superior, mantenha pressionada a tecla CTRL enquanto clica nos cinco picos que representam os amplicões do VNTR (use a ferramenta de zoom conforme necessário). Nota: Para cada um dos produtos de PCR multiplex, o electroferograma mostrará cinco picos distribuídos entre os três corantes empregados (ver 5 ' rotulagem corante de primers para frente na tabela 1 e os dois exemplos na Figura 2).</li>
		<li>Pressione Ctrl + G para filtrar a tabela de dimensionamento, mostrando apenas as características dos cinco picos destacados e registre as chamadas de tamanho CE para cada Locus VNTR (com referência à tabela 1) para o aplicativo downstream.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A fim de contabiliza os padrões de mobilidade tendenciosos do amplicon durante o CE, calcule contagens precisas de repetição de VNTR de acordo com a fórmula fornecida abaixo, empregando chamadas de tamanho de VNTR CE em conjunto com variáveis Locus-específicas (ver tabela 1). Para eficiência, é aconselhável automatizar esse processo (por exemplo, usando um modelo de planilha). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59455/59455eq1.jpg">
</li>
	<li>Round calculado VNTR repetição contagens fora para o inteiro mais próximo e concatenar em seqüências de dez dígitos, cada representando o perfil MLVA de um único Y. ruckeri isolar.</li>
</ol>6. análise de cluster de Spanning Tree mínima de dados MLVA
Nota: A etapa 6 descreve a criação de diagramas MST a partir de dados MLVA Y. ruckeri , usando o software específico listado na tabela de materiais. Consulte o manual do software para obter mais detalhes e resolução de problemas. Para o uso de outro software, consulte os manuais apropriados.
<ol><li>Crie um novo banco de dados e opte por ativar o plugin MLVA.</li>
	<li>Importe perfis e metadados de Y. ruckeri MLVA selecionando dados de tipo de caractere seguidos por campos de importação e caracteres (Subseleção adicional dependendo do formato de armazenamento). Quando solicitado, especifique as regras de importação de acordo com o conteúdo do arquivo de importação: na coluna tipo de destino , classifique as contagens de repetição de VNTR como valor de caractere: VNTRe os metadados diversos como informações de entrada: campo informações de entrada . Nota: Para comparação e contexto, também é possível importar todo o conjunto de dados publicado (acesso aberto) juntamente com o documento original empregando o presente protocolo MLVA14. Os perfis e metadados de MLVA na coleção diversa de isolados de Y. ruckeri (n = 484) examinados nesse estudo estão disponíveis a partir de seu material suplementar (tabelas S1 e S2) através do seguinte link: https://AEM.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files</li>
	<li>No painel tipo de experimento , abra a entrada VNTR e defina valores mínimos e máximos para cada Locus VNTR como 0 e 100, respectivamente. Em configurações gerais, defina o número de dígitos decimais como 0 e selecione números em tipo de dados. Verifique para considerar valores ausentes como zero.</li>
	<li>
Selecione amostras importadas destinadas à análise de cluster MST e clique no botão Criar nova comparação (no painel comparação).
	<ol>
<li>Se desejar para a apresentação visual do MST, alocar as amostras para grupos coloridos (por exemplo, de acordo com uma característica específica de metadados) empregando as várias opções disponíveis no painel grupos . Nota: Os grupos também podem ser criados/alterados retrospectivamente, após as etapas a seguir.</li>
		<li>Selecione análise de cluster avançada... e MST para dados categóricos para gerar um diagrama MST com base nas amostras escolhidas.</li>
		<li>Modifique ainda mais a apresentação visual do MST como preferencial (por exemplo, adicionando parâmetros de particionamento, rotulagem de nó/ramificação, crosslinks, legendas, etc.). Veja o exemplo na Figura 3. Nota: Um limite de particionamento de cluster (complexo clonal) de ≤ 4/10 loci de VNTR não idênticos, além de ocultar conexões de filial representando > 5/10 loci VNTR não idênticos, tem sido empregado anteriormente para análise de cluster MST com base em dados MLVA gerados usando este protocolo14. Desde que o conjunto de dados acima mencionado de 484 Y. ruckeri MLVA perfis foi importado, essas amostras também podem ser incluídas para análise de cluster MST (como descrito acima) para fornecer um contexto global e histórico. Isto facilitará por exemplo a identificação de todas as amostras afiliadas com os complexos clonal previamente descritos, assim como aqueles que representam ainda linhagens não descritas. Dependendo dos metadados disponíveis, o diagrama MST resultante pode ser examinado de maneiras diferentes, por exemplo, para descobrir eventuais padrões de agrupamento vinculados a traços específicos (Geografia, host, tempo, etc.).</li>
		<li>Se necessário, exporte o MST finalizado em um formato desejado usando a seleção de imagem de exportação .</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+redmouth+disease+(ERM)+(Yersinia+ruckeri).">Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri).</a> Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).</li><li>Barnes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+analysis+of+Yersinia+ruckeri+isolated+over+27+years+in+Australia+and+New+Zealand+reveals+geographical+endemism+over+multiple+lineages+and+recent+evolution+under+host+selection.">Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection.</a> Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).</li><li>Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis+and+multi+locus+sequence+typing+for+characterizing+genotype+variability+of+Yersinia+ruckeri+isolated+from+farmed+fish+in+France.">Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France.</a> Veterinary Research. 46, 73 (2015).</li><li>Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+reveals+high+genetic+diversity+and+epidemic+population+structure+for+the+fish+pathogen+Yersinia+ruckeri.">Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri.</a> Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).</li><li>Wheeler, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+ruckeri+biotype+2+isolates+from+mainland+Europe+and+the+UK+likely+represent+different+clonal+groups.">Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).</li><li>Eyre, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multilocus+variable-number+tandem-repeat+analysis+and+whole-genome+sequencing+for+investigation+of+Clostridium+difficile+transmission.">Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Locus+Variable-Number+Tandem-Repeat+and+Single-Nucleotide+Polymorphism-Based+Brucella+Typing+Reveals+Multiple+Lineages+in+Brucella+melitensis+Currently+Endemic+in+China.">Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China.</a> Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).</li><li>Bouchouicha, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+performances+of+MLVA+vs.+the+main+other+typing+techniques+for+Bartonella+henselae.">Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae.</a> Clinical Microbiology and Infection. 15, 104-105 (2009).</li><li>Dahyot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-Locus+Variable+Number+Tandem+Repeat+Analysis+(MLVA)+and+Tandem+Repeat+Sequence+Typing+(TRST),+helpful+tools+for+subtyping+Staphylococcus+lugdunensis.">Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis.</a> Scientific Reports. 8 (1), (2018).</li><li>Elberse, K. E. M., Nunes, S., S&#225;-Le&#227;o, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-locus+variable+number+tandem+repeat+analysis+for+Streptococcus+pneumoniae:+Comparison+with+PFGE+and+MLST.">Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST.</a> PLoS ONE. 6 (5), (2011).</li><li>Matejusova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable-number+tandem-repeat+genotyping+of+Renibacterium+salmoninarum,+a+bacterium+causing+bacterial+kidney+disease+in+salmonid+fish.">Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish.</a> BMC microbiology. 13, 285 (2013).</li><li>Duodu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+multiple-locus+variable-number+of+tandem+repeat+analysis+(MLVA)+for+the+fish+pathogen+Francisella+noatunensis+using+capillary+electrophoresis.">An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis.</a> BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).</li><li>Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., S&#248;rum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable+number+tandem+repeat+analysis+of+Edwardsiella+piscicida+isolates+pathogenic+to+fish.">Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish.</a> Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).</li><li>Gulla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable-number+tandem-repeat+analysis+of+Yersinia+ruckeri+confirms+the+existence+of+host+specificity,+geographic+endemism,+and+anthropogenic+dissemination+of+virulent+clones.">Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).</li><li>Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cautionary+tale:+Lack+of+consistency+in+allele+sizes+between+two+laboratories+for+a+published+multilocus+microsatellite+typing+system.">A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).</li><li>Lista, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+Bacillus+anthracis+strains+based+on+automated+capillary+25-loci+multiple+locus+variable-number+tandem+repeats+analysis.">Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis.</a> BMC Microbiology. 6, 33 (2006).</li><li>. Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf</a> (2014)</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Ambos os PCRs multiplex apresentados aqui apareceram relativamente robustos na cara da qualidade pobre do ADN do molde, mas a falta da amplificação do PCR foi observada não obstante ocasionalmente ao usar moldes com concentrações extremamente elevadas do ADN. Estes problemas foram resolvidos prontamente diluindo os moldes antes do PCR. Outros métodos para a extração do ADN do que esse empregado aqui podem igualmente ser usados (por exemplo, jogos comerciais).
Embora cinco amplicões sejam esperados de cada reação multiplex do PCR, cinco bandas visualmente distinguíveis não devem sempre ser esperadas de GE, porque algum (etiquetado diferentemente) loci de VNTR dentro da mesma reação tem escalas de tamanho de sobreposição. O tempo final da extensão do PCR de 60 de minuto pode ser encurtado se requerido, mas conduzirá provavelmente à ocorrência aumentada de picos rachados em eletroferogramas subseqüentes do CE (veja abaixo). Notavelmente, como a finalidade da etapa do GE é puramente para a verificação qualitativa de amplicons do PCR, o tempo de execução, a tensão e/ou a receita do gel podem ser ajustados como preferiu. Se as bandas particularmente fracas forem observadas pela GE, pode ser aconselhável reduzir o fator de diluição dessas amostras antes da CE.
Quando o protocolo do CE descrito aqui foi funcionado em um instrumento capilar comercial específico da electroforese (veja a tabela dos materiais), os sistemas diferentes do CE podem ter exigências diferentes da amostra, que podem por sua vez alertar algumas modificações ao protocolo . Consulte o manual do respectivo fabricante do sistema CE para obter instruções sobre os reagentes/equipamentos apropriados, calibração etc. para análise de fragmentos. Há também a possibilidade de que os padrões de mobilidade tendenciosos amplicon observados durante a CE podem diferir, relativamente, através de sistemas CE e/ou máquinas, como tem sido previamente documentado para outros protocolos MLVA15,16. Se ocorrer em uma medida em que as contagens de repetição VNTR finais (arredondadas) sejam afetadas, isso significa que as variáveis Locus-específicas s e i (tabela 1), usadas para determinar contagens de repetição de VNTR, devem ser recalibradas. Isso envolve a regressão linear em parcelas comparando tamanhos de sequência precisos versus chamadas de tamanho CE, conforme descrito por Gulla et al. 201814.
Picos divididos e picos de gaguejar, ambos os artefatos bem conhecidos na MLVA baseada em CE digitando17, podem ser observados em eletroferogramas durante a chamada de tamanho (Figura 4). Embora os picos de gaguejar devam ser desconsiderados, o pico mais longo deve ser consistentemente selecionado para aplicações downstream no caso de picos divididos separados por um único par base. Além disso, os picos ausentes que indicam a falta de Locus específicos de VNTR são raros, mas podem ocorrer, caso em que uma contagem da repetição de ' 0 ' deve ser atribuída. Se a cultura inicial a partir da qual o DNA é extraído não é pura (ou seja, contém mais de um subtipo Y. ruckeri ), vários picos altos correspondentes a diferentes alelos do mesmo locus/loci podem ser observados após a CE. Os cultivos secundários devem então ser executados das únicas colônias antes da extração nova do ADN para re-typing.
Como indicado no protocolo, o ADN do molde para o PCR deve por padrão ser extraído das culturas puras de Y. ruckeri. Em alguns casos, entretanto, as amostras do ovo-líquido que testam o positivo para Y. ruckeri por qPCR (CT-valores < 27) eram com sucesso MLVA datilografado diretamente, sem cultivo prévio, usando uma quantidade aumentada de ADN genomic (extraído com o jogo comercial) como o molde. Embora esta aproximação não seja testada extensivamente nem verificada, indica o potencial deste ensaio de MLVA para a examinação de matrizes biológicas complexas que contêm o ADN de uma escala de organismos diferentes além do que Y. ruckeri.
Todo o procedimento de digitação do MLVA aqui apresentado, desde a extração do DNA até a avaliação epizootiológica, pode ser completado em um único dia de trabalho. Entretanto, o número de amostras examinadas está em uma relação sublinear com o tempo exigido para a extração do ADN, o PCR e o CE, e o método é conseqüentemente muito mais tempo eficiente ao executar amostras múltiplas simultaneamente. Este é, no entanto, o caso para a maioria dos métodos baseados em laboratório, e como uma ferramenta para a subdigitação epidemiológica de Y. ruckeri, a combinação de alta resolução, simplicidade e portabilidade torna este ensaio MLVA superior aos protocolos publicados anteriormente4 ,5. Também tem sido utilizada para verificar a relevância epidemiológica limitada de Y. ruckeri sorotipagem14.
Através de um abrangente estudo populacional baseado em MLVA envolvendo 484 Y. ruckeri isolados recuperados de uma variedade de origens e habitats espaciotemporais (peixes hospedeiros, meio ambiente, etc.), nosso entendimento sobre a epizootiologia e população a estrutura deste patógeno importante dos peixes foi aumentada substancialmente14. A digitação de MLVA permitiu o rastreamento de clones disseminados antropogenicamente ao longo de décadas, presumivelmente através do transporte de peixes, bem como identificação de cepas confinadas localmente. Além disso, enquanto alguns complexos clonais da bactéria poderiam ser claramente associados com a doença em particular hospedeiros de peixes (truta arco-íris e salmão do Atlântico, respectivamente), outros foram recuperados apenas de fontes ambientais e/ou peixes clinicamente não afetados Espécimes. A aplicabilidade do método é, portanto, não apenas limitada ao rastreamento de infecção, pois também pode fornecer informações de relevância potencial, por exemplo, para o desenvolvimento de vacinas, avaliação de riscos e manutenção da Biossegurança nacional. Atualmente, está em uso ativo no Instituto veterinário norueguês como uma ferramenta para investigar os diagnósticos de Y. ruckeri na aquicultura norueguesa.

Yersinia ruckeri, uma bactéria Gram-negativa e membro da família yersiniaceae, causa Yersiniose em peixes de salmonídeo cultivados no mundo inteiro1. É prontamente diagnosticada a partir de peixes infectados por cultivo em muitos tipos de meios de agar, mas até recentemente, pouco se sabe sobre a estrutura populacional e epizootiologia de Y. ruckeri em todo o mundo e em diferentes habitats (espécies hospedeiras, etc.). Os sistemas de sorodigitação existentes para Y. ruckeri são inconsistentes, não têm compatibilidade mútua e oferecem baixa resolução epidemiológica. Alguns estudos moleculares sobre a bactéria têm sido conduzidos, empregando técnicas como a tipagem de sequências multilocus (MLST), a eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) ou a análise da sequência do genoma inteiro (WGS)2,3,4 ,5. No entanto, MLST não fornece uma resolução suficientemente alta para rastreamento de infecção de rotina, enquanto PFGE é exigente trabalho e produz resultados que não são prontamente portáteis através de laboratórios. Embora a análise da WGS forneça uma resolução definitiva, o estabelecimento e a implementação de tais análises seriam pré-requisitos de recursos técnicos e de Bioinformática que ainda permanecem restritos a um número relativamente pequeno de laboratórios.
A análise do tandem-repeat do número variável do multi-Locus (MLVA) representa uma ferramenta de digitação molecular simples e fàcilmente acessível, que ofereça uma definição genética em alguns casos que combinam quase aquela da análise de WGS6,7. A técnica é baseada na variação numérica repetida em loci de repetição em tandem (VNTR) de número variável selecionado, resultando em dados de saída que são altamente transportáveis, fazendo a comparação de isolados perfilados em bancos de dados on-line e em laboratórios diretos. Embora o MLST permaneça como padrão-ouro para a digitação epidemiológica de muitos patógenos bacterianos, um número crescente de estudos identifica um poder discriminatório significativamente maior de MLVA8,9,10. Vários protocolos também foram publicados visando bactérias patogênicas de peixes, como Francisella noatunensis, Edwardsiella Piscicida e Renibacterium salmoninarum11,12, trezeanos.
O protocolo MLVA de dez Locos apresentado aqui, que recentemente formou a base para um extenso estudo populacional de Y. ruckeri 14, envolve a extração de DNA de colônias cultivadas em ágar, PCR multiplex e eletroforese capilar (CE), seguido de jusante em aplicações de silico. Para cada isolado examinado, dois PCRs multiplex, ambos contendo cinco pares de primers fluorescentamente rotulados (6FAM, NED ou VIC), cada um visando regiões individuais de VNTR, são executados em paralelo em condições idênticas. Depois da verificação de amplicões do PCR pela electroforese do gel (GE), os produtos do PCR são diluídos antes da análise do CE, e os picos que representam os Locus respectivos de VNTR são tamanho-chamados dos arquivos resultantes do electroferograma. Junto com as fórmulas Locus-specific que esclarecendo discrepâncias menores, específicas da seqüência em testes padrões migratórios do CE, as chamadas do tamanho do CE de VNTR são empregadas então calculando contagens da repetição de VNTR que são concatenadas em perfis do MLVA do dez-dígito. Estes são usados como a entrada para avaliações epizootiológica (por exemplo, pela análise do conjunto em diagramas de Spanning Tree mínimo (MST)).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >22&#176;C/15&#176;C incubator</td>
			<td >As preferred.</td>
			<td >NA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5&#39; Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>450007</td>
			<td>Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agarose, universal, peqGOLD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789P/732-2788</td>
			<td>Used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avant 3500xL Genetic Analyzer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30469</td>
			<td>Used for capillary electrophoresis fragment analysis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BioNumerics7 modules</td>
			<td>Applied Maths</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge(s)</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15612</td>
			<td>Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Loading dye used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Centrifuge tubes used during DNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freezer</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fume cupboard</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel electrophoresis system</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneMapper Software 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4475073</td>
			<td>Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0373</td>
			<td>DNA ladder used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4408399</td>
			<td>Size standard used during capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311320/4440753</td>
			<td>Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Milli-Q water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multiplex PCR&#160;Plus&#160;Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>206151/206152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR thermal cycler</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26077/4393713/4393709</td>
			<td>Separation matrix used during capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pure culture Yersinia ruckeri</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>E.g. cryopreserved or fresh.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>NA</td>
			<td>In: Multiplex PCR&#160;Plus&#160;Kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-borate-EDTA (TBE)&#160; buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsine soy agar/bovine blood agar</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-based gel imaging/visualisation system</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortexer</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-locus variable-number tandem-repeat analysis of the fish-pathogenic bacterium yersinia ruckeri by multiplex pcr and capillary electrophoresis

Yersinia ruckeri é um importante patógeno de salmonídeos cultivados em todo o mundo, mas ferramentas simples adequadas para investigações epizootiológicas (rastreamento de infecção, etc.) desta bactéria têm sido falta. Um ensaio de análise de repetição em tandem de número variável (MLVA) de múltiplos lócus foi, portanto, desenvolvido como uma ferramenta de fácil acesso e inequívoca para genotipagem de alta resolução de isolados recuperados. Para o ensaio MLVA aqui apresentado, o DNA é extraído de amostras cultivadas de Y. ruckeri por células bacterianas fervente em água, seguida pelo uso de sobrenadante como modelo para PCR. Os pares da primeira demão que alvejam dez loci do tandem-repeat do número variável (VNTR), intercalados durante todo o genoma de Y. ruckeri , são distribuídos ingualmente entre as reações do PCR do 2 5-Plex que funcionam circunstâncias de ciclagem idênticas. Os primers para frente são rotulados com qualquer uma das três corantes fluorescentes. Após a confirmação do amplicon pela electroforese do gel, os produtos do PCR são diluídos e sujeitados à electroforese capilar. Dos perfis resultantes do electroferograma, os picos que representam cada um dos locus de VNTR são tamanho-chamados e empregado para calcular contagens da repetição de VNTR no silico. Os perfis de MLVA de dez dígitos resultantes são usados para gerar árvores de abrangência mínima permitindo avaliação epizootiológica por análise de cluster. Os dados de saída altamente portáteis, na forma de perfis numéricos de MLVA, podem ser comparados rapidamente entre laboratórios e colocados em um contexto espaciotemporal. O procedimento inteiro da colônia cultivada à avaliação epizootiológica pode ser terminado para até 48 Y. os isolados de ruckeri dentro de um único dia de trabalho.

Após a PCR multiplex descrita aqui, uma imagem típica da GE verificando a presença de múltiplos amplicões de cada reação de PCR é mostrada na Figura 1. A análise de fragmento de CE a jusante realizada em produtos de PCR verificados, para cada isolado Y. ruckeri examinado, resulta em dois arquivos de eletroferograma usados para a chamada de tamanho dos respectivos Locos VNTR (Figura 2). A partir da análise de 484 diversos isolados de Y. ruckeri , não se observou Sobreposição na faixa de tamanho do amplicon entre os Locos VNTR rotulados com o mesmo corante na mesma reação Multiplex (tabela 1)14. Cada um dos picos electrophoretic pode, conseqüentemente, ser identificado inequivocamente pela cor.
Após a importação de perfis MLVA e metadados relevantes para o software preferencial, diagramas MST podem ser construídos como descrito para análise de quaisquer padrões epidemiológicos de interesse no material. Consulte os manuais adequados para opções adicionais disponíveis no respectivo software. Como exemplo, a Figura 3 mostra a comparação por MST de perfis MLVA para isolados de Y. ruckeri recuperados de peixes associados a cinco diferentes fazendas de salmão na Noruega.
Os tamanhos consistentes da repetição dos dez locus de VNTR, assim como sua estabilidade in vitro e in vivo, foram verificados previamente no estudo original baseado neste protocolo14. Momentaneamente, isto foi feito usando o sequenciamento de Sanger (tamanho da repetição), e por datilografar MLVA de isolados múltiplos que seguem passagens de série (in vitro) e dentro dos surtos individuais da doença (in vivo). Além disso, a estabilidade ambiental do loci ao longo do tempo foi examinada digitando vários isolados de "Strain House" recuperados ao longo de vários anos de locais de produção de água doce persistentemente infectados para o salmão do Atlântico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig1.jpg"> Figura 1 : Electroforese do gel que verifica a presença de produtos múltiplos do PCR. A imagem confirma a presença de múltiplos amplicões do PCR em todas as 12 pistas que contêm amostras, com a primeira pista que representa a escada do ADN usada. Os tamanhos dos fragmentos selecionados da escada foram indicados, como têm o ensaio e a tensão do PCR (veja tabela S1 em Gulla et al. 201814) afiliação de cada pista. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig2.jpg"> Figura 2 : Electropherograms que mostra os picos que correspondem aos amplicões de VNTR. Os nomes dos diferentes Locos VNTR são indicados, com rótulos de corante (VIC = verde; NED = preto; 6FAM = azul) entre parênteses. Os dois eletroferogramas (teste 1 superior do PCR; A parte inferior do ensaio 2 do PCR) origina da digitação de um único isolado de Y. ruckeri . Os picos alaranjados (tintura LIZ) representam o padrão do tamanho empregado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig3.jpg"> Figura 3 : Exemplo de árvore de abrangência mínima para avaliação epidemiológica. O diagrama é baseado em perfis MLVA de isolados de Y. ruckeri recuperados do salmão do Atlântico em cinco diferentes fazendas norueguesas (1-5; Ver legenda) experimentando surtos recorrentes de yerisniose. Pode ser observada uma tendência clara de agrupamento associada à origem da exploração. As ligações cruzadas mostram todas as conexões possíveis que envolvem ≤ 1/10 loci não-idênticos de VNTR (veja a legenda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig4.jpg"> Figura 4 : Electropherogram que visualiza gaguejar e rachar picos. Neste caso, ambos ocorrem simultaneamente, o que nem sempre é o caso. O pico mais longo e mais alto, representando o locus YR1070 VNTR, pode ser facilmente distinguido. A tela é ampliada e mostra apenas picos de corante azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59455/59455table1.jpg"> Tabela 1: características do locus VNTR. Características relevantes das dez regiões de Y. ruckeri VNTR visadas no presente protocolo MLVA.

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Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

O ensaio de análise em tandem-repetição de número variável multi-Locus (MLVA) apresentado aqui permite a genotipagem de alta resolução barata, robusta e portátil da bactéria patogênica Yersinia ruckeri. Partindo das culturas puras, o ensaio emprega o PCR multiplex e a electroforese capilar para produzir os perfis do MLVA do dez-loci para aplicações a jusante.

Multi-Locus variável-número tandem-repita a análise do peixe-patogénico bactéria Yersinia ruckeri pela PCR multiplex e pela electroforese capilar

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Este protocolo de genotipagem da MLB aumentou muito nossa compreensão da epidemiologia e da estrutura populacional global de Yersinia ruckeri, uma bactéria patogênica de peixes de importância internacional. Comparado com esquemas de digitação yersinia ruckeri previamente estabelecidos, ele oferece uma resolução de tensão muito alta. O procedimento é simples, barato e concede resultados portáteis que podem ser facilmente comparados entre laboratórios.A técnica melhora muito a especificidade do diagnóstico e permite o rastreamento de infecções. Por exemplo, agora podemos muitas vezes distinguir clones virulentos yersinia ruckeri existentes no pano de fundo de cepas ambientais não virulentas. Demonstrando o procedimento estará Saima Nasrin Mohammad, técnica do nosso laboratório.Para começar, use laços de inoculação estéreis para semear culturas puras de Yersinia ruckeri em qualquer tipo de ágar adequado em placas de Petri. Incubar a 22 graus Celsius por um a dois dias ou 15 graus Celsius por três a quatro dias. Depois disso, usando laços de inoculação, escolha uma única colônia representativa de cada placa de Petri e transfira para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro, contendo 50 microliters de água ultra purificada para resuspend.Vórtice brevemente e incubar por sete minutos em um bloco de aquecimento a 100 graus Celsius. Em seguida, centrífuga a 16.000 g por três minutos e use uma pipeta para transferir cuidadosamente o DNA do modelo supernante em tubos vazios de centrífuga de 1,5 mililitro. Vá para o próximo passo ou armazene o DNA a 20 graus Celsius.Para preparar misturas mestras, primeiro calcule os volumes de reagentes de acordo com o número de amostras bacterianas a serem analisadas, também contabilizando um controle negativo e um positivo, e um volume final de 10% excedente, conforme detalhado no manuscrito. Observe que diferentes concentrações de primer são usadas. Em dois tubos de centrífugas separados, um por ensaio PCR, adicione multiplex PCR mais mix mestre, primers e água sem RNase.Vortex o mestre preparado se mistura suavemente em baixa velocidade e, em seguida, distribua 22 microliters de cada mistura mestre separadamente em poços individuais em tiras pcr ou placas. Em seguida, adicione três microliters do modelo de DNA preparado a cada poço contendo mistura mestre;dois poços por amostra de bactérias, um para cada ensaio. Use DNA de uma cepa yersinia ruckeri verificada para um controle positivo, e água ultra purificada para um controle negativo.Selar e centrífugas brevemente. Carregue as reações preparadas em um ciclo termo de PCR e configure o programa de acordo com o manuscrito. O programa será concluído em menos de três horas.De acordo com as recomendações do fabricante, adicione pó de gel de agarose em uma vez tampão TBE para atingir 1,5% de peso/volume e calor para dissolver. Antes da fundição, esfrie brevemente a solução de gel dissolvido sob água corrente, adicione 5 microliters de corante de ácido nucleico fluorescente por 50 microliters de solução de gel e misture. Monte e nivele a bandeja de fundição.Adicione cones conforme apropriado para o número de amostras. Despeje a solução de gel no gesso e espere que ela se solidifique. Depois disso, submergir o molde contendo o gel em uma vez tampão TBE em um sistema de eletroforese gel.Misture cinco microliters dos produtos PCR junto com dois microliters de corante de carregamento em novas tiras PCR. Transfira cinco microliters das misturas para os poços do gel. Guarde pelo menos um bem vazio.Adicione cinco microliters de escada de DNA no poço vazio para referência. Ligue os eletrodos e execute o gel a 110 volts por 15 centímetros por aproximadamente uma hora. Use um sistema de imagem em gel baseado em UV para verificar a presença de várias bandas representando amplicons da RPC.Após a confirmação dos amplicons PCR, use novas tiras ou placas PCR para diluir produtos PCR de um a 10 em água purificada. Vórtice e centrífuga brevemente. Enquanto trabalha em um armário de fumaça, prepare uma mistura mestra em um tubo de centrífuga que consiste em formamida e solução padrão de tamanho de referência.De acordo com o número de produtos pcr a serem analisados, utilize volumes de reagentes conforme detalhado no manuscrito. Permitir um volume de 10% excedente. Vórtice brevemente e distribua 9,5 microliters em poços individuais em uma placa PCR apropriada para o sistema de eletroforese capilar disponível.Em seguida, adicione 0,5 microliters de produto PCR diluído. Selar e centrífugas brevemente. Em seguida, carregue a placa contendo as amostras em um ciclo termo de PCR e desnatura as amostras a 95 graus Celsius por três minutos antes de esfriar a quatro graus Celsius indefinidamente.Centrifugar a 1000 g por um minuto, retire cuidadosamente o selo e carregue a placa em um sistema de eletroforese capilar calibrada de acordo com as instruções do fabricante. Execute a eletroforese capilar de análise de fragmentos, utilizando reagentes conforme apropriado para o aparelho de escolha, e ajuste as condições de execução de acordo com a descrição do manuscrito. Para a chamada de tamanho de eletroforese capilar yersinia ruckeri VNTR, primeiro importar arquivos de resultado de eletroforese capilar no software Gene Mapper 5.Defina o método de análise para, Microsatélite Padrão, selecione a escolha apropriada do produto sob o padrão de tamanho e pressione o botão Analisar. Através do editor de correspondência de tamanho, verifique a identificação correta dos fragmentos padrão de tamanho e retifice quaisquer alocações visivelmente errôneas. Em seguida, selecione a amostra a ser lida, aperte o botão Exibir plot e pressione o Controle A para ativar a visualização da tabela de dimensionamento.Enquanto estiver no painel superior, segure o Controle, enquanto clica nos cinco picos que representam os amplicons VNTR. Pressione o Controle G para filtrar a tabela de dimensionamento, mostrando apenas características dos cinco picos destacados e registrar as chamadas de tamanho para cada lócus VNTR para aplicação a jusante. Para explicar os padrões tendenciosos de mobilidade de amplicon durante a eletroforese capilar, calcule as contagens precisas de repetição de VNTR empregando as chamadas de tamanho adquirido em combinação com as variáveis específicas do lócus.A fórmula pode ser implementada em um modelo de planilha para automação. Na planilha, a repetição vnrt calculada em volta conta para o inteiro mais próximo antes da análise a jusante. No software BioNumerics, crie um novo banco de dados e opte por ativar o plugin MLVA.No painel do tipo de experimento, pressione Criar novo tipo de experimento, escolher o tipo caractere e usar as configurações padrão quando solicitado. Em seguida, selecione o novo experimento e adicione novos caracteres para cada um dos 10 VNTR loci, empregando de zero a 100 como a faixa de valor. De volta ao painel principal, importe as contagens de repetição do Yersinia ruckeri VNTR e os dados do método, selecionando campos e caracteres de importação.Localize o arquivo onde este é armazenado e faça seleções na coluna tipo Destino. Para os VNTRs, isso significa selecionar o valor de caractere apropriado, enquanto os metadados diversos são classificados como campos de informações de entrada. As escolhas feitas podem ser armazenadas como um modelo, a fim de facilitar o processo para depois.Selecione amostras importadas destinadas à análise de cluster MST e clique no novo botão de comparação no painel Comparações. Se desejar a apresentação visual do MST, aloque as amostras para grupos coloridos, por exemplo, de acordo com um recurso de metadados específicos. Em seguida, selecione Análise avançada de cluster e MST para obter dados categóricos para gerar um diagrama de MST com base nas amostras escolhidas.Modifique ainda mais a apresentação visual do MST adicionando parâmetros de partição, comprimentos cruzados, rotulagem de ramo de nó, etc. Se necessário, exporte o MST finalizado em formato desejado usando a seleção de imagem Exportar. Após o MULTIPLEX PCR, a imagem de eletroforese em gel verifica a presença de múltiplos amplicons em todas as 12 faixas contendo amostras, com a primeira pista representando a escada de DNA utilizada.Em eletroferómosmos resultantes da eletroforese capilar, os diferentes locis VNTR podem ser identificados de acordo com uma combinação de tamanho e rotulagem de corante. Picos laranja representam o tamanho padrão empregado. Um exemplo de árvore de abrangência mínima, com base nos perfis MLVA de isolados yersinia Ruckeri recuperados de salmão atlântico em cinco fazendas norueguesas diferentes é mostrado.Uma clara tendência de agrupamento ligada à origem da fazenda pode ser observada. A identificação pela MLVA de diferentes clones yersinia ruckeri dominando, por exemplo, em determinadas regiões geográficas de espécies de peixes, já foi explorada para melhorar as estratégias de vacinação contra esse patógeno.

Research

JoVE Journal

Genetics

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Genética

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Estudo da Expressão de Genes Reguladores do Ciclo Celular por dois Protocolos Complementares de Sincronização Celular

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

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Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformação, edição do genoma e fenotipagem do nitrogênio-fixação tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discriminação e mapeamento das transcrições primárias e processadas em Mitocídrias de milho usando uma estratégia circular RT-PCR-based

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigação do papel transcricional de um silenciador intrônico RUNX1 por crispr/Cas9 Ribonucleoproteína em células de leucemia mielóide aguda

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Transcrições de RNA do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) em pacientes por RT-PCR específico

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Caracterização da diferenciação in vitro dos queratinócitos primários humanos pela análise do RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...