Name: multi-locus variable-number tandem-repeat analysis of the fish-pathogenic bacterium yersinia ruckeri by multiplex pcr and capillary electrophoresis
Uploaded: 2019-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis at JoVE.co

Настоящее исследование финансировалось Норвежским исследовательским фондом морепродуктов FHF (проект No 901119 и 901505). Мы хотели бы поблагодарить всех участников бактериальных изолятов и образцов, используемых при разработке метода.

<ol>
	<li>Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+redmouth+disease+(ERM)+(Yersinia+ruckeri).">Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri).</a> Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).</li><li>Barnes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+analysis+of+Yersinia+ruckeri+isolated+over+27+years+in+Australia+and+New+Zealand+reveals+geographical+endemism+over+multiple+lineages+and+recent+evolution+under+host+selection.">Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection.</a> Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).</li><li>Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis+and+multi+locus+sequence+typing+for+characterizing+genotype+variability+of+Yersinia+ruckeri+isolated+from+farmed+fish+in+France.">Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France.</a> Veterinary Research. 46, 73 (2015).</li><li>Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+reveals+high+genetic+diversity+and+epidemic+population+structure+for+the+fish+pathogen+Yersinia+ruckeri.">Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri.</a> Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).</li><li>Wheeler, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+ruckeri+biotype+2+isolates+from+mainland+Europe+and+the+UK+likely+represent+different+clonal+groups.">Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).</li><li>Eyre, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multilocus+variable-number+tandem-repeat+analysis+and+whole-genome+sequencing+for+investigation+of+Clostridium+difficile+transmission.">Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Locus+Variable-Number+Tandem-Repeat+and+Single-Nucleotide+Polymorphism-Based+Brucella+Typing+Reveals+Multiple+Lineages+in+Brucella+melitensis+Currently+Endemic+in+China.">Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China.</a> Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).</li><li>Bouchouicha, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+performances+of+MLVA+vs.+the+main+other+typing+techniques+for+Bartonella+henselae.">Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae.</a> Clinical Microbiology and Infection. 15, 104-105 (2009).</li><li>Dahyot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-Locus+Variable+Number+Tandem+Repeat+Analysis+(MLVA)+and+Tandem+Repeat+Sequence+Typing+(TRST),+helpful+tools+for+subtyping+Staphylococcus+lugdunensis.">Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis.</a> Scientific Reports. 8 (1), (2018).</li><li>Elberse, K. E. M., Nunes, S., S&#225;-Le&#227;o, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-locus+variable+number+tandem+repeat+analysis+for+Streptococcus+pneumoniae:+Comparison+with+PFGE+and+MLST.">Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST.</a> PLoS ONE. 6 (5), (2011).</li><li>Matejusova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable-number+tandem-repeat+genotyping+of+Renibacterium+salmoninarum,+a+bacterium+causing+bacterial+kidney+disease+in+salmonid+fish.">Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish.</a> BMC microbiology. 13, 285 (2013).</li><li>Duodu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+multiple-locus+variable-number+of+tandem+repeat+analysis+(MLVA)+for+the+fish+pathogen+Francisella+noatunensis+using+capillary+electrophoresis.">An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis.</a> BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).</li><li>Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., S&#248;rum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable+number+tandem+repeat+analysis+of+Edwardsiella+piscicida+isolates+pathogenic+to+fish.">Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish.</a> Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).</li><li>Gulla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable-number+tandem-repeat+analysis+of+Yersinia+ruckeri+confirms+the+existence+of+host+specificity,+geographic+endemism,+and+anthropogenic+dissemination+of+virulent+clones.">Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).</li><li>Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cautionary+tale:+Lack+of+consistency+in+allele+sizes+between+two+laboratories+for+a+published+multilocus+microsatellite+typing+system.">A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).</li><li>Lista, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+Bacillus+anthracis+strains+based+on+automated+capillary+25-loci+multiple+locus+variable-number+tandem+repeats+analysis.">Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis.</a> BMC Microbiology. 6, 33 (2006).</li><li>. Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf</a> (2014)</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Оба мультиплекса PCRs представлены здесь оказались относительно надежными в условиях плохого качества ДНК шаблона, но отсутствие усиления ПЦР, тем не менее, иногда наблюдалось при использовании шаблонов с чрезвычайно высокой концентрацией ДНК. Эти проблемы были легко решены путем разбавления шаблонов до ПЦР. Другие методы извлечения ДНК, чем те, которые используются здесь, также могут быть использованы (например, коммерческие наборы).
Хотя от каждой реакции ПЦР ожидается пять ампликонов, от GE не всегда следует ожидать пяти эффектных диапазонов, так как некоторые (по-разному обозначенные) локи VNTR в пределах одной реакции имеют перекрывающиеся диапазоны размеров. Окончательное время расширения ПЦР на 60 мин может быть сокращено при необходимости, но, скорее всего, приведет к увеличению возникновения сплит пиков в последующих электроферограммах CE (см. ниже). Примечательно, что, поскольку цель шага GE заключается исключительно в качественной проверке ампликонов ПЦР, время выполнения, напряжение и/или рецепт геля могут быть скорректированы в качестве предпочтительного. Если GE наблюдает особенно слабые полосы, то может быть целесообразным уменьшить коэффициент разбавления этих образцов до CE.
В то время как описанный здесь протокол CE был запущен на конкретном коммерческом аппарате электрофореза капилляров (см. Таблицаматериалов), различные системы CE могут иметь различные требования к выборке, что, в свою очередь, может вызвать некоторые изменения в протоколе . Для анализа фрагментов в руководстве соответствующего производителя системы CE можно усмотреть руководство по соответствующим реагентам/оборудованию, калибровке и т.д. Существует также возможность того, что предвзятые модели мобильности ампликонов, наблюдаемые во время CE, могут отличаться, относительно, в системах ce и/или машинах, как это было ранее задокументировано для других протоколов MLVA15,16. Если происходит в той степени, где окончательные (округленные) VNTR повторных отсчетов становятся затронутыми, это означает, что локус конкретных переменных s и i (таблица 1), используется для определения VNTR повторных отсчетов, должны быть перекалиброваны. Это включает в себя линейную регрессию на участках сравнения точных размеров последовательности по сравнению с CE размер звонки, как описано Gulla et al. 201814.
Сплит пики и пики заикания, как известные артефакты в CE на основе MLVA набрав17, можно наблюдать в электроферограммах во время вызова размера (Рисунок 4). В то время как пики заикания следует игнорировать, более длинный пик должен последовательно побираться для приложений вниз по течению в случае разделенных пиков, разделенных одной базовой парой. Кроме того, отсутствующие пики, указывающие на отсутствие конкретных локусов VNTR редки, но могут возникнуть, и в этом случае следует назначить повторный подсчет '0'. Если начальная культура, из которой извлекается ДНК, не является чистой (т.е. содержит более одного подтипа Y. ruckeri), то после CE могут наблюдаться несколько высоких пиков, соответствующих различным аллелям одного и того же локуса/локусов. Вторичное культивирование должно быть выполнено из отдельных колоний до новой добычи ДНК для повторного ввода.
Как указано в протоколе, шаблон ДНК для ПЦР должен по умолчанию быть извлечен из чистых культур Y. ruckeri. В некоторых случаях, однако, образцы яичной жидкости, положительные для Y. ruckeri qPCR (Ct-values zlt; 27) были успешно MLVA набраны непосредственно, без предварительного культивирования, используя увеличенное количество геномной ДНК (извлеченной с коммерческим комплектом) в качестве шаблона. Хотя этот подход не был тщательно протестирован и не проверен, он указывает на потенциал этого анализа MLVA для изучения сложных биологических матриц, содержащих ДНК из целого ряда различных организмов в дополнение к Y. ruckeri.
Вся представленная здесь процедура ввода MLVA, от экстракции ДНК до эпизоотиологической оценки, может быть завершена за один рабочий день. Тем не менее, количество исследованных образцов находится в сублинейной связи со временем, необходимым для извлечения ДНК, ПЦР и CE, и поэтому метод является гораздо более эффективным временем при запуске нескольких образцов одновременно. Это, тем не менее, относится к большинству лабораторных методов, и в качестве инструмента для эпидемиологического субтипирования Y. ruckeri, сочетание высокого разрешения, простоты и портативности делает этот анализ MLVA выше ранее опубликованных протоколов4 ,5. Он также был использован для проверки ограниченной эпидемиологической значимости Y. ruckeri серотипирования14.
Благодаря комплексному исследованию популяции на основе MLVA с участием 484 Y. ruckeri изолятов, извлеченных из целого ряда пространственно-временное происхождение и места обитания (рыба-хозяин, окружающая среда и т.д.), наше понимание в отношении эпизоотиологии и населения структура этого важного патогена рыбы была существенно увеличена14. Типирование MLVA позволило отслеживать клонов, распространяемых антропогенно на протяжении десятилетий, предположительно путем транспортировки рыбы, а также идентификацию местных штаммов. Кроме того, в то время как некоторые клональные комплексы бактерии могут быть явно связаны с болезнями, в частности, с рыбой (радужная форель и атлантический лосось, соответственно), другие были восстановлены только из экологических источников и/или клинически незатронутых рыб Образцов. Таким образом, применимость метода не ограничивается лишь отслеживанием инфекции, поскольку она может также предоставлять информацию, имеющих потенциальную значимость, например для разработки вакцин, оценки рисков и поддержания национальной биобезопасности. В настоящее время он активно используется в Норвежском ветеринарном институте в качестве инструмента для исследования диагнозов Y. ruckeri в норвежской аквакультуре.

Yersinia ruckeri, Грамм-отрицательная бактерия и член семьи Yersiniaceae, вызывает yersiniosis в выращиваемых лососевых рыб во всем мире1. Он легко диагностируется от инфицированных рыб путем выращивания на многих видах агар средств массовой информации, но до недавнего времени, мало было известно о структуре населения и эпизоотиологии Y. ruckeri по всему миру и в различных средах обитания (принимающих видов и т.д.). Существующие серотипные системы для Y. ruckeri несовместимы, не имеют взаимной совместимости и предлагают низкое эпидемиологическое разрешение. Некоторые молекулярные исследования на бактерии были проведены, используя методы, такие как Multilocus последовательности ввода (MLST), Пульс-поле гель электрофорез (PFGE) или последовательность всего генома (WGS) анализ2,3,4 ,5. Тем не менее, MLST не обеспечивает достаточно высокое разрешение для рутинного отслеживания инфекции, в то время как PFGE является трудом требовательных и производит результаты, которые не легко портативных через лаборатории. Хотя анализ РГС обеспечит почти окончательное решение, создание и осуществление таких анализов будет предпосылкой технических и биоинформатических возможностей, которые, тем не менее, по-прежнему ограничиваются относительно небольшим числом лабораторий.
Multi-locus переменный номер тандем-повторный анализ (MLVA) представляет собой простой и легко доступный молекулярный инструмент ввода, который предлагает генетическое разрешение в некоторых случаях почти соответствует анализу WGS6,7. Метод основан на повторном изменении числа в выбранных парадем-повторении переменного числа (VNTR), в результате чего выходные данные, которые очень переносимы, что делает сравнение профилированных изолятов по отношению к онлайновым базам данных и через лаборатории простым. Хотя MLST остается золотым стандартом для эпидемиологического ввода многих бактериальных патогенов, все большее число исследований определить значительно выше дискриминационной мощности MLVA8,9,10. Несколько протоколов были также опубликованы ориентации рыбы патогенных бактерий, таких как Francisella noatunensis, Edwardsiella piscicida и Renibacterium salmoninarum11,12, 13.
Десять-loci MLVA протокол, представленный здесь, который недавно лег в основу обширного исследования Y. ruckeri населения14, включает в себя извлечение ДНК из агар-культивируемых колоний, мультиплекс ПЦР и капиллярного электрофореза (CE), затем вниз по течению в силико приложений. Для каждого исследованного изолята два пХР мультиплекса, которые содержат пять флуоресцентно обозначенных грунтовок (6FAM, NED или VIC), каждая из которых ориентирована на отдельные регионы ВНТР, работают параллельно в одинаковых условиях. После проверки ампликонов ПЦР с помощью гелевого электрофорезиса (GE) продукты ПЦР разбавляются до анализа СЕ, а пики, представляющие соответствующие локи VNTR, называются из полученных электроферограмм. Вместе с локусовыми формулами, учитывающими незначительные, специфические последовательность расхождения в миграционных моделях CE, вызовы размера VNTR CE затем используются для расчета повторных отсчетов VNTR, которые сливаются в десятизначные профили MLVA. Они используются в качестве входных данных для эпизоотиологических оценок (например, кластерного анализа в диаграммах минимального охвата дерева (MST).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >22&#176;C/15&#176;C incubator</td>
			<td >As preferred.</td>
			<td >NA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5&#39; Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>450007</td>
			<td>Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agarose, universal, peqGOLD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789P/732-2788</td>
			<td>Used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avant 3500xL Genetic Analyzer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30469</td>
			<td>Used for capillary electrophoresis fragment analysis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BioNumerics7 modules</td>
			<td>Applied Maths</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge(s)</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15612</td>
			<td>Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Loading dye used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Centrifuge tubes used during DNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freezer</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fume cupboard</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel electrophoresis system</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneMapper Software 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4475073</td>
			<td>Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0373</td>
			<td>DNA ladder used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4408399</td>
			<td>Size standard used during capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311320/4440753</td>
			<td>Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Milli-Q water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multiplex PCR&#160;Plus&#160;Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>206151/206152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR thermal cycler</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26077/4393713/4393709</td>
			<td>Separation matrix used during capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pure culture Yersinia ruckeri</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>E.g. cryopreserved or fresh.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>NA</td>
			<td>In: Multiplex PCR&#160;Plus&#160;Kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-borate-EDTA (TBE)&#160; buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsine soy agar/bovine blood agar</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-based gel imaging/visualisation system</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortexer</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-locus variable-number tandem-repeat analysis of the fish-pathogenic bacterium yersinia ruckeri by multiplex pcr and capillary electrophoresis

Yersinia ruckeri является важным патогеном выращиваемых лососевых во всем мире, но простые инструменты, пригодные для эпизоотиологических исследований (отслеживание инфекции и т.д.) этой бактерии не хватает. Таким образом, анализ тандема с переменным числом Multi-Locus (MLVA) был разработан как легкодоступный и недвусмысленный инструмент для генотипирования восстановленных изолятов с высоким разрешением. Для анализа MLVA представлено здесь, ДНК извлекается из культивированных образцов Y. ruckeri путем кипячения бактериальных клеток в воде, а затем использование супернатанта в качестве шаблона для ПЦР. Primer-пары ориентации десять переменных числа тандем-повторить (VNTR) локусов, перемежаются по всему геному Y. ruckeri, распределяются поровну между двумя пятью plex PCR реакций работает в идентичных условиях езды на велосипеде. Передние грунтовки помечены любым из трех флуоресцентных красителей. После подтверждения амплитона гелем электрофорезом продукты ПЦР разбавляются и подвергаются капиллярному электрофорезу. Из полученных профилей электроферограммы пики, представляющие каждый из локусов VNTR, называются и используются для расчета повторных отсчетов VNTR в силико. В результате десятизначные профили MLVA затем используются для создания минимального охватывающего деревьев, позволяющих эпизоотиологические оценки кластерного анализа. Высоко портативные выходные данные, в виде численных профилей MLVA, можно быстро сравнить между лабораториями и поместить в пространственно-временном контексте. Вся процедура от культивируемой колонии до эпизоотиологической оценки может быть завершена на срок до 48 Y. ruckeri изолятов в течение одного рабочего дня.

После мультиплекса PCR, как описано здесь, типичное изображение GE, проверяющее наличие нескольких амплеконов от каждой реакции ПЦР показано на рисунке 1. Анализ фрагментов CE вниз по течению, выполненный на проверенных продуктах ПЦР, для каждого изолировать Y. ruckeri, в результате чего будут два электроферограммы файлов, используемых для вызова размера соответствующего Loci VNTR(рисунок 2). Из анализа 484 разнообразных изолятов Y. ruckeri, не было совпадений в диапазоне размеров ампликона не наблюдалось между локусом VNTR, помеченными тем же красителем в той же реакции мультиплекса (Таблица 1)14. Поэтому каждый из электрофоретических пиков можно однозначно определить по цвету.
После импорта профилей MLVA и соответствующих метаданных в предпочтительное программное обеспечение, диаграммы MST могут быть построены, как описано для изучения любых эпидемиологических моделей, представляющих интерес к материалу. Проконсультируйтесь с соответствующими руководствами для получения дополнительных опций, доступных в соответствующем программном обеспечении. В качестве примера на рисунке 3 показано сравнение MST профилей MLVA для изолятов Y. ruckeri, извлеченных из рыбы, связанной с пятью различными лососевыми фермами в Норвегии.
Последовательные размеры повторения десяти локутов VNTR, а также их in vitro и in vivo stability, ранее были проверены в первоначальном исследовании, основанном на этом протоколе14. Кратко, это было сделано с использованием секвенирования Sanger (повторный размер), и MLVA набрав несколько изолятов после серийных проходов (в пробирке) и в рамках отдельных вспышек болезни (in vivo). Кроме того, экологическая стабильность локусов с течением времени была изучена путем ввода нескольких изолятов "домашнего штамма", извлеченных в течение нескольких лет из постоянно зараженных мест производства пресной воды для атлантического лосося.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig1.jpg"> Рисунок 1 : Гель электрофорез, проверяющий наличие нескольких продуктов ПЦР. Изображение подтверждает наличие нескольких амплетонов ПЦР во всех 12 полосах, содержащих образцы, при этом первая полоса представляет собой лестницу ДНК. Были указаны размеры отдельных фрагментов лестницы, а также пЦР-тест и деформация (см. таблицу S1 в Gulla et al. 201814)принадлежность каждой полосы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig2.jpg"> Рисунок 2 : Электроферограммы, показывающие пики, соответствующие ампликонсам VNTR. Названия различных loci VNTR указаны, с красителя этикетки (VIC и зеленый; NED - черный; 6FAM и синий) в скобках. Две электроферограммы (PcR-асссс 1 верхняя часть; ПЦР-ассса 2 дна) происходит от ввода одного изолята Y. ruckeri. Оранжевые пики (краситель ЛИЗ) представляют собой стандарт размера используется. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig3.jpg"> Рисунок 3 : Пример Минимального охвата дерева для эпидемиологической оценки. Диаграмма основана на профилях MLVA из изолятов Y. ruckeri, извлеченных из атлантического лосося на пяти различных норвежских фермах (1-5; см. легенду) с периодическими вспышками йерисниоза. Можно наблюдать четкую тенденцию кластеризации, связанную с происхождением фермы. Кроссссылки показывают все возможные соединения, связанные с неидентичными loci VNTR (см. легенду). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig4.jpg"> Рисунок 4 : Электроферограмма визуализации заикания и раскол пиков. В этом случае, оба происходят одновременно, что не всегда так. Более длинный и высокий пик, представляющий locus YR1070 VNTR, можно легко выделить. Дисплей увеличен и показывает только пики синих красителя. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59455/59455table1.jpg"> Таблица 1: Характеристики локуса VNTR. Соответствующие характеристики десяти регионов Y. ruckeri VNTR были поставлены в настоящее время протоколом MLVA.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis at JoVE.co

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-Locus переменный номер тандем-повторный анализ (MLVA) анализ представлен здесь позволяет недорогой, надежный и портативный генотипирования высокого разрешения рыбы патогенной бактерии Yersinia ruckeri. Начиная с чистых культур, в ассейном используются мультиплексп ПЦР и капиллярный электрофорез для получения десятилокий профилей MLVA для приложений ниже по течению.

Мульти-локус переменный номер Тандем-повтор Анализ рыбы-патогенной бактерии Yersinia ruckeri по multiplex PCR и Капиллярэлектрорез

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Этот протокол генотипирования MLB значительно повысил наше понимание эпидемиологии и глобальной структуры популяции Yersinia ruckeri, международно важной патогенной бактерии рыбы. По сравнению с ранее установленными схемами ввода Yersinia ruckeri, он предлагает очень высокое разрешение напряжения. Процедура проста, дешева, и награды портативных результатов, которые можно легко сравнить в лабораториях.Методика значительно улучшает диагностическую специфичность и позволяет отслеживать инфекцию. Например, теперь мы часто можем различать вирулентные клоны Yersinia ruckeri, существующие на фоне невирулентных экологических штаммов. Демонстрацией процедуры будет Сайма Насрин Мохаммад, техник в нашей лаборатории.Для начала используйте стерильные петли прививки, чтобы посеять Yersinia ruckeri чистых культур на любой подходящий тип агара на чашках Петри. Инкубировать при 22 градусах по Цельсию в течение одного-двух дней или 15 градусов по Цельсию в течение трех-четырех дней. После этого, используя циклы прививки, выберите одну репрезентативную колонию из каждой чашки Петри и перенесите в 1,5-миллилитровые центрифуги трубы, содержащие 50 микролитров ультраочищенные воды для повторного использования.Vortex кратко и инкубировать в течение семи минут на отопительный блок при 100 градусов по Цельсию. Затем центрифуга на 16 000 г в течение трех минут и использовать пипетку, чтобы тщательно передать супернатант шаблон ДНК в пустые 1,5-миллилитровые центрифуги труб. Перейти к следующему шагу или хранить ДНК на 20 градусов по Цельсию.Для подготовки мастер-миксов сначала вычисляйте объемы реагентов в зависимости от количества анализируемых бактериальных образцов, также учитывая один отрицательный и один положительный контроль, и окончательный объем 10%излишков, как описано в рукописи. Обратите внимание, что используются различные концентрации грунтовки. В двух отдельных центрифуга труб, по одному на pcR анализ, добавить мультиплекс ПЦР плюс мастер смесь, грунтовки, и RNase свободной воды.Vortex подготовленный мастер смешивает мягко на низкой скорости, а затем, распространять 22 микролитров каждого мастера смесь отдельно в отдельных скважин на либо ПЦР полосы или пластины. Затем добавьте три микролитров подготовленного шаблона ДНК к каждому хорошо содержащем мастер-микс;две скважины на образец бактерий, по одному для каждого анализа. Используйте ДНК из проверенного штамма Yersinia ruckeri для положительного контроля, и ультра очищенной воды для отрицательного контроля.Печать и центрифуга кратко. Загрузите подготовленные реакции на термохитр ПЦР и навейте программу в соответствии с рукописью. Программа завершится менее чем за три часа.В соответствии с рекомендациями производителя, добавить порошок агарозы гель в один раз буфер TBE для достижения 1,5 веса / объема процентов и тепла для растворения. Перед литьем охладите растворенного геля под проточной водой, добавьте 5 микролитров флуоресцентного нуклеиновой кислоты на 50 микролитров раствора геля и перемешайте. Соберите и выровнять литье лоток.Добавьте конусы по мере необходимости для количества образцов. Налейте гель раствор в гипс и ждать, пока он затвердеет. После этого погрузите гипс, содержащий гель, в один раз буфер TBE в гелевую электрофорезную систему.Смешайте пять микролитров продуктов ПЦР вместе с двумя микролитров погрузочного красителя в новые полоски ПЦР. Перенесите пять микролитров смесей в скважины в геле. Сохранить по крайней мере один хорошо пуст.Добавьте пять микролитров лестницы ДНК в пустой колодец для справки. Подключите электроды и запустите гель на 110 вольт на 15 сантиметров в течение примерно одного часа. Используйте УФ-систему визуализации геля для проверки наличия нескольких полос, представляющих AMplicons КНР.После подтверждения ПЦР-ампликонов используйте новые полоски ПЦР или пластины для разбавления продуктов ПЦР от одного до 10 в очищенной воде. Вихрь и центрифуга кратко. Во время работы в паровом шкафу, подготовить мастер смесь в центрифуге трубки, состоящей из формамида и эталонного размера стандартного решения.По количеству анализируемых продуктов ПЦР используйте тома реагентов, как описано в рукописи. Разрешить 10%-ный объем. Vortex кратко и распространять 9,5 микролитров в отдельных скважин на ПЦР пластины подходит для доступной капиллярной системы электрофореза.Затем добавьте 0,5 микролитров разбавленного ПЦР-продукта. Печать и центрифуга кратко. Затем загрузите пластину, содержащую образцы, в термохикер PCR и денатуратуруйте образцы при 95 градусах Цельсия в течение трех минут, прежде чем остыть до четырех градусов по Цельсию на неопределенный срок.Центрифуга при 1000 г в течение одной минуты, тщательно удалите уплотнение и загрузите пластину на откалиброванную капиллярную электрофорезную систему в соответствии с инструкциями производителя. Вы запустите фрагмент анализа капиллярного электрофореза, используя реагенты, соответствующие аппарату выбора, и отрегулируйте условия ведения в соответствии с описанием в рукописи. Для Yersinia ruckeri VNTR капиллярный электрофорез размер вызова, первый импорт капиллярного электрофореза результат файлов в Gene Mapper 5 программного обеспечения.Установите метод анализа, Microsatellite по умолчанию, выберите соответствующий выбор продукта в соответствии со стандартом размера, а затем нажмите кнопку анализа. С помощью редактора матча размера пройдите проверку правильной идентификации стандартных фрагментов размера и исправите любые явно ошибочные выделения. Затем выберите образец для чтения, нажмите кнопку Display Plot и нажмите Control A, чтобы можно было просмотреть таблицу размеров.Находясь в верхней панели, удерживайте управление, нажимая на пять пиков, представляющих VNTR amplicons. Управление прессой G для фильтрации таблицы размеров, показывая только характеристики пяти выделенных пиков, и записывать размер вызовов для каждого локуса VNTR для приложения вниз по течению. Для учета предвзятых моделей подвижности ампликона во время капиллярного электрофореза вычислите точные отсчеты повторов VNTR, используя приобретенные вызовы размера в сочетании с конкретными переменными локуса.Формула может быть реализована в шаблоне электронной таблицы для автоматизации. В электронной таблице круглое рассчитанное повторение VNRT отсчитывается до ближайшего центнера до анализа ниже по течению. В программном обеспечении BioNumerics создайте новую базу данных и хотите активировать плагин MLVA.В панели типа эксперимента нажмите Создайте новый тип эксперимента, выберите тип символа и используйте настройки по умолчанию, когда их попросят. Затем выберите новый эксперимент и добавьте новые символы для каждого из 10 локусов VNTR, используя от нуля до 100 в качестве диапазона значений. Вернуться в основной панели, импорт Yersinia ruckeri VNTR повторных подсчетов и метод данных путем выбора импортных полей и символов.Найдите файл, в котором он хранится, и сделайте выбор в столбце типа Destination. Для VNTRs это означает выбор соответствующего значения символа, в то время как различные метаданные классифицируются как поля входной информации. Сделанный выбор может храниться в качестве шаблона, чтобы облегчить процесс на более поздний этап.Выберите импортированные образцы, предназначенные для анализа кластеров MST, а затем нажмите кнопку «Создать новую кнопку сравнения» в панели сравнения. При желании для визуального представления MST, выделить образцы для цветных групп, например, в соответствии с конкретной функцией метаданных. Затем выберите Расширенный кластерный анализ и MST для категоричных данных для создания диаграммы MST на основе выбранных образцов.Далее измените визуальную презентацию MST, добавив параметры раздела, поперечные длины, маркировку ветви узла и т.д. При необходимости экспортировать завершенный MST в нужном формате с использованием выбора изображения экспорта. После мультиплекса PCR, гель электрофорез изображение проверяет наличие нескольких ампликонов во всех 12 полос, содержащих образцы, с первой полосой, представляющей лестницу ДНК используется.В электроферограммах, полученных в результате капиллярного электрофореза, различные локусы VNTR можно определить в зависимости от сочетания размера и маркировки красителя. Оранжевые пики представляют собой используемый стандарт размера. Например, показан минимальный охватывающий дерево, основанный на профилях MLVA из изолятов Yersinia Ruckeri, извлеченных из атлантического лосося в пяти различных норвежских фермах.Можно наблюдать четкую тенденцию кластеризации, связанную с происхождением фермы. Идентификация MLVA различных клонов Yersinia ruckeri, доминирующих, например, в частности географических регионах видов рыб, уже была использована для улучшения стратегий вакцинации против этого патогена.

Research

JoVE Journal

Genetics

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Использование Флуоресцентный ПЦР-капиллярного электрофореза гель Техника генотипу CRISPR / cas9-опосредованной Нокаут Мутанты в формате высокой пропускной способностью

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Анализ промотора c-KIT-лиганда с использованием иммунопреципитации хроматина

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Изучение экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, двумя протоколами синхронизации комплементарных ячеек

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Двунаправленная ретровирусная интеграция сайта Методология ПЦР и количественный анализ данных

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Цифровой ПЦР на основе конкурентного индекса для высокой пропускной способностью анализ фитнеса в сальмонелле

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Преобразование, редактирование генома и фенотипирование азота фиксации тропических каннабацеи Дерево Параспония andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Дискриминация и картирование первичных и обработанных стенограмм в митохондрии кукурузы с использованием круговой стратегии на основе РТ-ПЦР

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Исследование транскрипционной роли интронического глушителя RUNX1 от CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин в острых миелоидных клеток лейкемии

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Обнаружение вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) Антисмысление белка (ASP) РНК Стенограммы у пациентов Strand-специфический RT-PCR

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Характеристика в пробирке Дифференциация первичных кератиноцитов человека с помощью анализа РНК-Сек

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...