Name: multi-locus variable-number tandem-repeat analysis of the fish-pathogenic bacterium yersinia ruckeri by multiplex pcr and capillary electrophoresis
Uploaded: 2019-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis at JoVE.co

Bu çalışmada Norveç deniz ürünleri araştırma fonu, FHF (Proje No. 901119 ve 901505) tarafından finanse edilmiştir. Yöntem geliştirme sırasında kullanılan bakteriyel izolatlar ve numunelerin tüm katılımcılara teşekkür etmek istiyoruz.

DIKKAT: protokolün tamamı Için, laboratuar paletleri, tek kullanımlık eldivenler ve steril reaktifler ve ekipmanlar kullanılarak steril olarak tüm ıslak laboratuar prosedürlerini yapmak tavsiye edilir. Ayrıca, PCR amplifikasyonu ve/veya PCR ürünlerinin (Post-PCR) işlenmesi için kullanılmayan ayrı bir odada (Pre-PCR) PCAR reaksiyonları hazırlamak için tavsiye edilir. Üreticinin önerdiği şekilde tüm reaktifleri saklayın. Kullanılan reaktifler, ekipmanlar ve yazılımlar hakkında daha fazla bilgi için malzeme tablosunu görün.
1. genomik DNA bakteri ekimi ve ekstraksiyon
<ol><li>Herhangi bir uygun agar tipi üzerinde Y. ruckeri saf kültürler Sow (yazarlar% 5 sığır kan agar kullanılır) ve 1-2 gün Için 22 °c veya 3-4 gün Için 15 °c inkübe.</li>
	<li>Her agar plaka, bir aşı döngü ile tek bir temsilci koloni seçin ve 1,5 ml Santrifüjlü tüpler 50 μL ultrapurified su içeren transfer. 100 °C ' de bir Isıtma bloğunda 7 dakika süreyle askıya alın, kısa bir süre koyun ve inküye yapın.</li>
	<li>3 dakika boyunca 16 000 x g 'de santrifüjün ve süpernatant 'i boş bir 1,5 ml santrifüj tüpüne dikkatle aktarmak için bir pipet kullanın. Süpernatant 'i şablon DNA 'sı olarak kullanarak bir sonraki adıma geçin veya bu zamana kadar-20 °c ' de saklayın.</li>
</ol>2. Multiplex PCR kurulum ve bisiklet koşulları
Not: Her bir Multiplex PCR reaksiyonu (iki Y. ruckeri izole) 12,5 μL 2x MULTIPLEX PCR Plus Master mix, 0,1-0,2 μM her uygun astar çifti (Tablo 1) ve 3 μL şablon DNA, 25 μL son reaksiyon hacmine göre ayarlanmış içermelidir RNase-Free su ilavesi. Floresan etiketli ileri-astarların ışık pozlamasını en az (örn. depolama tüplerini alüminyum folyo içinde sararak) tutmayı hedefliyoruz.
<ol><li>İki Multiplex PCR her biri için (Tablo 1), örnek sayısı artı bir pozitif ve bir negatif kontrol göre yukarıda açıklandığı gibi (şablon DNA olmadan) ana karışımları hazırlayın. Ayrıca,% 10 fazla hacim sağlar. Hazırlanmış ana Vortex yavaşça düşük hızda karışımları.</li>
	<li>Her bir ana karışımın 22 μL 'sini, örnek sayısına uygun olarak PCR şeritleri veya plakaları üzerinde ayrı farklı kuyular halinde dağıtın ve her bir kuyu için 3 μL şablon ekleyin (sırasıyla pozitif ve negatif kontroller için, doğrulanmış bir Y 'den DNA kullanın . ruckeri gerilme ve ultrapurified su). Mühür ve santrifüjle kısaca.</li>
	<li>Aşağıdaki program ile bir PCR termal bisikletçi üzerinde tüm örnekleri çalıştırın: (i) 95 °C ' de 5 dk (ii) 95 °C ' de 0,5 dk, 60 °c ' de 1,5 dk, 72 °c ' de 1 dak ve 60 °c ' de (iii) 68 dk ve 4 °C ' ye kadar süresiz olarak soğutulması. Program 3 saatten az bir sürede tamamlanır.</li>
</ol>3. jel elektroforezi ile PCR Amplicon onayı
<ol><li>Üreticinin tavsiyelerine göre, test edilecek PCR reaksiyonları sayısına uygun 1x Tris-borate-EDTA (TBE) tamponunun% 1,5 (w/v) agaroz jel hacmini hazırlayın. Döküm öncesinde, 50 μL jel çözeltisi ve karışımı başına 5 μL floresan nüklik asit boya ekleyin. Döküm için uygun olarak tepsiler ve Taraklar kullanın, DNA referans merdivenler için uygun kuyu sayısı serbest bırakarak.</li>
	<li>Ayarladıktan sonra, bir GE sisteminde 1x TBE-buffer içinde jel alt. 5 μL PCR ürününü 2 μL yükleme boyasıyla ve jel kuyularına aktararak karıştırın. Referans için boş kuyuları 5 μL DNA merdiven ekleyin.</li>
	<li>Yaklaşık 1 saat için 15 cm başına 110 V 'de jeli çalıştırın ve PCR ampliconları temsil eden çoklu (beş) bandın varlığını doğrulamak için UV bazlı jel görüntüleme/görselleştirme sistemi kullanın (örnek Şekil 1' de bakın). Jeli atın. Bir sonraki adıma geçin veya kalan PCR ürünlerini daha fazla işleme kadar 4 °C ' de saklayın.</li>
</ol>4. kapiller Elektroforez kurulum ve çalıştırma koşulları
<ol><li>PCR amplicons onay aşağıdaki, seyreltilmiş PCR ürünleri 1:10 (v/v) arıtılmış su. Mühür, mix ve santrifüj kısaca.</li>
	<li>Bir duman dolabında çalışma, 9 μL Formamid ve 0,5 μL boyutu standart PCR ürün başına (% 10 fazla hacim izin) oluşan bir ana Mix hacmi hazırlayın. Vortex, 0,5 μL seyreltilmiş PCR ürününü eklemeden önce, 9,5 μL 'i kullanılabilir CE sistemine uygun bir plakanın üzerine kısa bir süre içinde dağıtın. Mühür, mix ve santrifüj kısaca. Dikkat: Dikkatli ele. Su ile karıştırma Formamid toksik olan formik asit üretir.</li>
	<li>PCR termal bisikletçiler kullanarak, 4 °C ' ye kadar süresiz olarak soğutmadan önce 95 °C ' de 3 dk. Kısa bir süre santrifüjle ve plakayı üreticinin talimatlarına göre kalibre edilmiş bir CE sistemine yükleyin.</li>
	<li>Seçim aparatı ve aşağıdaki ayarları uygun olarak reaktifler kullanarak parça analizi CE çalıştırın: 60 °C; 1,6 kV 'da 5 s enjeksiyon (cm başına 32 V); 32 dk çalışma süresi 15 kV (300 V/cm). 24-kapiller (50 cm) üzerinde 24 kuyuların CE parçası Analizi genellikle yaklaşık 50 dakika sürer.</li>
</ol>5. VNTR boyut çağırma, Repeat Count hesaplama ve MLVA profil oluşturma
Not: Adım 5,1, malzeme tablosundalistelenen belirli bir yazılımı kullanarak, Y. ruckeri VNTR CE boyutu elektroferogramları dosyalarından arama açıklar. Ek ayrıntılar ve sorun giderme için yazılım kılavuzuna başvurun. Diğer yazılımları kullanmak için uygun kılavuzlara danışın.
<ol><li>
CE sonuç dosyaları (iki Y. ruckeri izole) içe aktarın. Analiz yöntemini mikro uydu varsayılan olarak ayarlayın ve analiz düğmesine basmadan önce boyut standardı altında uygun ürün seçimini seçin. Boyut eşleştirme Düzenleyicisi aracılığıyla boyut standart parçalarının doğru kimliğini doğrulayın ve görünür hatalı tahsisleri düzeltin.
	<ol>
<li>Okunacak örnek (ler) seçilmişse, ekran grafikleri düğmesine basın ve boyutlandırma tablosunungörünümünü etkinleştirmek için CTRL + A tuşlarına basabilirsiniz. Üst panelde ise, CTRL tuşunu basılı tutarak VNTR amplikonlar temsil eden beş doruklarına tıklayarak (gerektiğinde Yakınlaştırma aracını kullanın). Not: Multiplex PCR ürünlerinin her biri için elektroferogramları, kullanılan üç boya arasında dağıtılan beş zirveyi gösterecektir (bkz. Tablo 1 ' deki ileri astarların 5 ' boya etiketlemesi ve Şekil 2' de iki örnek).</li>
		<li>Boyutlandırma tablosunufiltrelemek için CTRL + G tuşlarına basın, yalnızca beş vurgulanan zirvenin özelliklerini gösterir ve her VNTR Locus ( Tablo 1' e başvuru ile) için aşağı akış uygulaması için CE boyutu çağrıları kaydeder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CE sırasında önyargılı amplikon mobilite desenlerini hesaba eklemek için, aşağıda verilen formüle göre doğru VNTR tekrarlama sayılarını hesaplayın, Locus 'a özgü değişkenlerle birlikte VNTR CE boyutu çağrıları (bkz. Tablo 1). Verimlilik için, bu işlemi otomatikleştirmek için tavsiye edilir (örneğin, bir elektronik tablo şablonu kullanarak). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59455/59455eq1.jpg">
</li>
	<li>Yuvarlak hesaplanan VNTR Repeat en yakın tamsayı için sayar ve on basamaklı dizeleri, her bir tek Y. ruckeri izole mlva profilini temsil eden birleştirir.</li>
</ol>6. MLVA verilerinin minimum yayılma ağacı küme analizi
Not: Adım 6, malzeme tablosundalistelenen belirli yazılımları kullanarak Y. ruckeri MLVA verilerinden MST diyagramlarının oluşturulmasını açıklar. Ek ayrıntılar ve sorun giderme için yazılım kılavuzuna başvurun. Diğer yazılımları kullanmak için uygun kılavuzlara danışın.
<ol><li>Yeni bir veritabanı oluşturun ve MLVA eklentisi etkinleştirmek için tercih.</li>
	<li>Y. ruckeri mlva profillerini ve meta verilerini içe aktarma alanları ve karakterleri (depolama biçimine bağlı olarak daha fazla alt seçim) izleyen karakter türü verilerini seçerek alın. İstendiğinde, alma dosyasının içeriğine göre alma kurallarını belirtin: hedef türü sütununda, VNTR yineleme sayar karakter değeri olarak sınıflandırmak : VNTRve çeşitli meta veriler giriş bilgileri: giriş bilgisi alanı . Not: Karşılaştırma ve bağlam için, mevcut MLVA Protokolü14kullanan orijinal kağıt ile birlikte yayımlanan tüm veri kümesini (açık erişim) almak da mümkündür. MLVA profilleri ve meta verileri Y. ruckeri ısolates (n = 484) çeşitli koleksiyonu üzerinde bu çalışmada incelenir ek malzeme (Tables S1 ve S2) aşağıdaki bağlantı aracılığıyla kullanılabilir: https://AEM.asm.org/content/84/16/e00730-18/Figures-Only#fig-data-additional-files</li>
	<li>Deneme türü panelinde, VNTR girişini açın ve her VNTR Locus için minimum ve maksimum değerleri 0 ve 100, sırasıyla ayarlayın. Genel ayarlaraltında ondalık basamak sayısını 0 olarak ayarlayın ve veri türüaltındaki sayılar 'ı seçin. Eksik değerleri sıfır olarak dikkate almak için denetleyin.</li>
	<li>
MST küme çözümlemesi için hedeflenen alınan örnekleri seçin ve yeni karşılaştırma Oluştur düğmesini tıklatın (karşılaştırma panelinde).
	<ol>
<li>MST 'nin görsel sunumu için istenirse, örnekleri renkli gruplara ayırın (örn. belirli bir meta veri özelliğine göre) gruplar panelinde kullanılabilen çeşitli seçenekleri uygulayarak. Not: Gruplar Ayrıca, aşağıdaki adımlardan sonra retrospektif olarak oluşturulabilir/değiştirilebilir.</li>
		<li>Seçin Gelişmiş küme çözümlemesi... ve MST sınıflandırımsal veri için seçilen ÖRNEKLERI temel alan bir MST diyagramı oluşturmak için.</li>
		<li>MST 'nin görsel sunumunu tercih ettiği gibi daha fazla değiştirin (örn., bölümleme parametreleri, düğüm/şube etiketleme, çapraz bağlantılar, efsaneler, vb. ekleyerek). Örnek Şekil 3' te bakın. Not: > 5/10 olmayan özdeş VNTR loci temsil eden şube bağlantılarının saklanmaya ek olarak, ≤ 4/10 eşit olmayan VNTR loci eşik bölümleme küme (clonal karmaşık), daha önce üretilen MLVA veri dayalı MST küme analizi için istihdam edilmiştir Bu protokol14kullanarak. 484 Y. ruckeri mlva profillerinin yukarıda bahsedilen veri kümesi alınmıştı, bu örnekler de MST küme analizi için dahil edilebilir (yukarıda açıklandığı gibi) küresel ve tarihsel bir bağlam sağlamak için. Bu, örneğin daha önce açıklanan klonal kompleksleri ile bağlantılı herhangi bir numunenin tanımlanması ve henüz açıklanmayan soyları temsil eden kişiler gibi olacaktır. Kullanılabilir meta verilere bağlı olarak, elde edilen MST diyagramı farklı şekillerde, örneğin belirli özelliklere (coğrafya, konak, zaman vb.) bağlı nihai kümeleme desenleri keşfetmek için incelenebilir.</li>
		<li>Gerekirse, sonlandırılmış MST verme görüntü seçimi kullanarak istenen bir biçimde verin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+redmouth+disease+(ERM)+(Yersinia+ruckeri).">Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri).</a> Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).</li><li>Barnes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+analysis+of+Yersinia+ruckeri+isolated+over+27+years+in+Australia+and+New+Zealand+reveals+geographical+endemism+over+multiple+lineages+and+recent+evolution+under+host+selection.">Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection.</a> Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).</li><li>Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis+and+multi+locus+sequence+typing+for+characterizing+genotype+variability+of+Yersinia+ruckeri+isolated+from+farmed+fish+in+France.">Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France.</a> Veterinary Research. 46, 73 (2015).</li><li>Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+sequence+typing+reveals+high+genetic+diversity+and+epidemic+population+structure+for+the+fish+pathogen+Yersinia+ruckeri.">Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri.</a> Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).</li><li>Wheeler, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+ruckeri+biotype+2+isolates+from+mainland+Europe+and+the+UK+likely+represent+different+clonal+groups.">Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).</li><li>Eyre, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multilocus+variable-number+tandem-repeat+analysis+and+whole-genome+sequencing+for+investigation+of+Clostridium+difficile+transmission.">Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).</li><li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Locus+Variable-Number+Tandem-Repeat+and+Single-Nucleotide+Polymorphism-Based+Brucella+Typing+Reveals+Multiple+Lineages+in+Brucella+melitensis+Currently+Endemic+in+China.">Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China.</a> Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).</li><li>Bouchouicha, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+performances+of+MLVA+vs.+the+main+other+typing+techniques+for+Bartonella+henselae.">Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae.</a> Clinical Microbiology and Infection. 15, 104-105 (2009).</li><li>Dahyot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-Locus+Variable+Number+Tandem+Repeat+Analysis+(MLVA)+and+Tandem+Repeat+Sequence+Typing+(TRST),+helpful+tools+for+subtyping+Staphylococcus+lugdunensis.">Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis.</a> Scientific Reports. 8 (1), (2018).</li><li>Elberse, K. E. M., Nunes, S., S&#225;-Le&#227;o, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-locus+variable+number+tandem+repeat+analysis+for+Streptococcus+pneumoniae:+Comparison+with+PFGE+and+MLST.">Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST.</a> PLoS ONE. 6 (5), (2011).</li><li>Matejusova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable-number+tandem-repeat+genotyping+of+Renibacterium+salmoninarum,+a+bacterium+causing+bacterial+kidney+disease+in+salmonid+fish.">Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish.</a> BMC microbiology. 13, 285 (2013).</li><li>Duodu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+multiple-locus+variable-number+of+tandem+repeat+analysis+(MLVA)+for+the+fish+pathogen+Francisella+noatunensis+using+capillary+electrophoresis.">An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis.</a> BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).</li><li>Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., S&#248;rum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable+number+tandem+repeat+analysis+of+Edwardsiella+piscicida+isolates+pathogenic+to+fish.">Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish.</a> Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).</li><li>Gulla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilocus+variable-number+tandem-repeat+analysis+of+Yersinia+ruckeri+confirms+the+existence+of+host+specificity,+geographic+endemism,+and+anthropogenic+dissemination+of+virulent+clones.">Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).</li><li>Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cautionary+tale:+Lack+of+consistency+in+allele+sizes+between+two+laboratories+for+a+published+multilocus+microsatellite+typing+system.">A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).</li><li>Lista, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+Bacillus+anthracis+strains+based+on+automated+capillary+25-loci+multiple+locus+variable-number+tandem+repeats+analysis.">Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis.</a> BMC Microbiology. 6, 33 (2006).</li><li>. Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf</a> (2014)</li></ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Burada sunulan hem Multiplex PCRs yoksul şablon DNA kalitesi karşısında nispeten sağlam göründü, ancak PCR amplifikasyon eksikliği yine de zaman zaman son derece yüksek DNA konsantrasyonları ile şablonlar kullanırken gözlenen. Bu sorunlar, PCR öncesinde şablonları seyreltilerek kolayca çözülmüştür. Burada çalışan biri daha DNA ekstraksiyon için diğer yöntemler de kullanılabilir (örneğin, ticari kitleri).
Her bir Multiplex PCR reaksiyonundan beş amplikonlar bekleniyor rağmen, beş görsel olarak ayırt bantları her zaman Ge beklenen olmamalıdır, bazı (farklı etiketli) aynı reaksiyon içinde VNTR loci çakışan boyut aralıkları vardır. 60 min son PCR uzatma süresi gerekirse kısaltılabilir, ancak muhtemelen sonraki CE elektrophergramında bölünmüş doruklara sonuçlanan artışa neden olacaktır (aşağıya bakın). Özellikle, GE adımının amacı, PCR amplicons nitel doğrulama için tamamen olduğu gibi, çalışma süresi, voltaj ve/veya jel tarifi tercih edilebilir olarak ayarlanabilir. Özellikle zayıf bantlar GE tarafından gözlemlenirse, CE 'den önce bu numunelerin seyreltme faktörünü azaltmanız tavsiye edilebilir.
Burada açıklanan CE Protokolü belirli bir ticari kapiller Elektroforez aparatı üzerinde çalıştırılırken ( malzeme tablosunabakın), farklı CE sistemleri farklı örnek gereksinimlere sahip olabilir, bu da protokole bazı değişiklikler isteyebilir . Parça analizi için uygun reaktifler/ekipmanlar, kalibrasyon vb. yönergeleri için ilgili CE sistemi üreticisinin kılavuzuna bakın. Ayrıca, CE sırasında gözlenen önyargılı amplikon hareketlilik desenlerinin, CE sistemleri ve/veya makinelerde daha önce diğer mlva protokolleri için belgelendiği gibi, göreceli olarak farklılık göstermesi olasılığı vardır15,16. Burada son (yuvarlatılmış) VNTR yineleme sayar etkilenen bir ölçüde oluşsa, bu Locus özgü değişkenler anlamına gelir s ve ı (Tablo 1), VNTR yineleme sayar belirlemek için kullanılan yeniden kalibre edilmelidir. Bu, GULLA ve al. 2018 tarafından açıklandığı gibi, doğru sıra boyutlarını CE boyutu çağrılarına karşı karşılaştırarak grafiklerde doğrusalregresyon içerir.
Bölünmüş zirveler ve kekeme zirveleri, CE tabanlı MLVA yazarak17, hem tanınmış eserler, boyut arama sırasında elektrophergramlar görülebilir (Şekil 4). Kekeme zirveleri gözardı edilirken, tek bir temel çifti ile ayrılan bölünmüş zirveler durumunda uzun zirve sürekli olarak aşağı akım uygulamaları için seçilmelidir. Dahası, belirli VNTR loci eksikliği gösteren yok zirveler nadirdir, ancak ortaya çıkabilir, bu durumda ' 0 ' bir yineleme sayısı atanmalıdır. DNA ayıklandığı başlangıç kültürü saf değilse (yani, birden fazla Y. ruckeri Sub-Type içerir), aynı Locus/loci farklı allaklarına karşılık gelen birden fazla uzun DORUKLARDA CE izlenebilir. Daha sonra yeniden yazarak yeni DNA ekstraksiyonu öncesinde tek kolonilerden ikincil yetiştirmeler yapılmalıdır.
Protokolde belirtildiği gibi, PCR için şablon DNA 'Sı, varsayılan olarak Y. ruckeri'nin saf kültürlerinden çıkarılır. Ancak, birkaç olguda, Y. ruckeri Için qPCR (CT-değerler < 27) pozitif test edilen yumurta sıvısı numuneleri, önceden kültür olmaksızın, daha yüksek miktarda genomik DNA (ticari kit ile ayıklanan) ile şablon olarak doğrudan yazılı olarak mlva ile başarıyla yazıldı. Bu yaklaşım kapsamlı bir şekilde test edilmemiş ya da doğrulanmamış olsa da, Y. ruckeriek olarak farklı organizmaların BIR dizi DNA içeren karmaşık biyolojik Matrislerin incelenmesi IÇIN bu mlva tahlil potansiyelini gösterir.
Burada sunulan tüm MLVA yazma prosedürü, DNA Ekstraksiyonunda epizootiolojik değerlendirmeye kadar, tek bir çalışma gününde tamamlanabilir. Ancak, incelenen numunelerin sayısı DNA ekstraksiyon, PCR ve CE için gerekli olan zaman ile bir alt ilişkidir ve bu nedenle birden fazla numune aynı anda çalışırken çok daha verimli bir yöntemdir. Bu yine de çoğu laboratuar tabanlı yöntemler için durumda, ve Y. ruckeriepidemiyolojik alt yazma için bir araç olarak, yüksek çözünürlüklü kombinasyonu, basitlik ve taşınabilirlik bu mlva tahlil daha önce yayımlanan protokolleri üstün yapar4 ,5. Ayrıca Y. ruckeri Serotiplendirme faydalı olmasında14' ün sınırlı epidemiyolojik alaka doğrulamak için kullanılmıştır.
Kapsamlı bir mlva tabanlı nüfus çalışma 484 Y. ruckeri ısolates içeren bir dizi zamanmekansal kökenleri ve habitatlar (ana balık, çevre, vb), bizim anlayış epizootiology ve nüfus ile ilgili kurtarılan aracılığıyla Bu önemli balık patojen yapısı büyük ölçüde arttı14. MLVA yazarak klonların takibine, onlarca yıldır antropojenik olarak yayılan, muhtemelen balıkların taşınması ve yerel olarak sınırlı suşların tanımlanması etkinleşir. Dahası, bakterinin bazı klonal kompleksleri açıkça özellikle balık konaklarında (gökkuşağı alabalıkları ve Atlantik somon, sırasıyla) hastalığı ile ilişkili olabilir, diğerleri sadece çevresel kaynaklardan ve/veya klinik olarak etkilenmez balık kurtarıldı Örnek. Yöntemin uygulanabilirliği, böylece sadece enfeksiyon izleme ile sınırlı değildir, aynı zamanda aşı gelişimi, risk değerlendirmesi ve ulusal Biyogüvenlik bakımı gibi potansiyel alaka bilgileri de sağlayabilir. Şu anda Norveçli veteriner Enstitüsü 'nde, Norveç su ürünleri alanında Y. ruckeri tanımları araştırma aracı olarak aktif kullanımda.

Yersinia ruckeri, bir gram-negatif bakteri ve Yersiniaceae ailesinin üyesi, dünya çapında salmonid balıkların yersiniosis neden1. Bu kolayca agar medya birçok türleri üzerinde ekimi tarafından enfekte balık tanısı, ama yakın zamana kadar, küçük nüfus yapısı ve Y. ruckeri epizootiology dünya çapında ve farklı habitatları (ev sahibi türler, vb) ile ilgili bilinmektedir. Y. ruckeri için mevcut Serotiplendirme faydalı olmasında sistemleri tutarsız, karşılıklı uyumluluk eksikliği ve düşük epidemiyolojik çözünürlük sunar. Bakteri üzerinde bazı Moleküler çalışmalar yapılmıştır, çok yönlü sıralı yazma (mlst), pulsed-Field jel elektroforez (PFGE) veya tüm genom dizisi (WGS) analizi2,3,4 gibi teknikler istihdam edilmiştir ,5. Ancak, MLST rutin enfeksiyon izleme için yeterince yüksek bir çözünürlük sağlamaz, PFGE işçilik talep ederken ve laboratuvarlar arasında kolaylıkla taşınabilir olmayan sonuçlar üretir. WGS Analizi yakın bir nihai çözünürlük sağlamak olsa da, kurulması ve bu tür analizler uygulanması ön koşul teknik ve Biyoinformatik yetenekleri henüz laboratuvarların nispeten az sayıda sınırlı kalır.
Multi-Locus değişken sayı tandem-Repeat Analizi (mlva), bazı durumlarda neredeyse WGS Analizi6,7ile eşleşen bir genetik çözünürlük sunan basit ve kolayca erişilebilen bir moleküler yazma aracını temsil eder. Teknik, seçilen değişken sayı tandem-REPEAT (VNTR) loci 'de tekrarlanan sayı varyasyonunu temel alarak, yüksek derecede taşınabilir olan çıkış verileriyle sonuçlanan, profilli yalıtılmaları çevrimiçi veritabanlarına ve laboratuvarlar arasında basit bir şekilde karşılaştırmayı yapıyor. Mlst, birçok bakteriyel patojenlerin epidemiyolojik yazımı için altın standardını sürdürmesine rağmen, artan sayıda çalışma mlva8,9,10' ın önemli ölçüde daha yüksek bir ayrımcılık gücünü tanımlar. Çeşitli protokoller de, Francella noatunensis, Edwardsiella sicicida ve renibacterium salmoninarum11,12gibi balık-patojenik bakterilerin hedefleme yayımlandı 13olmak üzere.
Burada sunulan on-loci MLVA protokolü, son zamanlarda geniş bir Y. ruckeri nüfus çalışması14için temel oluşturdu, agar-yetiştirilmiş koloniler, Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez (CE) DNA ekstraksiyonu içerir, silico uygulamalarında aşağı aşağı takip. İncelenen her bir izole için, her ikisi de her biri VNTR bölgelerini hedefleyen beş floresan etiketli astar çifti (6FAM, NED veya VıC) içeren iki Multiplex PCRs, aynı koşullarda paralel olarak çalıştırılır. Jel elektroforezi (GE) ile PCR amplikonlar doğrulamasının ardından, PCR ürünleri CE analizinden önce seyreltilir ve ilgili VNTR loci temsil eden zirveler elde edilen elektropherogram dosyalarından boyut olarak adlandırılır. Küçük, sıra özgü tutarsızlıkları CE göç desenleri için hesap Locus özgü formüller ile birlikte, VNTR CE boyutu çağrıları sonra on basamaklı MLVA profillerine birleştirilmiş VNTR yineleme sayar hesaplamak için kullanılır. Bunlar, epizootiological değerlendirmeler için giriş olarak kullanılır (örneğin, en az yayılma ağacı (MST) diyagramlarında küme çözümlemesi tarafından).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >22&#176;C/15&#176;C incubator</td>
			<td >As preferred.</td>
			<td >NA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5&#39; Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>450007</td>
			<td>Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agarose, universal, peqGOLD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789P/732-2788</td>
			<td>Used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avant 3500xL Genetic Analyzer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A30469</td>
			<td>Used for capillary electrophoresis fragment analysis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BioNumerics7 modules</td>
			<td>Applied Maths</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge(s)</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15612</td>
			<td>Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Loading dye used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Centrifuge tubes used during DNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freezer</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fume cupboard</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel electrophoresis system</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneMapper Software 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4475073</td>
			<td>Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0373</td>
			<td>DNA ladder used during gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4408399</td>
			<td>Size standard used during capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311320/4440753</td>
			<td>Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Milli-Q water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multiplex PCR&#160;Plus&#160;Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>206151/206152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR thermal cycler</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A26077/4393713/4393709</td>
			<td>Separation matrix used during capillary electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pure culture Yersinia ruckeri</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>E.g. cryopreserved or fresh.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>NA</td>
			<td>In: Multiplex PCR&#160;Plus&#160;Kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-borate-EDTA (TBE)&#160; buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsine soy agar/bovine blood agar</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard recipe; produced in-house.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-based gel imaging/visualisation system</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortexer</td>
			<td>As preferred.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-locus variable-number tandem-repeat analysis of the fish-pathogenic bacterium yersinia ruckeri by multiplex pcr and capillary electrophoresis

Yersinia ruckeri , dünya çapındaki çiftlik salmonidlerin önemli bir patojen olduğunu, ancak bu bakterinin epizootiolojik araştırmalar (enfeksiyon izleme, vb.) için uygun basit araçlar eksik. Bir multi-Locus değişken-sayı tandem-Repeat Analizi (MLVA) tahlil bu nedenle kurtarılmış izolatlar yüksek çözünürlüklü Genotipleme için kolay erişilebilir ve belirsiz bir araç olarak geliştirilmiştir. Mlva tahlil için burada sunulan, DNA su içinde bakteri hücreleri kaynatma tarafından kültürlü Y. ruckeri örneklerden ayıklanır, PCR için şablon olarak süpernatant kullanımı izledi. Primer-çiftleri hedefleyen on değişken sayı tandem-REPEAT (VNTR) loci, Y. ruckeri genom boyunca serpiştirilmiş, aynı Bisiklet koşullarında çalışan 2 5-Plex PCR reaksiyonlar arasında eşit olarak dağıtılır. İleri astar üç floresan boya ile etiketlenmiş. Jel elektroforezi ile amplikon onayı takiben, PCR ürünleri seyreltilir ve kapiller elektroforezine maruz kalmaktadır. Elde edilen elektropherogram profillerinden, her VNTR loci temsil zirveleri boyutu denilen ve Silico içinde VNTR tekrarlama sayıları hesaplamak için istihdam. Sonuç olarak on haneli MLVA profilleri daha sonra küme analizi ile epizootiological değerlendirme sağlayan en az yayılan ağaçlar oluşturmak için kullanılır. Sayısal MLVA profilleri şeklinde son derece taşınabilir çıkış verileri, laboratuvarlar arasında hızla karşılaştırılabilir ve bir uzayotemporal bağlamda yerleştirilir. Kültürlü koloniden epizootiolojik değerlendirmeye kadar tüm prosedür, tek bir çalışma günü içinde 48 Y. ruckeri ısolates için tamamlanabilir.

Burada açıklandığı gibi Multiplex PCR takipte, her PCR reaksiyonunda birden fazla amplikonlar varlığını doğrulayan tipik bir GE görüntüsü Şekil 1' de gösterilir. Doğrulanmış PCR ürünlerinde gerçekleştirilen downstream CE parçası analizi, her bir Y. ruckeri için incelendiğinde, ılgılı VNTR loci 'nin boyutu çağrılması için kullanılan iki elektropherogram dosya ile sonuçlanır (Şekil 2). 484 farklı Y. ruckeri izolatlar analizinden, aynı Multiplex reaksiyon (Tablo 1)14aynı boya ile etiketlenmiş VNTR loci arasında amplikon boyutu aralığında örtüşme görülmemiştir. Elektroforetik doruklarına her biri, bu nedenle, belirsizliğe göre renk tarafından tespit edilebilir.
MLVA profillerini ve ilgili meta verileri tercih edilen yazılımlara aktarmayı takiben, MST diyagramları, materyaldeki herhangi bir epidemiyolojik desenin incelenmesi için açıklandığı şekilde inşa edilebilir. İlgili yazılımda kullanılabilen ek seçenekler için uygun kılavuzları inceleyin. Örnek olarak, Şekil 3 , Norveç 'te beş farklı somon çiftliği ile ilişkili balıklardan kurtarılan Y. ruckeri ısolates için MLVA profillerinin MST tarafından karşılaştırılması gösterir.
On VNTR loci 'nin yanı sıra in vitro ve in vivo istikrarı ile tutarlı tekrarlama boyutları, bu protokol14' e dayanan orijinal çalışmada önceden doğrulanmıştır. Kısaca, bu Sanger sıralama (tekrarlama boyutu) kullanılarak yapıldı, ve MLVA birden fazla izolat yazarak seri pasajlar aşağıdaki (in vitro) ve bireysel Hastalık salgınlar (in vivo) içinde. Dahası, zaman içinde loci çevre istikrarı birden fazla ' ev strain ' ısolates Atlantik somon için ısrarla enfekte tatlısu üretim sitelerinden birkaç yıl içinde kurtarılan yazarak incelendi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig1.jpg"> Şekil 1 : Çoklu PCR ürünlerinin varlığını doğrulayan jel elektroforez. Görüntü, örnek içeren 12 şeritte birden çok PCR amplikonlar varlığını teyit, kullanılan DNA merdiven temsil eden ilk şerit ile. Seçilen merdiven parçalarının boyutları, PCR tahlil ve strain (GULLA ve ark. 201814) her şeritte bağlı tablo S1 bakın olarak, belirtilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig2.jpg"> Şekil 2 : VNTR ampliconlara karşılık gelen zirveleri gösteren Elektrophergramlar. Farklı VNTR loci isimleri, boya etiketleri ile belirtilir (VıC = yeşil; NED = siyah; 6FAM = mavi) parantez içinde. İki elektropherogram (PCR tahlil 1 üst; PCR tahlil 2 alt) tek bir Y. ruckeri izole yazarak kaynaklanmaktadır. Turuncu doruklarına (boya LIZ) standart istihdam boyutu temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig3.jpg"> Şekil 3 : Örnek epidemiyolojik değerlendirme Için en az yayılan ağaç. Diyagram, Y. ruckeri ısolates 'den mlva profillerine dayanır ve beş farklı Norveç çiftliklerinde (1-5; Legend) tekrarlanan yerisniosis salgınlarını yaşayan Atlantik somon 'dan kurtarıldı. Çiftlik kökeni ile bağlantılı açık bir kümeleme eğilimi gözlenebilir. Crosslinks ≤ 1/10 aynı olmayan VNTR loci (bkz. gösterge) içeren tüm olası bağlantıları gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59455/59455fig4.jpg"> Şekil 4 : Elektropherogram kekeme ve bölünmüş doruklarına görselleştirin. Bu durumda, her iki aynı anda oluşur, her zaman durum değildir. Uzun ve uzun boylu zirve, YR1070 VNTR Locus temsil eden, kolayca ayırt edilebilir. Ekran büyütülmüş ve sadece mavi boya zirveleri gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59455/59455fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59455/59455table1.jpg"> Tablo 1: VNTR Locus özellikleri. Mevcut MLVA protokolünde hedeflenen on Y. ruckeri VNTR bölgelerinin ilgili özellikleri.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis at JoVE.co

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-Locus değişken-sayı tandem-Repeat analiz (MLVA) tahlil burada sunulan ucuz, sağlam ve taşınabilir yüksek çözünürlüklü balık-patojen bakteri Yersinia ruckeriGenotipleme sağlar. Saf kültürlerden başlayarak, tahlil düşük uygulamalar için on-loci MLVA profilleri üretmek için Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez istihdam.

Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez tarafından çok-Locus değişken-sayı tandem-balık tekrar Analizi-patojen Bakterium Yersinia ruckeri

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Bu MLB genotileme protokolü, uluslararası öneme sahip bir balık patojenik bakterisi olan Yersinia ruckeri'nin epidemiyolojisi ve küresel nüfus yapısı anlayışımızı büyük ölçüde artırmıştır. Daha önce kurulmuş Yersinia ruckeri yazma şemaları ile karşılaştırıldığında, çok yüksek bir gerinim çözünürlüğü sunar. Prosedür basit, ucuz ve kolayca laboratuvarlar arasında karşılaştırılabilir taşınabilir sonuçlar verir.Bu teknik tanısal özgüllüğü büyük ölçüde artırır ve enfeksiyon takibini sağlar. Örneğin, artık sık sık öldürücü Olmayan çevresel suşları fon karşı mevcut öldürücü Yersinia ruckeri klonları ayırt edebilirsiniz. Prosedürü gösteren Saima Nasrin Mohammad, bizim laboratuvarda bir teknisyen olacaktır.Başlamak için, Petri yemekleri üzerinde herhangi bir uygun agar türü üzerinde Yersinia ruckeri saf kültürleri ekmek için steril aşılama döngüleri kullanın. 22 derecede 1-2 gün veya 15 santigrat derece 3-4 gün kuluçka. Bundan sonra, aşılama döngüleri kullanarak, her Petri kabından tek bir temsili koloni seçin ve 50 mikrolitre ultra saf su içeren 1,5 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın.Girdap kısa bir süre ve 100 santigrat derece bir ısıtma bloğu üzerinde yedi dakika kuluçka. Daha sonra, üç dakika için 16, 000 g santrifüj ve dikkatle boş 1.5 mililitrelik santrifüj tüpler içine supernatant şablon DNA aktarmak için bir pipet kullanın. Bir sonraki adıma geçin veya DNA'yı 20 santigrat derecede saklayın.Ana karışımları hazırlamak için, önce analiz edilecek bakteri örneklerinin sayısına göre reaktif hacimleri hesaplayın, ayrıca bir negatif ve bir pozitif kontrol ve son %10 fazla hacmi, el yazmasında ayrıntılı olarak hesaplayın. Farklı astar konsantrasyonları kullanıldığını unutmayın. İki ayrı santrifüj tüpünde, PCR teşpin başına bir adet, multipleks PCR artı ana karışım, astar ve RNase içermeyen su ekleyin.Girdap hazırlanan ana düşük hızda yavaşça karıştırır ve sonra, pcr şeritler veya plakalar üzerinde ayrı ayrı kuyular içine ayrı ayrı her ana karışımı 22 mikrolitre dağıtmak. Daha sonra, her iyi ana karışım içeren her hazırlanan DNA şablonu üç mikrolitre ekleyin;bakteri örnek başına iki kuyu, her bir test için bir. Pozitif kontrol için doğrulanmış yersinia ruckeri sudan DNA ve negatif kontrol için ultra saf su kullanın.Mühür ve santrifüj kısaca. Hazırlanan reaksiyonları bir PCR termik çevrimciye yükleyin ve programı el yazmasına göre ayarlayın. Program üç saatten kısa bir süre içinde tamamlanacak.Üreticinin önerilerine göre, bir kez TBE tampon agarose jel tozu ekleyin 1.5 ağırlık / hacim yüzdesi ve ısı çözmek için. Döküm den önce, çözünmüş jel çözeltisini akan suyun altında kısa bir süre soğutun, 50 mikrolitre jel çözeltisi ve karışımı başına 5 mikrolitre floresan nükleik asit boyası ekleyin. Döküm tepsisini birleştirin ve seviyeleyin.Örnek sayısına uygun konileri ekleyin. Döküm içine jel çözeltisi dökün ve katılaşmak için bekleyin. Bundan sonra, bir jel elektroforez sisteminde bir kez TBE tampon jel içeren döküm batırın.Beş mikrolitre PCR ürününün yeni PCR şeritlerinde iki mikrolitre yükleme boyasıyla karıştırın. Karışımların beş mikrolitresini jeldeki kuyulara aktarın. En az bir kuyu boş kaydedin.Referans için boş kuyuya beş mikrolitre DNA merdiveni ekleyin. Elektrotları takın ve jeli yaklaşık bir saat boyunca 15 santimetrede 110 volta çalıştırın. PRC amplicons temsil eden birden fazla bantvarlığını doğrulamak için uv tabanlı jel görüntüleme sistemi kullanın.PCR amperatörlerinin onaylanmasının ardından, PCR ürünlerini 1 ila 10 arasında saf suda seyreltmek için yeni PCR şeritleri veya plakaları kullanın. Girdap ve santrifüj kısaca. Bir duman dolap çalışırken, formamid ve referans boyutu standart çözüm oluşan bir santrifüj tüp bir ana karışımı hazırlamak.Analiz edilecek PCR ürün sayısına göre, el yazmasında ayrıntılı olarak reaktif hacimleri kullanın. %10 fazla hacim bekleyin. Girdap kısaca ve mevcut kılcal elektroforez sistemi için uygun bir PCR plaka üzerinde bireysel kuyular içine 9.5 mikrolitre dağıtmak.Ardından, seyreltilmiş PCR ürün 0,5 mikrolitre ekleyin. Mühür ve santrifüj kısaca. Daha sonra, numuneleri içeren plakayı bir PCR termik atöre yükleyin ve numuneleri süresiz olarak dört santigrat dereceye kadar soğutmadan önce üç dakika boyunca 95 derecede denatüre edin.Bir dakika için 1000 g santrifüj, dikkatle mühür kaldırmak ve üreticinin talimatlarına göre kalibre kılcal elektroforez sistemi üzerine plaka yükleyin. Parça analizi kılcal elektroforez çalıştırın, tercih edilen cihaz için uygun reaktifler kullanarak, ve el yazması açıklamaya göre çalışma koşullarını ayarlayın. Yersinia ruckeri VNTR kılcal elektroforez boyutu arama için, ilk ithalat kapiller elektroforez gen Mapper 5 yazılımı içine dosyaları ithalat.Analiz yöntemini microsatellite Default olarak ayarlayın, boyut standardı altında uygun ürün seçimini seçin ve ardından Analiz düğmesine basın. Boyut eşleme düzenleyicisi aracılığıyla, boyut standart parçalarının doğru tanımlamasını doğrulayın ve görünür de olsa hatalı ayırmaları düzeltin. Ardından, okunacak örneği seçin, ÇizimI Görüntüle düğmesine basın ve boyutlandırma tablosunun görünümünü etkinleştirmek için A'yı Denetle düğmesine basın.Üst paneldeyken, VNTR amperonlarını temsil eden beş tepeye tıklarken Denetimi basılı tutun. Yalnızca vurgulanan beş tepenoktasının özelliklerini gösteren boyutlandırma tablosunu filtrelemek ve her VNTR locusunun downstream uygulaması için boyut çağrılarını kaydetmek için G'ye basın. Kapiller elektroforez sırasında önyargılı amplikon hareketlilik paternlerini hesaba katmak için, elde edilen boyut çağrılarını locusa özgü değişkenlerle birlikte çalıştırarak doğru VNTR tekrar sayılarını hesaplayın.Formül, otomasyon için bir elektronik tablo şablonu içinde uygulanabilir. Elektronik tabloda, yuvarlak hesaplanan VNRT yineleme, akış aşağı çözümlemesi öncesinde en yakın toplamda sayılır. BioNumerics yazılımında, yeni bir veritabanı oluşturun ve MLVA eklentisini etkinleştirmeyi tercih edin.Deneme türü panelinde, yeni deneme türü oluştur'a, Karakter türünü seçin ve sorulduğunda varsayılan ayarları kullanın' tuşuna basın. Ardından yeni denemeyi seçin ve değer aralığı olarak sıfırdan 100'e kadar kullanan 10 VNTR loci'nin her biri için yeni karakterler ekleyin. Ana panelde, alma alanları ve karakterleri seçerek Yersinia ruckeri VNTR yineleme sayımları ve yöntem verilerini aktarın.Bunun depolandığı dosyayı bulun ve Hedef türü sütununda seçim yapın. VNTR'ler için bu, uygun karakter değerini seçmek anlamına gelirken, çeşitli meta veriler giriş bilgileri alanları olarak sınıflandırılır. Yapılan seçimler, işlemi daha sonra kolaylaştırmak için şablon olarak depolanabilir.MST küme çözümlemesi için ayrılan içe aktarılan örnekleri seçin ve karşılaştırmalar panelinde yeni karşılaştırma oluştur düğmesini tıklatın. MST'nin görsel sunumu için istenirse, örnekleri belirli bir meta veri özelliğine göre renkli gruplara ayırın. Ardından, seçilen örnekleri temel alan bir MST diyagramı oluşturmak için kategorik veriler için Gelişmiş küme çözümlemesi ve MST'yi seçin.Bölüm parametreleri, çapraz uzunluklar, düğüm dal etiketleme, vb ekleyerek MST görsel sunum değiştirin. Gerekirse, Sonsınıf görüntü seçimini kullanarak sonlanan MST'yi istenilen biçimde dışa aktarın. Multipleks PCR'den sonra jel elektroforez görüntüsü, örnek içeren 12 şeridin tümlerinde birden fazla amplikonrun varlığını doğrular ve ilk şerit kullanılan DNA merdivenini temsil eder.Kapiller elektroforezden kaynaklanan elektroferogramlarda farklı VNTR loci boyut ve boya etiketleme kombinasyonuna göre tanımlanabilir. Turuncu zirveler kullanılan boyut standardını temsil eder. Yersinia Ruckeri'nin MLVA profillerine dayanan örnek bir minimum yayılan ağaç, beş farklı Norveç çiftliğinde Atlantik somonundan çıkarılan izole edici ler gösterilmiştir.Çiftlik kökenine bağlı açık bir kümelenme eğilimi görülebilir. Farklı Yersinia ruckeri klonları mlva tarafından belirlenmesi hakim, örneğin, balık türlerinin özellikle coğrafi bölgelerde, zaten bu patojene karşı aşılama stratejileri geliştirmek için istismar edilmiştir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Dönüşüm, Genom Düzenleme ve Fenotipleme Azot sabitleme Tropikal Cannabaceae Ağaç Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Dairesel bir RT-PCR tabanlı strateji kullanarak Maize mitochondrion 'da primer ve Işlenmiş transkriptlerin ayrımcılık ve haritalama

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Akut Miyeloid Lösemi Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Ribonükleoprotein ile RUNX1 Intronic Susturucunun Transkripsiyonel Rolünün İncelendirin

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

İplik Spesifik RT-PCR ile Hastalarda İnsan İmmün Yetmezlik Virüs Tip 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transkriptlerinin Saptanması

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

RNA-Seq Analizi ile İnsan Primer Keratinositlerin In Vitro Farklılaşmasının Karakterizasyonu

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...