Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

ج. س. تلقي "المنح الدراسية العليا في أونتاريو". W.I. تلقت "زمالة محقق جديد" من كندا "بحوث الصحة العقلية". ويدعم هذا العمل العاملة المنح إلى W.I من العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الكندي الهندسية (06106-2015 رجبين) والمعهد الكندي "البحوث الصحية" (PJT 148707).

جميع التجارب على الحيوانات تقرها "اللجنة العناية بالحيوان" لجامعة ويسترن أونتاريو وفقا "المجلس الكندي لإرشادات العناية بالحيوان" (سياسة الاستخدام المقبول #2014-031).
1-الحلول
<ol><li>
تشريح الحل
	<ol>
<li>الرجوع إلى الجدول 1 لتكوين الحل تشريح.</li>
		<li>إعداد حل أسهم 20 x م?...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

واحد شرط هام لتجربة الكهربية المشبك تصحيح ناجح هو الحصول على شرائح/الخلايا السليمة. لدينا بروتوكول وصف هو الأمثل لطائي الشرائح التي تحتوي على الخلايا العصبية التشفيير. الدماغ الأخرى مجالات قد تتطلب تعديل الحلول و تشريح أساليب21،،،من2223<sup...

انتقال متشابك هو إليه أساسية للتواصل بين الخلايا العصبية والمخ وبالتالي الدالة. أيضا انتقال متشابك مجا ويمكن تغيير فعاليته بطريقة تعتمد على النشاط، وكذلك كما هو الحال في استجابة لإشارات مودولاتوري1. وهكذا، تم دراسة الدالة متشابك نقطة تركيز رئيسية لأبحاث علم الأعصاب. تصحيح كامل الخلية الكهربية المشبك هو تقنية متعددة الاستخدامات التي تمكننا من فهم، بوضع تصاميم تجريبية وتحليلات البيانات، الآليات الفيزيائية-الحيوية والجزيئية متعمقة لانتقال متشابك. اتباع نهج استخداماً، ربما نظراً لبساطة الأسلوب والمفهوم، هو قياس التيارات بوستسينابتيك ضادات/المثبطة مصغرة (لي/إيبسكس) تحت الجهد المشبك التكوين2،3، 4 , 5 , 6-مبسكس الفردية تمثل تدفق الأيونات من خلال مستقبلات إيونوتروبيك بوستسينابتيك (مثل مستقبلات امبا وغاباA ) ردا على ربط بهم العصبية منهم أطلق سراحهم من محطة بريسينابتيك 7 . لأنه يتم الحصول على التسجيل حضور الجهد عن طريق بوابة نا+ قناة مانع تيدرودوتاكسين (TTX)، الإفراج عن إمكانات العمل المستقل وينطوي عادة على حويصلة متشابك واحد يحتوي على الناقل العصبي. وبناء على هذا الافتراض، متوسط السعة من مبسكس يستخدم على نطاق واسع تقديراً تقريبيا لحجم كانتال، التي تمثل عدد ووظيفة مستقبلات بوستسينابتيك معارضة موقع إطلاق سراح واحد. من ناحية أخرى، يعتبر تواتر مبسكس وتمثل مزيجاً من مجموع عدد من الاشتباكات العصبية التي تنتهي إلى الخلية بوستسينابتيك واحتمال الإفراج عن المتوسط. ومع ذلك، لا تقيس هذه المعلمات مولتيبليكاتيفيتي متغير آخر الاشتباكات العصبية، أو تعدد متشابك – هو أمر مهم لفعالية انتقال متشابك.
استناداً إلى نظرية انتقال متشابك7،،من89قوانتال، قوة اتصال معينة بين زوج من الخلايا العصبية تعتمد على ثلاثة عوامل: عدد الاشتباكات العصبية الوظيفية (N)، بوستسينابتيك ردا على إطلاق سراح حويصلة متشابك مفردة (حجم قوانتال؛ Q) واحتمال إطلاق سراح العصبي (Pr). تعدد متشابك يساوي N. تطوير تعدد متشابك أو تشذيب نهايات المضاعف من البلاستيك في التنمية وفي المرض مختلف الدول3،4،،من610. لهذا السبب، فقد وصف تعدد متشابك آثار هامة لفهم مدى فعالية انتقال متشابك في الصحة والمرض. يمكن تحديد التقنيات، مثل الميكروسكوب الإلكتروني أدلة الهيكلية لتعدد متشابك بالكشف عن عدة جهات اتصال متشابك منشؤها إكسون نفس على نفس العصبية بوستسينابتيك11،12، 13،14. ومع ذلك، يمكن هذه مولتيسينابسيس هيكلياً المحددة وظيفيا صامت15،16. يتطلب دراسة دقيقة الوظيفية N تحديا من الناحية التقنية النهج الكهربية، مثل التسجيلات كامل الخلية المزدوجة التي يمكن تحديد ما إذا كان اتصال معين لمواقع إطلاق سراح وظيفية متعددة والحد الأدنى النهج التحفيز التي تهدف إلى توظيف إكسون المفترضة مفردة.
في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة بسيطة لتقدير تعدد متشابك باعتماد أسلوب وضعت أصلاً من قبل حاسبات وآخرون2. هذا الأسلوب ينطوي على قياس عفوية PSCs (سبسكس) ومبسكس باستخدام التصحيح كامل الخلية المشبك الكهربية، مما يسمح لنا بتقدير درجة تعدد متشابك عبر جميع المدخلات إلى خلية معينة.  كما يعكس تعدد المعرفة مسبقاً، ومتشابك عدد نقاط الاشتباك العصبي بين خلية معينة قبل وبوستسينابتيك. إذا نهايات متعددة جندهم بإمكانيات العمل في التزامن، سيكون هناك احتمال كبير للجمع الزماني الفردية الأمنية الخاصة (أي كانتال)، توليد سعة أكبر من PSC.  في تسجيلات مبسك منخفض (في إمكانات العمل التي يتم حظرها بواسطة تتكس)، احتمال الجمع الزماني للفرد مبسكس (غير متزامن). باستخدام هذا المنطق، يمكن تقدير تعدد متشابك بمقارنة السعة sPSC (مع إمكانية العمل تعتمد على الإصدار) إلى السعة مبسك.
لفحص وجود تعدد يصف لنا أربع تجارب وتحليلاتها باستخدام ابسكس جلوتاماتيرجيك على سبيل مثال. ومع ذلك، يمكن استخدام نفس النهج للصيام انتقال جابايرجيك/جليسينيرجيك (إيبسكس). يرد أدناه وصف موجز الأساس منطقي لكل تجربة. أولاً، وكما هو موضح أعلاه، يمكن تقدير تعدد متشابك بمقارنة سعة سيبسكس إلى ميبسكس. هناك شرطين لهذا النهج؛ محاور عصبية 1) presynaptic يجب إطلاق النار عددا كافياً من إمكانات العمل أثناء التسجيل، و 2) Pr يجب أن تكون عالية حتى الإفراج عن عدة نقاط الاشتباك العصبي العصبي عند وصول بإمكانيات العمل. ولتلبية هذه المتطلبات، سيبسكس هي سجلت أول في انخفاض Ca2 + الاصطناعية النخاعي (قام)، وثم تسجيل حضور تركيز منخفض من خصم قناة ك+ ، 4-أمينوبيريديني (4-AP) لزيادة العمل إطلاق النار المحتملة و Pr. ثم حظر إمكانات عمل إطلاق النار من قبل ت وانخفض بمقدار الجهد عن طريق بوابة Ca2 + قناة مانع Cd2 +للعلاقات العامة. مقارنة السعة سيبسكس (مع 4AP) إلى ميبسك (مع 4AP، تتكس، ومؤتمر نزع السلاح2 +). في التجربة الثانية، Ca2 + محله اكويمولار ريال2 + في قام لﻻستخدام الإصدار حويصلة. كما Ca2 + مطلوب من أجل الإفراج عن حويصلات متزامن، يجب القضاء على استبدال مع ريال2 + سيبسكس السعة الكبيرة التي تدل على تعدد. ثالثا، ميتشانيستيكالي، تعدد يمكن أن يؤدي أما جهات متشابك متعددة إلى نفس الخلايا العصبية بوستسينابتيك أو الإصدار مولتيفيسيكولار (أي حويصلات متعددة إطلاق سراحهم خلال اتصال متشابك واحدة)17،18. للتمييز بين هذين النوعين من التعدد، يستخدم التجربة الثالثة لتقارب منخفضة، سرعة الناي تنافسية خصم مستقبلات امبا،،γ-د-جلوتاميلجليسيني (γ-DGG)1718 لتحديد ما إذا كانت كبيرة سيبسك هي نتيجة لمجموع الزمانية نهايات مستقلة أو الإفراج عن مولتيفيسيكولار تعمل على سكان بتداخل مستقبلات بوستسينابتيك. إذا كانت الأحداث السعة الكبيرة التي تنشأ عن إطلاق سراح مولتيفيسيكولار، γ-DGG ستكون أقل فعالية في تثبيط سيبسكس مقارنة بالاصغر حجماً أكبر، بينما سوف تتأثر بالمثل سيبسكس الكبيرة التي تنشأ من مجموع الزمانية لعدة جهات اتصال متشابك Γ-استيراد. في التجربة الرابعة، استخدمت طريقة أكثر فيزيولوجية لتعزيز إمكانات عمل إطلاق النار، وهما الزبائ التحفيز متشابك. عابر رشقات نارية باتجاه النشاط متشابك الزيادة/تيسير عفوية العمل إمكانية إطلاق النار، والإفراج عن احتمال أفيرينتس حفز. ويسمح هذا النهج لذلك، تعدد في المجاهرة بطريقة أكثر فسيولوجية.
البروتوكول التالية توضح طريقة إجراء هذه التجارب في الأنسجة طائي الماوس. وتستخدم على وجه التحديد، كورتيكوتروبين الإفراج عن هرمون (CRH) الخلايا العصبية من نواة تحت المهاد (التشفيير) بارافينتريكولار. تصف الإجراءات المتعلقة بإجراء تصحيح كامل الخلية المشبك الكهربية، وشرح التجارب المحددة لاختبار لتعدد متشابك.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

غالباً ما تشكل زوج من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي، متشابك الاتصالات متعددة و/أو مواقع إطلاق سراح العصبي الوظيفي (تعدد متشابك). تعدد متشابك من البلاستيك، والتغيرات في التنمية وفي مختلف الظروف الفسيولوجية، محدداً هاما لفعالية انتقال متشابك. هنا، فإننا مخطط تجارب لتقدير الدرجة تعدد الاشتباكات العصبية التي تنتهي إلى خلية بوستسينابتيك معين باستخدام التصحيح كامل الخلية الكهربية المشبك في شرائح الدماغ الحادة. على وجه التحديد، هو استخدام تسجيل الجهد-المشبك لمقارنة الفرق بين السعة للتيارات عفوية بوستسينابتيك ضادات (سيبسكس) والتيارات بوستسينابتيك ضادات مصغرة (ميبسكس). النظرية وراء هذا الأسلوب هو أن تظهر المدخلات الزبائ أن المعرض تعدد سيبسكس كبيرة، وتعتمد على إمكانات العمل بسبب الإفراج المتزامن الذي يحدث في كل جهة اتصال متشابك. وفي المقابل، سينشئ الإفراج عن إمكانيات العمل المستقل (وغير متزامنة) أصغر مطال ميبسكس. هذه الوثيقة الخطوط العريضة لمجموعة من التجارب والتحليلات تميز بوجود تعدد متشابك ويناقش شروط وقيود تقنية. يمكن تطبيق هذه التقنية للتحقيق كيف مختلف التدخلات السلوكية أو دوائية أو البيئية في فيفو تؤثر على تنظيم جهات الاتصال متشابك في مناطق مختلفة من الدماغ.

البروتوكول أعلاه توضح طريقة لاستخدام تصحيح كامل الخلية المشبك الكهربية لفحص درجة تعدد متشابك، استخدام الماوس طائي الخلايا العصبية كمثال. ينبغي أن يؤدي هذا الأسلوب إعداد شريحة الخلايا قابلة للحياة السليمة التي لم تقم تورم الغشاء أو نواة (الشكل 1). كل خطوة في البر...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

تقييم متشابك تعدد استخدام المشبك تصحيح كامل الخلية الكهربية

نقدم هنا، على بروتوكول لتقييم تعدد متشابك الوظيفية باستخدام التصحيح كامل الخلية الكهربية المشبك في شرائح الدماغ الحادة.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

في الدماغ، زوج من الخلايا العصبية غالبا ما تشكل اتصالات متشابكة متعددة، وهو ما يسمى تعدد متشابك. ومع ذلك، يتطلب الفحص الدقيق للتعدد المتشابك تجارب صعبة من الناحية الفنية. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لتقدير إجمالي تعدد متشابك باستخدام الخلايا الكاملة التصحيح المشبك الكهربائية الفيزيولوجيا.ويمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نوع ومنطقة الدماغ للتحقيق في تعدد متشابك. هذه الطريقة تتطلب المهارات الأساسية في خلية كاملة التصحيح- المشبك الكهربائية الفيزيولوجيا. الحصول على تسجيلات عالية الجودة مع مقاومة وصول منخفضة ومستقرة أمر بالغ الأهمية للتفسير الدقيق للبيانات.للحصول على تكوين الخلية الكاملة، ضع ماصة التسجيل فوق الشريحة وتيار الإزاحة في وضع المشبك الجهد. تطبيق ضغط إيجابي طفيف على ماصة، وقفل stopcock. بعد ذلك، حدد خلية سليمة مع غشاء سليم، والاقتراب من الأنسجة مع ماصة.وينبغي أن يسبب الضغط الإيجابي اضطرابا طفيفا على الأنسجة. ببطء جعل ماصة أقرب إلى الخلية في حركة قطرية حتى يتم تشكيل غمل صغير على سطح الخلية. ثم، الافراج عن قفل الضغط الإيجابي.ستبدأ الخلية في تشكيل ختم، وسوف تزيد المقاومة فوق غيغا و في المشبك الجهد، عقد الخلية في ناقص 68 millivolts. في وقت لاحق، سحب قليلا من الماصات بعيدا عن الخلية قطريا لإزالة الضغط الزائد.تعويض عن السعة الماصة السريعة والبطيء. تطبيق شفط قصيرة من خلال أنبوب متصل إلى حامل ماصة لاختراق الخلية والحصول على تكوين الخلية الكاملة. ثم، التحول إلى وضع الخلية على نافذة اختبار الغشاء في الحصول على البيانات الكهربائية وتحليل البرمجيات.الحفاظ على درجة حرارة حمام التسجيل عند 27 إلى 30 درجة مئوية ومعدل التدفق عند 1.5 إلى 2 ملليلتر في الدقيقة للتجارب اللاحقة. في المشبك المتعدد، عمل المحتملة مزامنة إطلاق الناقل العصبي ويولد أكبر ما بعد ينابتيك الحالية. منع العمل المحتملة والطلقات التي تعتمد على الكالسيوم مع TTX والكادميوم يمنع الجمع ما بعد المينابتية الحالية ويقلل من السعة.عندما لا يكون هناك تعدد، حظر العمل المحتملة لن يغير السعة. في التجربة الأولى، لتقدير التعدد، اضغط على الخلية عند ناقص 68 ملليفولت بينما تضخها بـ aCSF منخفض الكالسيوم. سجل مراكز EPSCs التلقائية لمدة خمس دقائق على الأقل لضمان خط أساس مستقر.بعد ذلك ، إضافة 30 micromolars 4-AP إلى ACSF لزيادة الأحداث التي تعتمد على العمل ، وتسجيل EPSCs التلقائية لمدة 10 دقائق على الأقل للحصول على تأثير الدواء الكامل. ثم، إضافة 0.5 micromolars TTX و 10 ميكرومولار الكادميوم إلى ACSF مع 4-AP، وتسجيل EPSCs مصغرة لمدة 10 دقائق على الأقل. للتحليل غير متصل، استخدم آخر دقيقة من خط الأساس مباشرة قبل تطبيق 4-AP، و10ث من تطبيق 4-AP، والدقيقة 10 من تطبيق TTX.في هذه التجربة، يتم استبدال الكالسيوم خارج الخلية مع السترونتيوم لتم اإفخاض إطلاق من vesicles متشابك. لذلك، إذا كان التعدد موجوداً، فإن هذا ينبغي أن يقلل من سعة التيارات بعد التمثيل. في التجربة الثانية، سجل EPSCs عفوية لمدة خمس دقائق على الأقل في حين ضخ الخلية مع aCSF الكالسيوم العادي.لdynchronize الافراج عن vesicle ، والبدء في ضخ الخلية مع aCSF السترونتيوم ، وتسجيل EPSCs عفوية. لتحليل دون اتصال، لتحديد ما إذا كانت الاتساع كبيرة EPSCs عفوية بسبب الإفراج المتزامن من الفويصلات، قارن الدقيقة الأخيرة من خط الأساس إلى الدقيقة 10 من تطبيق السترونتيوم ACSF. يمكن أن ينطوي على التعدد إطلاق متعددة الناحية، مما يؤدي إلى تركيز أعلى العصبي في الشق متشابك.إضافة غاما-DGG، وهو خصم مستقبلات AMPA منخفضة التقارب، يؤدي إلى تثبيط أقل فعالية من multiquantal أكبر مقارنة مع التيارات ما بعد أحادية أحادية أصغر. بدون إطلاق متعدد المستويات، سيكون gamma-DGG فعالًا بنفس القدر على التيارات التيارات التي تتم بعد السنوات. في التجربة الثالثة، لاختبار إطلاق متعدد القطاعات، سجل EPSCs التلقائي في aCSF منخفضة الكالسيوم لمدة خمس دقائق على الأقل.إضافة 30 ميكروموللار 4-AP إلى ACSF من خلال نظام الضخ. سجل EPSCs عفوية لمدة 10 دقيقة على الأقل. ثم، إضافة 200 micromolars غاما-DGG إلى ACSF مع 4-AP، وتسجيل EPSCs عفوية لمدة 10 دقائق على الأقل.كتجربة تحكم في خلية منفصلة، كرر الإجراءات، ولكن تطبيق تركيز منخفض من DNQX بدلاً من غاما-DGG. لتحليل دون اتصال، وتحليل اللحظة الأخيرة من كل تطبيق المخدرات. رشقات نارية من النشاط متشابك يمكن أن تزيد بشكل عابر من إطلاق العمل العفوي المحتملة واحتمال الإفراج عن afferents حفز.إذا أظهرت الخلايا العصبية تعدد, زيادة في إمكانات العمل ينبغي أن يسبب زيادة عابرة في سعة التيارات بعد تينابتيك. في التجربة الرابعة، سجل EPSCs عفوية في الكالسيوم aCSF العادي. لزيادة إطلاق العمل المحتملة، وتحفيز afferents باستخدام القطب الزجاجي monopolar مليئة ACSF بمعدل 20 هرتز لمدة ثانيتين، وتكرار 10 مرات مع فاصل بين انفجار 20 ثانية.للتحليل، استخدم 5000 مللي ثانية من وحدات EPSCs التلقائية قبل التحفيز الأول كخط أساس وقارنها بـ 10 إلى 300 مللي ثانية من EPSCs التلقائية بعد التحفيز النهائي. ثم، تأخذ السعة متوسط وتواتر التغيير أكثر من 10 التجارب. تحليل EPSCs التلقائية و EPSCs مصغرة باستخدام برنامج يكشف ويحلل التيارات متشابك.استخدام المعلمات الكشف المقترحة ووظيفة التحليل دون توقف للكشف عن EPSCs مستقبلات AMPA بوساطة. تفحص يدويا كل تسجيل للتأكد من أن البرنامج هو الكشف بدقة كل حدث. تصدير بيانات الحدث عن طريق نسخها إلى الحافظة، ولصقها في برنامج إدارة بيانات.بعد ذلك، حساب متوسط التردد والسعة لكل علاج المخدرات، وإجراء التحليلات الإحصائية ذات الصلة. في مثال هو مبين هنا، 4-AP يزيد من كل من السعة وتواتر من EPSCs عفوية. التطبيق اللاحق من TTX والكادميوم يقلل من كل من السعة والتردد.هنا هو توزيع عفوية EPSC السعة من التسجيل. في الخلايا العصبية المهوّسة التي تم فحصها هنا، فإن سعة وتواتر شروط خط الأساس وTTX هي نفسها، مما يشير إلى أن مراكز EPSCs التلقائية الأساسية تحتوي على عدد قليل جدًا من مراكز EPSCs التي تعتمد على العمل. وبناء على ذلك، يمكن للتجارب اللاحقة أن تقارن الفرق بين خط الأساس و 4-ا ف ب لقياس التعدد.قوة انتقال متشابك يمكن أن يزيد بشكل عابر من رشقات نارية من النشاط متشابك. للتحقيق في تعدد تحت ظروف أكثر فسيولوجية، يمكن استخدام التحفيز afferent لزيادة احتمال إطلاق النار واحتمال إطلاق. وفيما يلي ملخصات من التردد EPSC التلقائي والتغيرات السعة بعد التحفيز متشابك.التسجيلات المستقرة ضرورية لتفسير دقيق للبيانات. وصف البيانات إذا تغيرت مقاومة الوصول بأكثر من 20٪ أثناء التسجيل، لأن هذا قد يربك التحليل. يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة لتقدير التعدد متشابك، وهو محدد رئيسي للفعالية متشابك ولدونته في الظروف الفسيولوجية والفيزيولوجية المختلفة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

زراعة والكهربية من الخلايا على رقائق التصحيح، المشبك NRCC

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

كله المشبك التصحيح الخلايا لدراسة آليات التحفيز العصبية الأشعة تحت الحمراء

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

A-متعدد القطب نظام التصحيح، المشبك بمساعدة الحاسوب

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

خلية كاملة تسجيلات التصحيح، المشبك من Morphologically- وحددت Neurochemically-الحصين Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

تصحيح شريحة المشبك تقنية لتحليل اللدونة المستحثة بالتعلم

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

استجابة جذع الدماغ السمعية والخارجي الشعر خلية تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية في الفئران بعد الولادة

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

الأعمال التحضيرية وبروتوكولات "كل خلية التصحيح المشبك تسجيل" ليفيس النمو تيكتال الخلايا العصبية

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

إعداد شرائح الحبل الشوكي الحاد لتسجيل كامل الخلية التصحيح-المشبك في الخلايا العصبية جيلاتينوسا الدماغ

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...