Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
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J. s. 获得安大略省研究生奖学金。我们收到了加拿大心理健康研究机构的新调查团契。这项工作得到加拿大自然科学和工程研究理事会 (06106-2015 RGPIN) 和加拿大卫生研究所 (PJT 148707) 向 wi 提供的业务赠款的支持。

所有动物实验均由西安大略大学动物护理委员会根据加拿大动物护理理事会指南 (AUP#2014-031) 批准。
1. 解决方案
<ol><li>
切片解决方案
	<ol>
<li>有关切片解决方案的组成, 请参阅表 1 。</li>
		<li>提前准备20x 库存解决方案, 并将其存放在 4°c, 最长1个月。</li>
		<li>对于1x 切片液, 在 Ddh2o中溶解 NaHCO 3、葡萄糖和蔗糖,并添加20x 库存。确保渗?...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

一个成功的膜片钳电生理学实验的一个重要要求是获得健康的切片细胞。我们描述的协议针对含有 PVN 神经元的下丘脑切片进行了优化。其他大脑区域可能需要修改溶液和切片方法21,22, 23,24.对于录音来说, 只有通过不断监测电池特性 (如膜电阻、电容和访问电阻), 才能接受稳定的记录是至关重要的。访...

突触传递是神经元之间沟通的基本机制, 因此也是大脑功能的基本机制。突触传输也是不稳定的, 可以改变其疗效在活动依赖的方式, 以及在对模块信号1的反应.因此, 检查突触功能一直是神经科学研究的重点。全细胞膜片钳电生理学是一种多功能的技术, 使我们能够了解, 通过设计实验设计和数据分析, 深入的生物物理和分子机制的突触传输。一个常用的方法, 也许是由于简单的技术和概念, 是测量微型兴奋器-抑制后电流 (me/ipsc) 下的电压夹配置 2,3,4 个,5,6. 单个 Mpsc 代表离子通过突触后电离受体 (如 AMPA 和 gaba a 受体) 的流动, 以响应从突触端子释放的各自神经递质的结合7.因为记录是在电压门控 na+通道阻滞剂河豚毒素 (ttx) 的存在下获得的, 所以释放是与作用电位无关的, 通常涉及一个包含神经递质的单突状囊泡。基于这一假设, Mpsc 的平均振幅被广泛用作量子大小的粗略估计, 它表示相对于单个释放位点的突触后受体的数量和功能。另一方面, Mpsc 的频率被认为是终止于突触后细胞的突触总数及其平均释放概率的组合。然而, 这些参数并不测量突触的另一个可变乘法, 或突触多样性--这对突触传递的有效性很重要。
根据突触传递的量子理论7,8,9, 一对神经元之间给定连接的强度取决于三个因素: 功能突触 (n) 的数量,突触后对单个突触囊的释放反应 (量子大小;Q) 和神经递质释放的概率 (pr)。突触多样性相当于n。突触多样性的发展或乘法突触的修剪是塑料的整个发展过程中, 处于不同的疾病状态3,4,6,10。因此, 描述突触多样性对了解突触传播在健康和疾病中的有效性具有重要意义。电子显微镜等技术可以通过检测来自同一轴突到同一突触后神经元 11,12 的多个突触触点来识别突触多样性的结构证据, 13,14。然而, 这些结构上标识的多突触可以功能上静默15,16。对 n 进行精确的功能检查需要技术上具有挑战性的电生理方法, 例如配对的全细胞记录, 可以确定给定的连接是否具有多个功能释放位点和最小值刺激方法, 旨在招募一个单一的假定轴突。
在这个协议中, 我们描述了一种简单的方法, 通过采用最初由 Hsia 等人2开发的方法来估计突触多样性。这项技术包括测量自发 psc (Spsc) 和 Mpsc 使用全细胞膜片夹电生理学, 这使得我们能够估计整个输入到给定神经元的突触多样性的程度。 如前所述, 突触多样性反映了给定突触前和突触后神经元之间的突触数。如果多个突触被一个动作电位在同步中吸收, 那么单个 (即量子) Psc 的时间总和的概率就很高, 从而产生更大的振幅 PSC。 在 mPSC 记录 (其中动作电位被 TTX 阻塞) 中, 单个 (非同步) Mpsc 的时间总和概率较低。利用这一原理, 可以通过将 sPSC 振幅 (与动作电位相关释放) 与 mPSC 振幅进行比较来估计突触多样性。
为了检验多样性的存在, 我们描述了四个实验及其分析, 以谷氨酸 Epsc 为例。然而, 同样的方法也可用于快速 Gabaergic/糖化反应 (Ipsc)。下面介绍了每个实验的简要原理。首先, 如上所述, 突触多样性可以通过比较 sEPSCs 的振幅和 mEPSCs 来估计。此方法有两个要求;1) 突触前轴突必须在记录过程中发射足够数量的动作电位, 2) p r必须很高, 以便多个突触在动作电位到达时释放神经递质。为了满足这些要求, sEPSCs 首先记录在低 Ca2 +人工脑脊液 (aCSF) 中, 然后记录在低浓度的 k+通道拮抗剂, 4-氨基吡啶 (4-ap) 的存在下, 以增加作用潜在的发射和p r。然后, 动作电位射击被 TTX 阻断, Pr 被电压门控 Ca2+通道阻滞剂 cd2 +所减少。将 sEPSCs 的振幅 (与 4AP) 与 mEPSC 的振幅 (与4AP、TTX 和 Cd2 +) 进行比较。在第二个实验中, Ca2 +被 Csf 中的等光 sr2 + 替换, 以消除囊泡释放。由于囊泡同步释放需要 Ca2 + , 因此用 sr2 + 替换应消除指示多样性的大振幅 sEPSCs。第三, 机械上, 多样性可以导致多个突触接触到相同的突触后神经元或多囊释放 (即多个囊泡释放在一个单一的突触接触)17,18。为了区分这两种类型的多样性, 第三个实验使用低亲和力, 快速离解竞争拮抗剂的 ampa-谷氨酰糖 (γ-dgg)17,18, 以确定是否大sEPSC 是独立突触或多囊释放的时间总和作用于突触后受体重叠种群的结果。如果大振幅事件产生于多泡释放, 与较小的 sEPSCs 相比, Γ-dgg 在抑制大方面的效果会更小, 而多个突触触点的时间总和所产生的大 sEPSCs 也会受到类似的影响, 也会受到类似的影响。Γ-dgg。在第四个实验中, 采用了一种更生理的方法来增强动作电位的激发, 即传入突触刺激。突触活动的爆发可以短暂地增加-促进受激传入的自发动作电位激发和释放概率。因此, 这种方法允许多样性以更多的生理方式表现出来。
下面的协议描述了在小鼠下丘脑组织中进行这些实验的方法。具体而言, 使用下丘脑 (PVN) 室旁核的促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH) 神经元。我们描述了进行全细胞膜片钳电生理学的程序, 并解释了测试突触多样性的具体实验。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

在中枢神经系统中, 一对神经元通常形成多个突触触点和/或功能神经递质释放位点 (突触多样性)。突触多样性是可塑性的, 在整个发育过程中和不同的生理条件下都会发生变化, 是突触传递效果的重要决定因素。在这里, 我们概述了实验, 以估计多度突触终止到特定的突触后神经元使用全细胞膜片钳电生理学在急性脑片。具体而言, 电压夹具记录用于比较自发兴奋突触后电流 (sEPSCs) 和微型兴奋突触后电流 (mEPSCs) 的振幅之间的差异。这种方法背后的理论是, 由于在每个突触接触中发生的同步释放, 表现出多样性的传入输入将显示出巨大的、作用潜力相关的 sEPSCs。相反, 与动作电位无关的释放 (异步) 将产生较小的振幅 mEPSCs。本文概述了一组实验和分析, 以表征突触多样性的存在, 并讨论了该技术的要求和局限性。这项技术可用于研究不同的行为、药理或环境干预如何影响不同大脑区域突触的组织。

上述协议描述了一种使用全细胞膜片钳电生理学的方法, 以小鼠下丘脑神经元为例, 检查突触多样性的程度。这种切片制备技术应产生健康的活细胞, 没有肿胀的膜或细胞核 (图 1)。协议中的每一步都对组织的健康和录音质量很重要。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59461/59461fig1.jpg"> 图 1: 切片制?...

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Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

全细胞膜片电生理方法对突触倍数的评价

在这里, 我们提出了一个评估功能突触多样性的方案, 使用全细胞膜片夹具电生理学在急性脑片。

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

在大脑中，一对神经元经常形成多个突触，称为突触多重性。然而，精确检查突触的多重性需要技术上具有挑战性的实验。该协议描述了一种使用全细胞贴片夹电生理学对突触倍数进行总估计的简单方法。该方法可应用于任何物种和大脑区域，以研究突触的多重性。这种方法需要全细胞贴片夹电生理学的基本技能。获得具有低和稳定访问电阻的高质量录像对于准确解释数据至关重要。要获得全单元配置，请将记录移液器放在切片的上方，并在电压夹模模式下偏移移液器电流。向移液器施加轻微的正压，然后锁定止损器。接下来，选择一个完整膜的健康细胞，用移液器接近组织。正压应引起组织轻微干扰。以对角线运动缓慢地使移液器更接近细胞，直到在细胞表面上形成一个小酒窝。然后，松开正压锁。细胞将开始形成一个密封，电阻将增加超过一个千兆。在电压夹中，将电池保持零下 68 毫伏。随后，稍微将移液器从细胞对角线拉开，以消除多余的压力。补偿快速和缓慢的移液器电容。通过连接到移液器支架的管进行短暂的吸管，以突破电池并获得全细胞配置。然后，在电生理学数据采集和分析软件中切换到膜测试窗口上的细胞模式。将记录浴的温度保持 27 至 30 摄氏度，流速为每分钟 1.5 至 2 毫升，以便进行后续实验。在多重突触中，动作电位同步神经递质释放并产生更大的后突触电流。使用 TTX 和镉阻断作用电位和钙依赖性车辆释放可防止后突触电流总和并降低振幅。当没有多重性时，阻塞作用电位不会改变振幅。在实验一中，为了估计多重性，将细胞保持在负68毫伏，同时用低钙ACSF来吸收它。记录自发的 EPSC 至少五分钟，以确保稳定的基线。接下来，向 aCSF 添加 30 微摩尔 4-AP 以增加作用潜在相关事件，并记录自发的 EPSC 至少 10 分钟，以获得完整的药物效果。然后，使用 4-AP 向 aCSF 中加入 0.5 微摩尔 TTX 和 10 微摩尔镉，并将微型 EPSC 记录至少 10 分钟。对于脱机分析，请使用 4-AP 应用之前的最后一分钟基线、4-AP 应用程序的第 10 分钟和 TTX 应用程序的第 10 分钟。在这个实验中，细胞外钙被替换为钛，以去同化突触囊泡的释放。因此，如果存在多重性，这应会降低柱突触电流的振幅。在实验二中，记录自发的EPCS至少5分钟，同时用正常的钙ACSF使细胞吸收。要去同化囊泡释放，请开始使用具有 aCSF 的钚来使细胞中注入，并记录自发的 EPSC。对于离线分析，要确定大振幅自发 EPSC 是否由于囊泡的同步释放，请将基线的最后一分钟与 aCSF 应用的第 10 分钟进行比较。多重性可能涉及多垂直释放，这会导致突触裂口中神经递质浓度较高。添加Gama-DGG，一种低亲和力的AMPA受体拮抗剂，导致与较小的单量后突触电流相比，对较大多量的抑制效果较低。如果没有多垂直释放，伽玛-DGG在更大和更小的柱突触电流上同样有效。在实验三中，为了测试多维释放，在低钙ACSF中记录自发的EPSC至少5分钟。通过灌注系统向 ACSF 添加 30 微摩尔 4-AP。记录自发的 EPSC 至少 10 分钟。然后，使用 4-AP 将 200 微摩尔伽马-DGG 添加到 aCSF 中，并记录自发的 EPSC 至少 10 分钟。作为单独单元中的控制实验，重复这些过程，但应用低浓度的 DNQX 而不是伽玛-DGG。对于离线分析，分析每个药物应用的最后一分钟。突触活动的突发可以瞬时增加自发动作电位发射和释放概率的刺激的 afferents。如果神经元表现出多重性，则作用电位的增加应导致后突触电流的振幅短暂增加。在实验四中，记录普通钙ACF中的自发EPSC。为了增加作用潜力的发射，使用充满 aCSF 的单极玻璃电极刺激 affers，速度为 20 赫兹两秒，以 20 秒的间爆发间隔重复 10 次。为了进行分析，在第一个刺激之前使用 5，000 毫秒的自发 EPSC 作为基线，并与最终刺激后的 10 到 300 毫秒自发 EPSC 进行比较。然后，采取平均振幅和频率变化超过10个试验。使用检测和分析突触电流的程序分析自发的 EPSC 和微型 EPSC。使用建议的检测参数和不停分析功能检测AMPA受体中位EPPC。手动扫描每个记录，以确保程序准确检测每个事件。通过将事件数据复制到剪贴板来导出事件数据，并将其粘贴到数据管理软件中。接下来，计算每次药物治疗的平均频率和振幅，并进行相关的统计分析。在此处所示的示例中，4-AP 增加了自发 EPSC 的振幅和频率。TTX 和镉的后续应用降低了振幅和频率。以下是记录中自发 EPSC 振幅的分布。在此检查的下丘脑神经元中，基线和 TTX 条件的振幅和频率是相同的，这表明基线自发 EPSC 包含很少的操作电位依赖 EPSC。因此，后续实验可以比较基线和4-AP之间的差值，以测量多重性。突触传输的强度可以通过突触活动的突发来暂时增加。为了研究在更多的生理条件下的多样性，可以使用一种刺激来增加动作潜在的射击和释放概率。以下是突触刺激后自发 EPSC 频率和振幅变化的摘要。稳定的记录对于准确解释数据至关重要。如果访问电阻在录制过程中变化超过 20%，则描述数据，因为这可能会混淆分析。该协议提供了一个简单的方法来估计突触多样性，这是一个关键的决定因素突触功效及其可塑性在不同的生理和病理生理条件。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

NRCC的膜片钳芯片上细胞的培养和电

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

科研

神经科学

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

全细胞膜片钳红外神经刺激机制的调查

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

计算机辅助多电极膜片钳系统

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

从Morphologically-和确定的Neurochemically海马的interneurons全细胞膜片钳记录

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

在脑片全细胞膜片钳记录

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

全细胞贴片记录用于电泳生理测定通道视紫质中的离子选择性

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

分层膜片钳技术在学习诱导可塑性分析中的应用

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

产后大鼠听觉脑干反应及外毛细胞全细胞贴片钳记录

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

爪蟾Tectal 神经元全细胞膜片钳记录的制备与协议

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

凝胶神经元全细胞斑块夹的急性脊髓切片的制备

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...