Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

J.S. modtaget Ontario Graduate stipendium. W.I. modtog en ny efterforsker stipendium fra Mental Health Research Canada. Dette arbejde støttes af driftstilskud til W.I fra naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) og det canadiske Institut for sundhedsforskning (PJT 148707).

Alle dyreforsøg er godkendt af animalsk omhu Udvalget af The University of Western Ontario i overensstemmelse med den canadiske Rådet om dyrs pleje retningslinjer (op #2014-031).
1. løsninger
<ol><li>
Udskæring løsning
	<ol>
<li>Se tabel 1 for sammensætningen af den udskæring løsning.</li>
		<li>Forberede en 20 x stamopløsning på forhånd og gemme det ved 4 ° C i op til 1 måned.</li>
		<li>1 x udskæring løsning, opløses NaHCO3, gluc...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

En vigtig forudsætning for en vellykket patch klemme Elektrofysiologi eksperiment er at opnå sund skiver/celler. Vores beskrevne protokol er optimeret til hypothalamus skiver, der indeholder PVN neuroner. Andre hjernen områder kan kræve modificerede løsninger og udskæring metoder21,22,23,24. For optagelsen, det er afgørende at kun acceptere stabile optagelser af konstant overvågning cel...

Synaptisk transmission er en grundlæggende mekanisme for kommunikation mellem neuroner, og dermed hjernens funktion. Synaptisk transmission er også labil og kan ændre dens effekt i en aktivitet-afhængige måde så godt som reaktion på modulerende signaler1. Således har undersøgelse synaptiske funktion været et centralt fokus for neuroscience research. Hele-celle patch klemme Elektrofysiologi er en alsidig teknik, der gør det muligt for os at forstå, ved udtænke eksperimentelle design og dataanalyse, dybdegående biofysiske og molekylære mekanismer af synaptisk transmission. Et almindeligt anvendte tilgang, måske på grund af enkelheden i den teknik og koncept, er måling af miniature excitatoriske/hæmmende postsynaptiske strømme (mig / IPSCs) under spændingen klemme konfiguration2,3, 4 , 5 , 6. individuelle mPSCs repræsenterer strømmen af ioner gennem postsynaptiske ionotropic receptorer (fx AMPA og GABA-A receptorer) som svar på bindingen af deres respektive neurotransmittere frigivet fra den præsynaptiske terminal 7 . Fordi optagelsen er fremstillet i overværelse af spænding-gated Na+ kanal blokker tetrodotoxin (TTX), frigivelse er aktionspotentialet-uafhængig og indebærer normalt en enkelt synaptic vesikel, der indeholder neurotransmitter. Baseret på denne antagelse, er den gennemsnitlige amplitude af mPSCs meget udbredt som et groft estimat for quantal størrelse, som repræsenterer nummer og funktionalitet af postsynaptiske receptorer imod en enkelt udgivelse site. På den anden side anses hyppigheden af mPSCs for at repræsentere en kombination af det samlede antal synapser afslutning på den postsynaptiske celle og deres gennemsnitlige release sandsynlighed. Men disse parametre ikke måle en anden variabel-multiplicativity synapser, eller synaptic mangfoldighed — som er vigtige for effektiviteten af synaptisk transmission.
Baseret på den quantal teori om synaptisk transmission7,8,9, styrken af en given forbindelse mellem et par af neuroner er afhængig af tre faktorer: antallet af funktionelle synapser (N), den postsynaptiske reaktion på frigivelsen af en enkelt synaptic vesikel (quantal størrelse; Q) og sandsynligheden for neurotransmitter frigivelse (Pr). Synaptic multipliciteten er svarende til N. Udviklingen af synaptic mangfoldighed eller beskæring af multiplikativ synapser er plast i hele udvikling og i forskellige sygdom stater3,4,6,10. Derfor har karakteriserer synaptic mangfoldighed stor betydning for at forstå effekten af synaptisk transmission i sundhed og sygdom. Teknikker, såsom elektronmikroskopi kan identificere strukturelle beviser synaptic mangfoldighed ved at afsløre flere synaptic kontakter med oprindelse fra den samme axon på samme postsynaptiske neuron11,12, 13,14. Disse strukturelt identificerede multisynapses kan dog være funktionelt tavse15,16. Præcise funktionelle undersøgelse af N kræver teknisk udfordrende elektrofysiologiske tilgange, såsom parrede hele-celle optagelser, der kan identificere, om en given forbindelse har flere funktionelle frigivelse sites og minimal stimulation tilgange, der har til formål at rekruttere en enkelt formodede axon.
I denne protokol beskriver vi en simpel metode til vurdering af synaptic mangfoldighed ved at vedtage en metode, oprindeligt udviklet af Hsia mfl2. Denne teknik indebærer måling af spontan PSC'er (sPSCs) og mPSCs ved hjælp af hele-celle patch klemme Elektrofysiologi, som tillader os at vurdere graden af synaptic mangfoldighed på tværs af alle indgange til en given neuron.  Som tidligere definerede, synaptic mangfoldighed afspejler antallet af synapser mellem en given præ- og postsynaptiske neuron. Hvis flere synapser rekrutteres i synchrony af en handling potentiale, vil der være stor sandsynlighed for temporal summation af individuelle (dvs. quantal) PSC'er, generere en større amplitude PSC.  I mPSC optagelser (i hvilken handling potentialer er blokeret af TTX), sandsynligheden for temporal summation af individuelle (ikke-synkron) mPSCs er lavt. Ved hjælp af denne logik, kan synaptic mangfoldighed estimeres ved at sammenligne sPSC amplitude (med aktionspotentialet-afhængige release) til mPSC amplitude.
For at undersøge forekomsten af mangfoldighed beskrive vi fire eksperimenter og deres analyser ved hjælp af glutamatergic EPSCs som eksempel. Men samme tilgang kan bruges til hurtigt GABAergic/glycinergic transmission (IPSCs). En kort begrundelse for hvert forsøg er beskrevet nedenfor. Først, som forklaret ovenfor, synaptic mangfoldighed kan estimeres ved at sammenligne amplitude af sEPSCs til mEPSCs. Der er to krav for denne fremgangsmåde; 1) præsynaptiske axoner skal fyre et tilstrækkeligt antal handling potentialer under optagelsen, og 2) Pr skal være høj, så flere synapser frigive neurotransmitter ved ankomsten af en aktionspotentialet. For at opfylde disse krav, er sEPSCs først indspillet i lave Ca2 + kunstige cerebrospinalvæske (aCSF), og derefter optaget i overværelse af en lav koncentration af K+ kanal antagonist, 4-Aminopyridine (4-AP) at øge handling potentielle fyring og Pr. Derefter er aktionspotentialet fyring blokeret af TTX og Pr faldt med en spænding-gated Ca2 + -kanal blokker Cd2 +. Amplituden af sEPSCs (med 4AP) er sammenlignet med mEPSC (med 4AP, TTX og Cd2 +). I det andet forsøg, er Ca2 + erstattet af equimolar Sr2 + i aCSF til desynchronize vesikel frigivelse. Som Ca2 + er påkrævede til synkron udgivelsen af vesikler, bør udskiftning med Sr2 + fjerne de store amplitude sEPSCs, der er vejledende for mangfoldighed. Tredje, mekanisk, mangfoldighed kan skyldes enten flere synaptic kontakter til samme postsynaptiske neuron eller multivesicular release (dvs. flere vesikler frigivet inden for en enkelt synaptic kontaktperson)17,18. For at skelne mellem de to typer af mangfoldighed, bruger den tredje eksperiment en lav affinitet, hurtig miljøomkostningerne konkurrencedygtige antagonist af AMPA-receptorer, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 at afgøre, om store sEPSC er resultatet af den temporal summation af uafhængige synapser eller multivesicular release handler på en overlappende befolkning af postsynaptiske receptorer. Hvis de store amplitude begivenheder opstår fra multivesicular release, bliver γ-DGG mindre effektive til at hæmme større i forhold til mindre sEPSCs, store sEPSCs, der opstår fra den temporal summation af flere synaptic kontakter vil ligeledes berøres af Γ-DGG. I den fjerde eksperiment bruges en mere fysiologiske metode til at forbedre aktionspotentialet fyring, nemlig afferente synaptic stimulation. Byger af synaptic aktivitet kan forbigående stigning/lette spontan aktionspotentialet fyring og frigivelse sandsynligheden for den stimuleret afferenter. Derfor, denne tilgang giver mangfoldighed til at manifestere i en mere fysiologisk måde.
Følgende protokol beskriver metoden til at gennemføre disse forsøg i mus hypothalamus væv. Specifikt, anvendes corticotropin frigive hormon (CRH) neuroner i paraventricular kernen i hypothalamus (PVN). Vi beskriver procedurer til at gennemføre hele-celle patch klemme Elektrofysiologi og forklare de konkrete eksperimenter til test af synaptic mangfoldighed.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

I det centrale nervesystem, et par af neuroner ofte danner flere synaptic kontakter og/eller funktionelle neurotransmitter frigivelse sites (synaptic mangfoldighed). Synaptic multipliciteten er plast og ændringer i hele udvikling og i forskellige fysiologiske betingelser, er en afgørende faktor for effekten af synaptisk transmission. Her, skitsere vi eksperimenter til vurdering af graden af mangfoldighed af synapser afslutning på en given postsynaptiske neuron bruger hele-celle patch klemme Elektrofysiologi i akut hjernen skiver. Specifikt, bruges spænding-clamp optagelse til at sammenligne forskellen mellem amplitude af spontan excitatoriske postsynaptiske strømme (sEPSCs) og miniature excitatoriske postsynaptiske strømme (mEPSCs). Teorien bag denne metode er, at afferente indgange, der udviser mangfoldighed vil vise store, aktionspotentialet-afhængige sEPSCs på grund af den synkrone udgivelse, der opstår på hver synaptic kontakt. Derimod vil aktionspotentialet-selvstændig frigivelsen (som er asynkron) generere mindre amplitude mEPSCs. Denne artikel beskriver et sæt af forsøg og analyser til at karakterisere eksistensen af synaptic mangfoldighed og omhandler de krav og begrænsninger af teknikken. Denne teknik kan anvendes til at undersøge, hvordan forskellige adfærdsmæssige, farmakologiske eller miljømæssige interventioner i vivo påvirker organisationen af synaptic kontakter i forskellige hjernen områder.

Den ovennævnte protokol beskriver en metode til at bruge hele-celle patch klemme Elektrofysiologi for at undersøge graden af synaptic mangfoldighed, ved hjælp af musen hypothalamus neuroner som eksempel. Denne skive forberedelse teknik bør give sunde levedygtige celler, der ikke har en opsvulmede membran eller kerne (figur 1). Hvert trin i protokollen er vigtig for sundheden for væv og kvaliteten af optagelserne.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Evaluering af Synaptic mangfoldighed ved hjælp af hele-celle Patch-klemme Elektrofysiologi

Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere den funktionelle synaptic mangfoldighed ved hjælp af hele-celle patch klemme Elektrofysiologi i akut hjernen skiver.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

I hjernen danner et par neuroner ofte flere synaptiske kontakter, som kaldes synaptisk mangfoldighed. En præcis undersøgelse af synaptisk mangfoldighed kræver imidlertid teknisk udfordrende eksperimenter. Denne protokol beskriver en simpel metode til bruttovurdering af synaptisk mangfoldighed ved hjælp af helcelleplet-clamp elektrofysiologi.Denne metode kan anvendes på alle arter og hjerne område til at undersøge synaptisk mangfoldighed. Denne metode kræver grundlæggende færdigheder i helcelle patch-clamp elektrofysiologi. Det er afgørende for den nøjagtige fortolkning af dataene at opnå optagelser af høj kvalitet med lav og stabil adgangsmodstand.For at opnå helcellekonfiguration skal du placere optagepipetten lige over skiven og offsetpipettestrømen i spændingsklemmertilstanden. Påfør let positivt tryk på pipetten, og lås stophanen. Vælg derefter en sund celle med en intakt membran, og nærmer sig vævet med pipetten.Det positive tryk bør forårsage en mindre forstyrrelse på vævet. Langsomt bringe pipetten tættere på cellen i en diagonal bevægelse, indtil en lille smilehul er dannet på celleoverfladen. Slip derefter den positive tryklås.Cellen vil begynde at danne en sæl, og modstanden vil stige over en gigaohm. Hold cellen på minus 68 millivolt i spændingsklemmen. Derefter trækkes pipetten lidt væk fra cellen diagonalt for at fjerne overtrykket.Kompensere for den hurtige og langsomme pipette kapacitans. Påfør en kort sugning gennem røret forbundet til pipetteholderen for at bryde gennem cellen og opnå en helcellekonfiguration. Skift derefter til celletilstand på membrantestvinduet i en elektrofysiologidataopekøbs- og analysesoftware.Temperaturen af optagebadet ved 27 til 30 grader Celsius og strømningshastigheden på 1,5 til to milliliter i minuttet for efterfølgende forsøg. I en mangfoldighed synapse, en handling potentiale synkroniserer neurotransmitter frigivelse og genererer en større postsynaptisk strøm. Blokering af virkningspotentiale og calciumafhængig veskulær frigivelse med TTX og cadmium forhindrer den postsynaptiske aktuelle summation og reducerer amplituden.Når der ikke er nogen mangfoldighed, vil blokering af handlingspotentialet ikke ændre amplituden. I eksperiment et, at anslå mangfoldighed, holde cellen på minus 68 millivolt, mens perfusing det med lav-calcium aCSF. Optag de spontane EPSC'er i mindst fem minutter for at sikre en stabil basislinje.Dernæst tilføje 30 mikromolars 4-AP til aCSF at øge handling potentielle afhængige hændelser, og registrere spontane EPSCs i mindst 10 minutter for at opnå den fulde lægemiddeleffekt. Derefter tilsættes 0,5 mikromolatorer TTX og 10 mikromolars cadmium til aCSF med 4-AP, og optag miniature EPSCs i mindst 10 minutter. Til offlineanalyse skal du bruge det sidste minut af basislinjen umiddelbart før anvendelsen af 4-AP, det 10.I dette eksperiment, ekstracellulære calcium erstattes med strontium at desynkronisere frigivelsen af synaptiske vesikler. Hvis der er mangfoldighed til stede, bør dette derfor reducere amplituden af postsynaptiske strømme. I eksperiment to registreres spontane EPS'er i mindst fem minutter, mens cellen perfuser celle med normal calcium-aCSF.For at desynkronisere vesicle frigivelse, begynde perfusing cellen med strontium aCSF, og optage spontane EPSCs. For offline analyse, for at afgøre, om de store amplitude spontane EPS'er skyldes synkron frigivelse af vesikler, sammenligne det sidste minut af baseline til det 10. Mangfoldighed kan indebære multivesicular frigivelse, som forårsager højere neurotransmitter koncentration i den synaptiske kløft.Tilsætning af gamma-DGG, en lav-affinitet AMPA receptor antagonist, fører til mindre effektiv hæmning af større multiquantal sammenlignet med mindre uniquantal postsynaptiske strømme. Uden multivesicular frigivelse, vil gamma-DGG være lige så effektiv på større og mindre postsynaptiske strømme. I eksperiment tre, for at teste for multilær frigivelse, registrere spontane EPS'er i lav-calcium aCSF i mindst fem minutter.Tilføj 30 mikromolatorer 4-AP til aCSF gennem perfusion systemet. Optag de spontane EPS'er i mindst 10 minutter. Derefter tilsættes 200 mikromomolars gamma-DGG til aCSF med 4-AP, og optag de spontane EPSCs i mindst 10 minutter.Som et kontroleksperiment i en separat celle skal du gentage procedurerne, men anvende en lav koncentration af DNQX i stedet for gamma-DGG. For offline analyse, analysere sidste minut af hvert lægemiddel ansøgning. Byger af synaptisk aktivitet kan forbigående øge spontan handling potentielle fyring og frigive sandsynligheden for de stimulerede afferenter.Hvis neuroner udviser mangfoldighed, bør stigningen i handlingspotentialer forårsage en forbigående stigning i amplituden af postsynaptiske strømme. I eksperiment fire registreres spontane EPS'er i normal calcium-aCSF. For at øge action potentielle fyring, stimulere afferents ved hjælp af en monopolar glas elektrode fyldt med aCSF med en hastighed på 20 hertz i to sekunder, og gentag 10 gange med en inter-burst interval på 20 sekunder.Til analyse skal du bruge 5.000 millisekunder spontane EPS'er før den første stimulus som baseline og sammenligne med de 10 til 300 millisekunder spontane EPSCs efter den endelige stimulus. Derefter, tage den gennemsnitlige amplitude og frekvens ændring over 10 forsøg. Analysér spontane EPSCs og miniature EPS'er ved hjælp af et program, der registrerer og analyserer synaptiske strømme.Brug de foreslåede detektionsparametre og nonstop-analysefunktion til påvisning af AMPA-receptormedieret EPS'er. Scan hver optagelse manuelt for at sikre, at programmet registrerer hver hændelse nøjagtigt. Eksporter hændelsesdataene ved at kopiere dem til Udklipsholder, og indsæt dem i en datastyringssoftware.Dernæst beregne den gennemsnitlige frekvens og amplitude for hver lægemiddelbehandling, og udføre de relevante statistiske analyser. I et eksempel vist her, 4-AP øger både amplitude og hyppigheden af spontane EPSCs. Efterfølgende anvendelse af TTX og cadmium nedsætter både amplituden og frekvensen.Her er fordelingen af spontan EPSC amplitude fra optagelsen. I de hypothalamariske neuroner, der undersøges her, er amplituden og hyppigheden af baseline- og TTX-betingelserne de samme, hvilket tyder på, at de spontane EPSC'er med baseline indeholder meget få potentielle ePC'er, der er afhængige af virkningslinjen. Derfor kan efterfølgende forsøg sammenligne forskellen mellem baseline og 4-AP for at måle mangfoldighed.Styrken af synaptisk transmission kan forbigående øges ved byger af synaptisk aktivitet. For at undersøge mangfoldighed under mere fysiologiske forhold, afferent stimulation kan bruges til at øge action potentielle fyring og frigivelse sandsynlighed. Her er resuméerne af spontane EPSC frekvens og amplitude ændringer efter synaptisk stimulation.Stabile optagelser er afgørende for en nøjagtig fortolkning af dataene. Beskriv dataene, hvis adgangsmodstanden ændres med mere end 20 % under optagelsen, da dette kan forvirre analysen. Denne protokol tilbyder en enkel måde at vurdere synaptisk mangfoldighed, som er en vigtig faktor for synaptisk effekt og dens plasticitet i forskellige fysiologiske og patofysiologiske tilstande.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Dyrkning og Elektrofysiologi af celler på NRcC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Hele Cell Patch Clamp for Undersøgelse af mekanismerne i Infrarød Neural Stimulation

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

En computer-assisteret Multi-elektrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Helcelle-patch-clamp Optagelser fra Morphologically- og Neurochemically identificerede Hippocampale interneuroner

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-celle Patch-clamp Optagelser i Brain Skiver

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Whole-cell Patch-clamp optagelser til elektrofysiologisk bestemmelse af ion selektivitet i Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Skive Patch klemme teknik til at analysere læring-induceret plasticitet

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Auditive hjernestammen svar og ydre hår celle hele-celle Patch klemme optagelse i Postnatal rotter

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Præparater og protokoller for hele cellen Patch klemme optagelsen af Xenopus laevis Tectal neuroner

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Forberedelse af akut rygmarven skiver til hele-celle Patch-klemme optagelse i Substantia Gelatinosa neuroner

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...