Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

J.S. ontving Ontario Graduate beurs. Wi ontving een nieuwe detective Fellowship van geestelijke gezondheidsonderzoek Canada. Dit werk wordt ondersteund door de exploitatiesubsidies aan W.I van de natuurwetenschappen, Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) en de Canadian Institute voor gezondheidsonderzoek (PJT 148707).

Alle dierproeven worden goedgekeurd door het Comité Animal Care van de University of Western Ontario overeenkomstig de Canadese Raad op Animal Care Guidelines (AUP #2014-031).
1. oplossingen
<ol><li>
Snijden van oplossing
	<ol>
<li>Zie tabel 1 voor de samenstelling van de segmenteringshulplijnen oplossing.</li>
		<li>Een 20 x stamoplossing bereiden en op te slaan bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
		<li>Voor 1 x segmenteringshulplijnen oplossing, los va...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

Een belangrijke voorwaarde voor een succesvolle patch klem electrofysiologie experiment is het verkrijgen van gezonde segmenten/cellen. Ons beschreven protocol is geoptimaliseerd voor hypothalame segmenten die PVN neuronen bevatten. Andere hersenen gebieden mogelijk bewerkt oplossingen en snijden methoden21,22,23,24. Voor de opname, het is van cruciaal belang alleen te aanvaarden stabiele opnam...

Synaptische transmissie is een fundamenteel mechanisme voor de communicatie tussen de neuronen, en vandaar, hersenfunctie. Synaptische transmissie is ook labiele en haar werkzaamheid in een activiteit-afhankelijke manier zo goed zoals in reactie op f signalen1kunt wijzigen. Behandeling van synaptische functie is dus een belangrijke focus van het onderzoek neurowetenschap. Geheel-cel patch klem electrofysiologie is een veelzijdige techniek waarmee ons te begrijpen, bedenken experimentele designs en data-analyses, diepgaande biofysische en moleculaire mechanismen van synaptische transmissie. Een veel gebruikte aanpak, misschien vanwege de eenvoud van de techniek en concept, is het meten van miniatuur excitatory/remmende postsynaptisch stromen (mE / IPSCs) onder de spanning klem configuratie2,3, 4 , 5 , 6. afzonderlijke mPSCs vertegenwoordigen de stroom van ionen via postsynaptisch ionotropic receptoren (bijvoorbeeld AMPA en GABAA -receptoren) in reactie op de binding van hun respectieve neurotransmitters vrijgesteld van de presynaptische terminal 7 . Omdat de opname wordt verkregen in de aanwezigheid van de spanning-gated nb+ kanaal blocker tetrodotoxine (TTX), de release is actiepotentiaal-onafhankelijk en normaal impliceert een één synaptic blaasje met neurotransmitters. Op basis van deze veronderstelling, wordt de gemiddelde amplitude van de mPSCs veel gebruikt als een ruwe schatting voor de grootte van quantal, waarmee het aantal en de functionaliteit van postsynaptisch receptoren tegen een enkele release-site. Aan de andere kant, wordt de frequentie van de mPSCs geacht te vertegenwoordigen een combinatie van het totale aantal synapsen tot beëindiging op de postsynaptisch cel en de waarschijnlijkheid van hun gemiddelde release. Deze parameters meten echter niet een andere variabele-multiplicativity van synapsen of synaptic multipliciteit — dat is belangrijk voor de doeltreffendheid van synaptische transmissie.
Gebaseerd op de quantal theorie van synaptische transmissie7,8,9, de sterkte van een bepaalde verbinding tussen twee neuronen is afhankelijk van drie factoren: het aantal functionele synapsen (N), de postsynaptisch reactie op de release van een enkele synaptic blaasje (quantal grootte; Q) en de waarschijnlijkheid van neurotransmitter release (Pr). Synaptic multipliciteit is gelijk aan N. De ontwikkeling van synaptic multipliciteit of de sanering van de multiplicatieve synapsen is kunststof in ontwikkeling en in andere ziekte staten3,4,6,10. Om deze reden heeft karakteriseren van synaptic multipliciteit belangrijke implicaties voor het begrijpen van de werkzaamheid van synaptische transmissie bij gezondheid en ziekte. Technieken, zoals elektronenmicroscopie kunnen structurele bewijs van synaptic multipliciteit herkennen door het detecteren van meerdere synaptic contactpersonen die afkomstig zijn uit de dezelfde axon op de dezelfde postsynaptisch neuron11,12, 13,14. Deze structureel geïdentificeerde multisynapses kunnen echter functioneel stille15,16. Precieze functionele behandeling van N meebrengt dat technisch uitdagende elektrofysiologische benaderingen, zoals gepaarde geheel-cel opnames die vaststellen kunnen of een bepaalde verbinding meerdere functionele release sites heeft en minimale stimulatie benaderingen die gericht zijn op het werven van een enkele vermeende axon.
In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode voor het schatten van synaptic multipliciteit door het aannemen van een methode die oorspronkelijk ontwikkeld door Hsia et al.2. Deze techniek omvat het meten van de spontane PSC's (sPSCs) en mPSCs met behulp van geheel-cel patch klem electrofysiologie, waardoor we de mate van synaptic multipliciteit schatten van alle ingangen naar een bepaalde neuron.  Zoals eerder omschreven, synaptic multipliciteit het aantal synapsen tussen een bepaalde pre-en postsynaptisch neuron geeft. Als meerdere synapsen worden gerekruteerd in synchronie door een actiepotentiaal, zal er een hoge waarschijnlijkheid van temporele sommatie van individuele (d.w.z. quantal) PSC, het genereren van een grotere amplitude PSC.  In mPSC-opnamen (in welke actie potentials worden geblokkeerd door TTX), de waarschijnlijkheid van temporele sommatie van afzonderlijke (niet-synchrone) mPSCs is laag. Met behulp van deze grondgedachte, kan synaptic multipliciteit worden geschat door het vergelijken van de amplitude van de sPSC (met actiepotentiaal-afhankelijke versie) met de amplitude van de mPSC.
Onderzoek naar het bestaan van multipliciteit beschrijven we vier experimenten en hun analyses met behulp van glutamaterge EPSCs als voorbeeld. Dezelfde aanpak kan echter worden gebruikt voor de snelle toezending van de GABAergic/glycinergic (IPSCs). Een korte motivering van elk experiment wordt hieronder beschreven. Eerst, zoals hierboven uitgelegd, synaptic multipliciteit kan worden geschat door het vergelijken van de amplitude van de sEPSCs te mEPSCs. Er zijn twee vereisten voor deze aanpak; 1) presynaptische axonen moeten een voldoende aantal actie potentials brand tijdens de opname, en 2) Pr moet hoog zijn, zodat meerdere synapsen release neurotransmitter bij binnenkomst van een actiepotentiaal. Om aan deze eisen voldoen, worden sEPSCs eerst geregistreerd in lage Ca2 + kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF), en vervolgens opgenomen in de aanwezigheid van een lage concentratie van de K+ kanaal antagonist, 4-Aminopyridine (4-AP) toe actie potentiële afvuren en Pr. Actiepotentiaal afvuren wordt dan geblokkeerd door TTX en Pr daalde met een spanning-gated Ca2 + kanaal blocker Cd2 +. De amplitude van de sEPSCs (met 4AP) wordt vergeleken met die van mEPSC (met 4AP, TTX en Cd2 +). In het tweede experiment, is Ca2 + vervangen door mengsel Sr2 + in de aCSF te desynchronize blaasje release. Als Ca2 + vereist voor de synchrone release van blaasjes is, moet vervanging met Sr2 + de grote amplitude-sEPSCs die indicatief voor multipliciteit zijn elimineren. Ten derde, mechanistically, multipliciteit kan voortvloeien uit meerdere synaptic contactpersonen de dezelfde postsynaptisch neuron of multivesicular release (dat wil zeggen meerdere blaasjes vrijgegeven binnen een synaptic éénloket)17,18. Om te differentiëren tussen de twee soorten multipliciteit, het derde experiment maakt gebruik van een lage affiniteit, snelle distantieert concurrerende antagonist van AMPA receptoren, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , om te bepalen of grote sEPSC zijn het resultaat van de temporele sommatie van onafhankelijke synapsen of multivesicular release op een overlappende bevolking van postsynaptisch receptoren. Als de grote amplitude gebeurtenissen ontstaan uit multivesicular release, zullen γ-DGG minder effectief op remming van de grotere ten opzichte van kleinere sEPSCs, overwegende dat de grote sEPSCs die uit de tijdelijke sommatie van meerdere synaptic contactpersonen voortvloeien op dezelfde manier zal worden beïnvloed door Γ-DGG. In het vierde experiment, wordt een meer fysiologische methode gebruikt ter verbetering van de actiepotentiaal afvuren, namelijk afferent synaptic stimulatie. Uitbarstingen van synaptic activiteit kunnen Transient verhoging/vergemakkelijken de spontane actiepotentiaal afvuren en release kans de afferents gestimuleerd. Deze benadering biedt daarom multipliciteit om in een meer fysiologische manier te manifesteren.
Het volgende protocol beschrijft de methode voor het uitvoeren van deze experimenten in muis hypothalame weefsel. In het bijzonder worden corticotropin releasing hormoon (CRH) neuronen van de kern van de paraventricular van de hypothalamus (PVN) gebruikt. We beschrijven de procedures voor het uitvoeren van geheel-cel patch klem elektrofysiologie en de specifieke experimenten om te testen voor synaptic multipliciteit te verklaren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

In het centrale zenuwstelsel, een paar van neuronen vaak vormen meerdere synaptic contacten en/of functionele neurotransmitter release sites (synaptic multipliciteit). Synaptic multipliciteit is plastic en veranderingen in de gehele ontwikkeling en in de verschillende fysiologische omstandigheden, wordt een belangrijke determinant voor de werkzaamheid van synaptische transmissie. We schetsen hier, experimenten voor het inschatten van de mate van multipliciteit van synapsen eindigt op een bepaalde postsynaptisch neuron geheel-cel patch klem electrofysiologie met acute hersenen segmenten. Specifiek, wordt spanning-clamp opname gebruikt voor het vergelijken van het verschil tussen de amplitude van spontane excitatory postsynaptisch stromingen (sEPSCs) en miniatuur excitatory postsynaptisch stromingen (mEPSCs). De theorie achter deze methode is dat afferent "inputs" die veelheid vertonen grote, actiepotentiaal-afhankelijke sEPSCs als gevolg van de synchrone release die bij elke synaptic contactpersoon optreedt zal tonen. Daarentegen zal de actiepotentiaal-zelfstandige release (die asynchroon is) kleinere amplitude mEPSCs genereren. Dit artikel schetst een aantal experimenten en analyses te karakteriseren van het bestaan van synaptic multipliciteit en bespreekt de vereisten en beperkingen van de techniek. Deze techniek kan worden toegepast om te onderzoeken hoe verschillende gedrags-, farmacologische of milieu interventies in vivo invloed op de organisatie van synaptic contactpersonen in verschillende hersengebieden.

Het bovenstaande protocol beschrijft een methode voor het gebruik van geheel-cel patch klem electrofysiologie te onderzoeken van de mate van synaptic multipliciteit, met behulp van de muis hypothalame neuronen als voorbeeld. Dit segment voorbereiding techniek moet opleveren gezonde levensvatbare cellen die geen een gezwollen membraan of de nucleus (Figuur 1). Elke stap in het protocol is belangrijk voor de gezondheid van het weefsel en de kwaliteit van de opnamen.
<p ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Evaluatie van Synaptic multipliciteit met behulp van geheel-cel Patch-clamp electrofysiologie

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de functionele synaptic multipliciteit geheel-cel patch klem electrofysiologie met acute hersenen segmenten.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

In de hersenen vormen een paar neuronen vaak meerdere synaptische contacten, die synaptische multipliciteit worden genoemd. Echter, nauwkeurig onderzoek van synaptische multipliciteit vereist technisch uitdagende experimenten. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor grove schatting van synaptische multipliciteit met behulp van hele-cel patch-klem elektrofysiologie.Deze methode kan worden toegepast op elke soort en hersenen gebied om synaptische multipliciteit te onderzoeken. Deze methode vereist basisvaardigheden in hele-cel patch-clamp elektrofysiologie. Het verkrijgen van hoogwaardige opnames met een lage en stabiele toegangsweerstand is essentieel voor de nauwkeurige interpretatie van de gegevens.Om de hele celconfiguratie te verkrijgen, plaatst u de opnamepipet net boven het segment en offset pipetstroom in de spanningsklemmodus. Breng lichte positieve druk op de pipet aan en vergrendel de stopcock. Selecteer vervolgens een gezonde cel met een intact membraan en benader het weefsel met de pipet.De positieve druk moet een lichte verstoring van het weefsel veroorzaken. Breng de pipet langzaam dichter bij de cel in een diagonale beweging totdat een klein kuiltje wordt gevormd op het celoppervlak. Laat vervolgens het positieve drukslot los.De cel zal beginnen om een verbinding te vormen, en de weerstand zal toenemen boven een gigaohm. Houd de cel in spanningsklem op min 68 millivolt. Trek vervolgens de pipet diagonaal van de cel weg om overtollige druk te verwijderen.Compenseer de snelle en langzame pipetcapaciteit. Breng een korte zuigkracht aan door de buis die op de pipethouder is aangesloten om door de cel te breken en een geheelcellige configuratie te verkrijgen. Schakel vervolgens over naar de celmodus op het membraantestvenster in een software voor het verwerven en analyseren van elektrofysiologiegegevens.Houd de temperatuur van het opnamebad op 27 tot 30 graden Celsius en de stroomsnelheid op 1,5 tot twee milliliter per minuut voor latere experimenten. In een multipliciteit synaps, een actie potentieel synchroniseert neurotransmitter release en genereert een grotere postsynaptische stroom. Het blokkeren van actiepotentieel en calciumafhankelijke vesiculaire afgifte met TTX en cadmium voorkomt de postsynaptische stroomschomming en vermindert de amplitude.Wanneer er geen veelheid is, zal het blokkeren van actiepotentieel de amplitude niet veranderen. In experiment één, om multipliciteit te schatten, houdt de cel bij min 68 millivolt terwijl het met laag-calcium aCSF doordringt. Neem de spontane EPSCs gedurende ten minste vijf minuten op om een stabiele basislijn te garanderen.Voeg vervolgens 30 micromolars 4-AP toe aan het aCSF om potentiële gebeurtenissen te verhogen en neem spontane EPSCs gedurende ten minste 10 minuten op om het volledige medicijneffect te verkrijgen. Voeg vervolgens 0,5 micromolars TTX en 10 micromolars cadmium toe aan de aCSF met 4-AP en neem de miniatuur EPSCs minstens 10 minuten op. Voor offline analyse gebruikt u de laatste minuut van de basislijn vlak voor de toepassing van 4-AP, de 10e minuut van de 4-AP-toepassing en de 10e minuut van de TTX-toepassing.In dit experiment wordt extracellulair calcium vervangen door strontium om het vrijkomen van synaptische vikjes te desynchroniseren. Daarom, als multipliciteit aanwezig is, moet dit de amplitude van postsynaptische stromingen verminderen. In experiment twee, opnemen spontane EPSCs gedurende ten minste vijf minuten, terwijl perfusing de cel met normale calcium aCSF.Om vesicle-release te desynchroniseren, begint u met het doordrenen van de cel met strontium aCSF en neem u spontane EPSCs op. Voor offline analyse, om te bepalen of de grote amplitude spontane EPSCs zijn te wijten aan de synchrone release van vesicles, vergelijk de laatste minuut van de basislijn tot de 10e minuut van strontium aCSF applicatie. Multipliciteit kan multivesiculaire afgifte, die hogere neurotransmitter concentratie in de synaptische spleet veroorzaakt.Toevoeging van gamma-DGG, een low-affinity AMPA receptor antagonist, leidt tot minder effectieve remming van grotere multiquantal in vergelijking met kleinere uniquantal postsynaptische stromen. Zonder multivesiculaire release zal gamma-DGG even effectief zijn op grotere en kleinere postsynaptische stromingen. In experiment drie, om te testen op multivesiculaire release, opnemen spontane EPSCs in laag calcium aCSF gedurende ten minste vijf minuten.Voeg 30 micromolars 4-AP toe aan het aCSF via het perfusiesysteem. Neem de spontane EPSCs gedurende ten minste 10 minuten op. Voeg vervolgens 200 micromolars gamma-DGG toe aan de aCSF met 4-AP en neem de spontane EPSCs gedurende ten minste 10 minuten op.Herhaal als controle-experiment in een aparte cel de procedures, maar pas een lage concentratie van DNQX toe in plaats van gamma-DGG. Voor offline analyse analyseert u de laatste minuut van elke medicijntoepassing. Uitbarstingen van synaptische activiteit kunnen tijdelijk verhogen spontane actie potentiële vuren en release waarschijnlijkheid van de gestimuleerde afferents.Als neuronen vertonen multipliciteit, de toename van de actie potentialen moet leiden tot een tijdelijke toename van de amplitude van postsynaptische stromingen. In experiment vier, opnemen spontane EPSCs in normale calcium aCSF. Om het werkingspotentieel te verhogen, stimuleert u de afferents met behulp van een monopolaire glazen elektrode gevuld met aCSF met een snelheid van 20 hertz gedurende twee seconden en herhaal deze 10 keer met een inter-burst interval van 20 seconden.Voor analyse gebruikt u 5,000 milliseconden spontane EPSCs vóór de eerste stimulus als basislijn en vergelijk deze met de spontane EPSCs van 10 tot 300 milliseconden na de uiteindelijke stimulus. Neem vervolgens de gemiddelde amplitude en frequentieverandering over 10 proeven. Analyseer spontane EPSCs en miniatuur EPSCs met behulp van een programma dat synaptische stromen detecteert en analyseert.Gebruik de voorgestelde detectieparameters en non-stop analysefunctie voor het detecteren van AMPA-receptorgemedieerde EPSCs. Scan elke opname handmatig om ervoor te zorgen dat het programma elke gebeurtenis nauwkeurig detecteert. Exporteer de gebeurtenisgegevens door deze naar het klembord te kopiëren en plak deze in een gegevensbeheersoftware.Bereken vervolgens de gemiddelde frequentie en amplitude voor elke medicijnbehandeling en voer de relevante statistische analyses uit. In een voorbeeld dat hier wordt getoond, verhoogt 4-AP zowel de amplitude als de frequentie van spontane EPSCs. De latere toepassing van TTX en cadmium vermindert zowel de amplitude als de frequentie.Hier is de distributie van spontane EPSC amplitude van de opname. In de hier onderzochte hypothalamische neuronen zijn de amplitude en frequentie van de basislijn en TTX-omstandigheden hetzelfde, wat suggereert dat de spontane uitgangslijn EPSCs zeer weinig actiepotentieelafhankelijke EPSCs bevatten. Bijgevolg kunnen latere experimenten het verschil tussen baseline en 4-AP vergelijken om de veelheid te meten.De sterkte van synaptische transmissie kan tijdelijk worden verhoogd door uitbarstingen van synaptische activiteit. Om multipliciteit onder meer fysiologische omstandigheden te onderzoeken, kan afferente stimulatie worden gebruikt om de werking te verhogen potentiële vuren en release waarschijnlijkheid. Hier zijn de samenvattingen van spontane EPSC frequentie en amplitude veranderingen na synaptische stimulatie.Stabiele opnames zijn essentieel voor een nauwkeurige interpretatie van de gegevens. Beschrijf de gegevens als de toegangsweerstand tijdens de opname met meer dan 20% verandert, omdat dit de analyse kan verstoren. Dit protocol biedt een eenvoudige manier om synaptische multipliciteit te schatten, wat een belangrijke determinant is van synaptische werkzaamheid en de plasticiteit ervan in verschillende fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Kweken en Elektrofysiologie van cellen op NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Whole Cell Patch Clamp voor Onderzoek naar de mechanismen van Infrarood Neural Stimulatie

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Een Computer-assisted Multi-elektrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Whole-cell Patch-clamp opnames voor elektrofysiologische bepaling van de ion selectiviteit in channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Segment Patch-Clamp techniek voor het analyseren van leren-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Auditieve Brainstem Response en buitenste Haarcel geheel-cel Patch klem opname bij postnatale ratten

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparaten en protocollen voor de hele cel Patch klem opname van Xenopus laevis Tectal neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Voorbereiding van Acute ruggenmerg segmenten geheel-cel Patch-clamp opname in neuronen van de Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...