Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

J.S. a reçu des bourses d’études supérieures de l’Ontario. W.I. a reçu une nouvelle bourse de chercheur de recherche en santé mentale du Canada. Ce travail est soutenu par les subventions de fonctionnement à Florian de Sciences naturelles et génie conseil de recherches du Canada (06106-2015 RGPIN) et l’Institut canadien de recherche en santé (PJT 148707).

Toutes les expérimentations animales sont approuvées par le Comité de protection des animaux de l’Université de Western Ontario selon le Canadian Council on Animal Care Guidelines (PUA #2014-031).
1. les solutions
<ol><li>
Solution de tranchage
	<ol>
<li>Référer au tableau 1 pour la composition de la solution de tranchage.</li>
		<li>Préparer une solution 20 x à l’avance et les conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.</li>
		<li>Pour 1 x tranc...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

Une condition importante pour une expérience d’électrophysiologie de pince patch réussie est d’obtenir des tranches/cellules saines. Notre protocole décrit est optimisé pour les tranches hypothalamiques qui contiennent les neurones PVN. Autre cerveau peuvent exiger des zones modifiées solutions et méthodes tranchage21,22,23,24. Pour l’enregistrement, il est essentiel pour n’accep...

La transmission synaptique est un mécanisme fondamental pour la communication entre les neurones et donc fonction du cerveau. La transmission synaptique est aussi labile et peut changer son efficacité de manière dépendante de l’activité ainsi qu’en réponse à des signaux modulatory1. Ainsi, l’examen de la fonction synaptique a été un thème majeur de la recherche en neurosciences. Cellule entière patch clamp électrophysiologie est une technique polyvalente qui permet de comprendre, de concevoir des modèles expérimentaux et analyses de données, des mécanismes biophysiques et moléculaires approfondies de la transmission synaptique. Une approche couramment utilisée, peut-être en raison de la simplicité de la technique et le concept, est la mesure de courants postsynaptiques excitateurs/inhibiteur miniature (mE / CISP) sous la tension de la pince configuration2,3, 4 , 5 , 6. MPSC individuels représente le flux d’ions à travers des récepteurs ionotropiques postsynaptique (par exemple les récepteurs AMPA et GABAA ) en réponse à la fixation de leurs respectifs neurotransmetteurs libérés de la terminaison présynaptique 7 . Parce que l’enregistrement est obtenu en présence de la voltage-dépendants Na+ canal bloqueur tétrodotoxine (TTX), la libération est indépendant du potentiel d’action et comporte normalement une seule Vésicule synaptique qui contient des neurotransmetteurs. Selon cette hypothèse, l’amplitude moyenne du MPSC est employé couramment comme une estimation brute pour la taille quantique, qui représente le nombre et la fonctionnalité de récepteurs post-synaptiques s’opposant à un site de sortie du single. En revanche, la fréquence de la MPSC est considéré comme une combinaison du nombre de synapses se terminant sur la cellule postsynaptique et leur probabilité de sortie moyenne. Cependant, ces paramètres ne mesurent pas une autre variable-multiplicativity des synapses ou multiplicité synaptique — qui est important pour l’efficacité de la transmission synaptique.
Basé sur la théorie quantique de la transmission synaptique7,8,9, la force d’une connexion donnée entre une paire de neurones est tributaire de trois facteurs : le nombre de synapses fonctionnelles (N), le postsynaptique réaction à la publication d’une seule Vésicule synaptique (taille quantique ; Q) et la probabilité de la libération des neurotransmetteurs (P,r). Multiplicité de synaptique est équivalente à N. Le développement de la multiplicité synaptique ou l’élagage des synapses multiplicatifs est en plastique tout au long de l’élaboration et la maladie différents États3,4,6,10. Pour cette raison, caractérisant la multiplicité synaptique a des implications importantes pour la compréhension de l’efficacité de la transmission synaptique dans la santé et la maladie. Techniques, telles que la microscopie électronique peuvent d’identifier des preuves de structure synaptique multiplicité en détectant des contacts synaptiques multiples provenant de l’axone même sur le même neurone postsynaptique11,12, 13,14. Cependant, ces multisynapses structurellement identifiés peuvent être fonctionnellement silencieux15,16. Examen fonctionnel précis de N exige techniquement difficile des approches électrophysiologiques, tels que les enregistrements de cellules entières paires qui peuvent déterminer si une connexion donnée a plusieurs sites de rejet fonctionnelle et minimal approches de stimulation qui visent à recruter un seul axone putatif.
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple pour estimer la multiplicité synaptique en adoptant une méthode développée initialement par Hsia et al.,2. Cette technique consiste à mesurer la spontanée PSC (SLES SSP) et MPSC à l’aide d’électrophysiologie de cellules entières patch clamp, qui nous permet d’estimer le degré de multiplicité synaptique parmi toutes les entrées d’un neurone donné.  Tel que définie précédemment, synaptique multiplicité reflète le nombre de synapses entre un neurone donné en pré- et post-synaptiques. Si plusieurs synapses sont recrutés en même temps par un potentiel d’action, il y aura une forte probabilité de sommation temporelle des différents SSP (i.e. quantique), générant une plus grande amplitude CFP.  Dans les enregistrements de la mPSC (dans quels potentiels d’action sont bloqués par TTX), il est peu probable de sommation temporelle des individuels MPSC (non-synchrone). À l’aide de ce raisonnement, multiplicité synaptique peut être estimée en comparant l’amplitude sPSC (avec libération de potentiel d’action-dépendante) à l’amplitude de la mPSC.
Pour déterminer l’existence d’une multiplicité, les auteurs décrivent quatre expériences et leurs analyses utilisant glutamatergique EPSCs comme exemple. Cependant, la même approche peut être utilisée pour le jeûne transmission GABAergique/glycinergic (CISP). Une brève justification de chaque expérience est décrite ci-dessous. Tout d’abord, comme expliqué ci-dessus, multiplicité synaptique peut être estimée en comparant l’amplitude de sEPSCs à mEPSCs. Il existe deux conditions pour cette approche ; 1) présynaptiques axones doivent avoir un nombre suffisant de potentiels d’action pendant l’enregistrement, et 2) Pr doit être grande pour que plusieurs synapses libération neurotransmetteur à l’arrivée d’un potentiel d’action. Afin de répondre à ces exigences, sEPSCs sont pour la première fois en bas Ca2 + artificiel liquide céphalo-rachidien (aCSF) et ensuite enregistrées en présence d’une faible concentration de l’antagoniste des canaux K+ , 4-Aminopyridine (4-AP) pour augmenter l’action potentiel de tir et Pr. Puis, potentiel d’action tir est bloquée par la TTX et Pr diminué par un voltage-dépendants Ca2 + bloqueur des canaux Cd2 +. L’amplitude de sEPSCs (avec 4AP) est comparée à celle de Cpsem (avec 4AP, TTX et Cd2 +). Dans la seconde expérience, Ca2 + est remplacé par équimolaire Sr2 + dans le FSCA pour désynchroniser la libération des vésicules. Comme Ca2 + est nécessaire pour la version synchrone de vésicules, remplacement avec Sr2 + devrait éliminer le sEPSCs de grande amplitude qui témoignent de la multiplicité. En troisième lieu, mécaniquement, c’est la multiplicité peut résulter de multiples contacts synaptiques au même neurone postsynaptique ou libération multivésiculaires (c'est-à-dire plusieurs vésicules libérés au sein d’un même contact synaptique)17,18. Pour différencier les deux types de la multiplicité, la troisième expérience utilise une faible affinité, rapide dissociation antagoniste compétitif des récepteurs AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , afin de déterminer si grand sEPSC sont le résultat de la sommation temporelle des synapses indépendants ou libération multivésiculaires agissant sur une population qui se chevauchent de récepteurs post-synaptiques. Si les événements de grande amplitude résultent de la dissémination multivésiculaires, γ-DGG sera moins efficace pour inhiber les plus sEPSCs par rapport aux plus petits, tandis que le grand sEPSCs qui découlent de la sommation temporelle de plusieurs contacts synaptiques seront affectés de la même manière par Γ-DGG. Dans la quatrième expérience, une méthode plus physiologique est utilisée pour renforcer le potentiel d’action tir, à savoir afférente stimulation synaptique. Rafales de l’activité synaptique peuvent transitoirement augmentation/faciliter la probabilité de mise à feu et de la libération de potentiel d’action spontanée des afférences stimulées. Par conséquent, cette approche permet de multiplicité de manifester d’une manière plus physiologique.
Le protocole suivant décrit la méthode pour mener ces expériences en tissu hypothalamique de souris. Plus précisément, corticotropin libérant l’hormone (CRH) des neurones du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVN) sont utilisés. Nous décrivons les procédures pour la conduite d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp et expliquer les expériences spécifiques pour tester la multiplicité synaptique.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

Dans le système nerveux central, une paire de neurones forment souvent des multiples contacts synaptiques et/ou sites de libération neurotransmetteur fonctionnelle (multiplicité synaptique). Multiplicité synaptique est plastique et change au cours du développement et dans les conditions physiologiques différentes, étant un facteur déterminant pour l’efficacité de la transmission synaptique. Ici, nous exposons les expériences pour estimer le degré de multiplicité des synapses se terminant sur un neurone postsynaptique donné à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë. Plus précisément, enregistrement de voltage clamp est utilisé pour comparer la différence entre l’amplitude des courants postsynaptiques excitateurs spontanées (sEPSCs) et les courants postsynaptiques excitateurs miniature (mEPSCs). La théorie derrière cette méthode est que des entrées afférentes qui présentent une multiplicité montrera sEPSCs grande, dépendante du potentiel d’action en raison de la sortie synchrone qui survient à chaque contact synaptique. En revanche, libération de potentiel d’action indépendante (qui est asynchrone) générera plus petite amplitude mEPSCs. Cet article décrit un ensemble d’expériences et d’analyses pour caractériser l’existence d’une multiplicité synaptique et traite les exigences et les limites de la technique. Cette technique peut être appliquée afin d’étudier comment différentes interventions comportementales, pharmacologiques ou environnementales en vivo affectent l’organisation des contacts synaptiques dans certaines zones du cerveau différentes.

Le protocole ci-dessus décrit une méthode permettant d’utiliser électrophysiologie de germes entiers patch clamp pour examiner le degré de multiplicité synaptique, à l’aide de neurones hypothalamiques souris à titre d’exemple. Cette technique de préparation de tranche devrait produire des cellules viables en bonne santé qui n’ont pas une membrane gonflée ou noyau (Figure 1). Chaque étape du protocole est important pour la santé du tissu et la qualité ...

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Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de Patch-clamp de la cellule entière électrophysiologie

Nous présentons ici un protocole permettant d’évaluer la multiplicité synaptique fonctionnelle à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Dans le cerveau, une paire de neurones forment souvent de multiples contacts synaptiques, ce qu’on appelle la multiplicité synaptique. Cependant, l’examen précis de la multiplicité synaptique nécessite des expériences techniquement difficiles. Ce protocole décrit une méthode simple pour l’estimation brute de la multiplicité synaptique utilisant l’électrophysiologie de patch-clamp de cellule entière.Cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle espèce et région du cerveau pour étudier la multiplicité synaptique. Cette méthode exige des compétences de base en électrophysiologie patch-clamp à cellules entières. L’obtention d’enregistrements de haute qualité avec une résistance d’accès faible et stable est essentielle pour l’interprétation précise des données.Pour obtenir la configuration de cellule entière, placez la pipette d’enregistrement juste au-dessus de la tranche et compensez le courant de pipette dans le mode de pince de tension. Appliquez une légère pression positive sur la pipette et verrouillez le robinet d’arrêt. Ensuite, choisissez une cellule saine avec une membrane intacte, et approchez le tissu avec la pipette.La pression positive devrait causer une légère perturbation sur le tissu. Rapprochez lentement la pipette de la cellule en diagonale jusqu’à ce qu’une petite fossette soit formée à la surface de la cellule. Ensuite, relâchez le verrou de pression positive.La cellule commencera à former un joint, et la résistance augmentera au-dessus d’un gigaohm. Dans la pince de tension, maintenez la cellule à moins 68 millivolts. Par la suite, retirez légèrement la pipette de la cellule en diagonale pour enlever l’excès de pression.Compensez la capacité rapide et lente de pipette. Appliquez une brève aspiration à travers le tube relié au support pipette pour percer la cellule et obtenir une configuration de cellule entière. Ensuite, passez en mode cellulaire sur la fenêtre de test membranaire dans un logiciel d’acquisition et d’analyse de données d’électrophysiologie.Maintenir la température du bain d’enregistrement à 27 à 30 degrés Celsius et le débit à 1,5 à 2 millilitres par minute pour les expériences subséquentes. Dans une synapse de multiplicité, un potentiel d’action synchronise la libération de neurotransmetteur et génère un courant postsynaptique plus grand. Le blocage du potentiel d’action et de la libération vésiculaire dépendante du calcium avec TTX et cadmium empêche la summation du courant postsynaptique et diminue l’amplitude.Lorsqu’il n’y a pas de multiplicité, le potentiel d’action de blocage ne changera pas l’amplitude. Dans l’expérience 1, pour estimer la multiplicité, maintenez la cellule à moins 68 millivolts tout en la perfusant avec l’aCSF à faible teneur en calcium. Enregistrez les CPE spontanés pendant au moins cinq minutes pour assurer une base de référence stable.Ensuite, ajoutez 30 micromolaires 4-AP à l’ACSF pour augmenter les événements d’action dépendant du potentiel, et enregistrez les CPE spontanés pendant au moins 10 minutes pour obtenir l’effet médicamentif complet. Ensuite, ajoutez 0,5 micromolaires TTX et 10 micromolaires cadmium à l’aCSF avec 4-AP, et enregistrez les CPE miniatures pendant au moins 10 minutes. Pour l’analyse hors ligne, utilisez la dernière minute de base juste avant l’application de 4-AP, la 10ème minute de l’application 4-AP, et la 10ème minute de l’application TTX.Dans cette expérience, le calcium extracellulaire est remplacé par du strontium pour désynchroniser la libération de vésicules synaptiques. Par conséquent, si la multiplicité est présente, cela devrait diminuer l’amplitude des courants postsynaptiques. Dans l’expérience deux, enregistrez les CPE spontanés pendant au moins cinq minutes tout en perfusant la cellule avec l’ACSF normal de calcium.Pour désynchroniser la libération vésicule, commencer à perfuser la cellule avec strontium aCSF, et enregistrer les EPSC spontanés. Pour l’analyse hors ligne, pour déterminer si les EPSC spontanés de grande amplitude sont dus à la libération synchrone des vésicules, comparez la dernière minute de ligne de base à la 10ème minute de l’application d’aCSF de strontium. La multiplicité peut impliquer la libération multivesicular, qui cause la concentration plus élevée de neurotransmetteur dans la fente synaptique.L’ajout de gamma-DGG, un antagoniste des récepteurs AMPA de faible affinité, conduit à une inhibition moins efficace de plus grand multiquantal par rapport aux petits courants postsynaptiques uniquantaux. Sans libération multivéhiculaire, gamma-DGG sera tout aussi efficace sur les courants postsynaptiques de plus en plus petits. Dans l’expérience trois, pour tester la libération multivesicular, enregistrez les EPSCs spontanés dans l’ACSF à faible teneur en calcium pendant au moins cinq minutes.Ajouter 30 micromolaires 4-AP à l’aCSF par le système de perfusion. Enregistrez les CPE spontanés pendant au moins 10 minutes. Ensuite, ajoutez 200 micromolaires gamma-DGG à l’aCSF avec 4-AP, et enregistrez les EPSC spontanés pendant au moins 10 minutes.Comme une expérience de contrôle dans une cellule séparée, répéter les procédures, mais appliquer une faible concentration de DNQX au lieu de gamma-DGG. Pour une analyse hors ligne, analyser la dernière minute de chaque demande de médicament. Les éclats d’activité synaptique peuvent augmenter transitoirement le potentiel d’action spontanée de tir et libérer la probabilité des afferents stimulés.Si les neurones présentent une multiplicité, l’augmentation des potentiels d’action devrait provoquer une augmentation transitoire de l’amplitude des courants postsynaptiques. Dans l’expérience quatre, enregistrez les CPE spontanés dans l’ACSF normal de calcium. Pour augmenter le tir potentiel d’action, stimulez les afferents à l’aide d’une électrode de verre monopolisaire remplie d’aCSF à raison de 20 hertz pendant deux secondes, et répétez 10 fois avec un intervalle inter-rafale de 20 secondes.Pour analyse, utilisez 5000 millisecondes d’EPSC spontanés avant le premier stimulus comme base et comparez aux CPE spontanés de 10 à 300 millisecondes après le stimulus final. Ensuite, prenez l’amplitude moyenne et le changement de fréquence sur 10 essais. Analyser les CPE spontanés et les CPE miniatures à l’aide d’un programme qui détecte et analyse les courants synaptiques.Utilisez les paramètres de détection suggérés et la fonction d’analyse non-stop pour détecter les CPE à base de récepteurs AMPA. Numérisez manuellement chaque enregistrement pour vous assurer que le programme détecte avec précision chaque événement. Exportez les données de l’événement en les copiant sur le presse-papiers et les coller dans un logiciel de gestion de données.Ensuite, calculez la fréquence moyenne et l’amplitude pour chaque traitement médicamenteux et effectuez les analyses statistiques pertinentes. Dans un exemple montré ici, 4-AP augmente à la fois l’amplitude et la fréquence des EPSC spontanés. L’application subséquente de TTX et de cadmium diminue à la fois l’amplitude et la fréquence.Voici la distribution de l’amplitude spontanée epsc de l’enregistrement. Dans les neurones hypothalamiques examinés ici, l’amplitude et la fréquence des conditions de ligne de base et de TTX sont les mêmes, suggérant que les EPSC spontanés de ligne de base contiennent très peu d’EPSCs potentiel-dépendants d’action. Par conséquent, les expériences subséquentes peuvent comparer la différence entre la ligne de base et 4-AP pour mesurer la multiplicité.La force de la transmission synaptique peut être transitoirement augmentée par des éclats d’activité synaptique. Pour étudier la multiplicité dans des conditions plus physiologiques, une stimulation afferent peut être utilisée pour augmenter la probabilité de tir potentiel d’action et de libération. Voici les résumés des changements spontanés de fréquence et d’amplitude d’EPSC suivant la stimulation synaptique.Des enregistrements stables sont essentiels à une interprétation précise des données. Décrivez les données si la résistance à l’accès change de plus de 20 % au cours de l’enregistrement, car cela pourrait confondre l’analyse. Ce protocole offre un moyen simple d’estimer la multiplicité synaptique, qui est un déterminant clé de l’efficacité synaptique et de sa plasticité dans différentes conditions physiologiques et pathophysiologiques.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

La culture et l&#39;électrophysiologie des cellules sur la SCGDV de patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Recherche

Neurosciences

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Whole Patch Clamp cellulaire pour étudier les mécanismes de la stimulation neurale infrarouge

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Un multi-électrode système de patch-clamp assistée par ordinateur

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Enregistrements de patch-clamp à cellules entières pour la détermination électrophysiologique de la sélectivité ionique dans les canarhodopsines

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Tranche Patch Clamp Technique d’analyse de plasticité induite par l’apprentissage

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Réponse auditif du tronc cérébral et des cellules ciliées externes Whole-cell Patch Clamp enregistrement chez le rat Postnatal

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Préparations et protocoles pour toute cellule Patch Clamp enregistrement des neurones Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...