Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
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J.s. erhielt Ontario Graduate Stipendium. W.I Stipendium ein neue Ermittler aus Mental Health Research Kanada. Diese Arbeit wird unterstützt durch Betriebskostenzuschüsse, Wi aus den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) und des Canadian Institute for Health Research (PJT 148707).

Alle Tierversuche werden von Animal Care Committee der University of Western Ontario im Einklang mit dem Canadian Council über Animal Care Leitlinien (AUP #2014-031) genehmigt.
(1) Lösungen
<ol><li>
Slicing Lösung
	<ol>
<li>Die Zusammensetzung der Slice-Lösung finden Sie unter Tabelle 1 .</li>
		<li>Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
		<li>Lösen Sie für 1 X Schneid-Lösung Nahco3<su...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. 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L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

Eine wichtige Voraussetzung für eine erfolgreiche Patch Clamp Elektrophysiologie Experiment ist gesunde Scheiben/Zellen erhalten. Unsere beschriebenen Protokoll ist optimiert für Hypothalamus Scheiben, die PVN Neuronen enthalten. Anderen Gehirn benötigten Bereichen modifizierte Lösungen und slicing Methoden21,22,23,24. Für die Aufnahme ist es wichtig, stabile Aufnahmen akzeptieren nur durc...

Synaptische Übertragung ist ein grundlegender Mechanismus für die Kommunikation zwischen den Neuronen, und daher Gehirnfunktion. Synaptische Übertragung ist auch labil und kann seine Wirksamkeit eine aktivitätsabhängige ebenso wie in Reaktion auf modulierende Signale1ändern. So wurde das synaptischen Funktion untersuchen ein Schlüsselfokus der neurowissenschaftlichen Forschung. Ganze Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie ist eine vielseitige Technik, die uns zu verstehen, durch Erarbeitung experimenteller Designs und Datenanalysen, detaillierte biophysikalische und molekulare Mechanismen der synaptischen Übertragung ermöglicht. Ein häufig verwendeter Ansatz vielleicht aufgrund der Einfachheit der Technik und Konzept, ist die Messung der Miniatur exzitatorischen/inhibitorischen postsynaptischen Ströme (mE / IPSCs) unter Spannung Klemme Konfiguration2,3, 4 , 5 , 6. einzelne mPSCs repräsentieren den Fluss von Ionen durch Ionotropic postsynaptischen Rezeptoren (z. B. AMPA und GABA-A -Rezeptoren) in Reaktion auf die Bindung von ihren jeweiligen Neurotransmitter aus den präsynaptischen Terminal 7 freigegeben . Da die Aufnahme im Beisein der Voltage-gated Na+ -Kanal-Blocker Tetrodotoxin (TTX) vorliegt, das Release ist Aktionspotential-unabhängig und beinhaltet normalerweise eine einzelne synaptische Vesikel, die Neurotransmitter enthält. Ausgehend von dieser Annahme, ist die durchschnittliche Amplitude der mPSCs allgemein als grobe Schätzung für die Quanten Größe verwendet, die steht für die Anzahl und die Funktionalität der postsynaptischen Rezeptoren gegen eine single-Auskopplung-Website. Auf der anderen Seite gilt als die Frequenz des mPSCs, eine Kombination aus der Gesamtzahl der Synapsen auf der postsynaptischen Zelle und Eintrittswahrscheinlichkeit durchschnittliche Freigabe beenden zu vertreten. Diese Parameter messen jedoch nicht eine weitere Variable Multiplicativity von Synapsen und synaptische Vielfalt – das ist wichtig für die Effizienz der synaptischen Übertragung.
Basierend auf der Quanten Theorie der synaptischen Übertragung7,8,9, die Stärke einer gegebenen Verbindung zwischen zwei Neuronen ist abhängig von drei Faktoren: die Anzahl der funktionellen Synapsen (N), die postsynaptischen Reaktion auf die Veröffentlichung einer einzigen synaptischen Vesikel (Quanten Größe; Q) und die Wahrscheinlichkeit der Freisetzung von Neurotransmittern (P-R). Synaptische Multiplizität ist äquivalent zu N. Die Entwicklung der synaptischen Vielheit oder das Beschneiden der multiplikativen Synapsen ist Kunststoff während der Entwicklung und in anderen Krankheit Staaten3,4,6,10. Aus diesem Grund hat Charakterisierung synaptischen Vielzahl wichtige Implikationen für die Effizienz der synaptischen Übertragung in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Techniken, wie z. B. Elektronenmikroskopie können strukturelle Beweise der synaptischen Multiplizität identifizieren, indem er erkennt mehrere synaptischen Kontakte mit Ursprung aus dem gleichen Axon auf der gleichen postsynaptischen Neuron-11,12, 13,14. Diese strukturell identifizierten Multisynapses kann jedoch funktional Stille15,16. Genaue funktionelle Untersuchung des N erfordert technisch anspruchsvolle elektrophysiologische Ansätze wie gekoppelten ganz-Zell-Aufnahmen, die erkennen, ob eine bestimmte Verbindung mehrerer Standorte der funktionalen Release hat und minimale Stimulation-Ansätze, die darauf abzielen, ein einziges vermeintliche Axon zu rekrutieren.
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für die Schätzung der synaptischen Vielfalt durch die Annahme einer Methode, die ursprünglich von Hsia Et al.2entwickelt. Diese Technik beinhaltet die Messung der spontanen PSCs (sPSCs) und mPSCs mit ganze Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie, was uns erlaubt, die Schätzung des synaptischen Vielfalt über alle Eingaben für ein bestimmtes Neuron.  Da zuvor definierten, synaptische Mannigfaltigkeit die Anzahl der Synapsen zwischen eines bestimmten Prä- und postsynaptischen Neurons widerspiegelt. Wenn mehrere Synapsen synchron durch ein Aktionspotential rekrutiert werden, werden mit hoher Wahrscheinlichkeit zeitliche Summierung der einzelnen (d.h. Quanten) EAP, erzeugen eine größere Amplitude PSC.  MPSC Aufnahmen (in denen Aktionspotentiale durch TTX blockiert sind), die Wahrscheinlichkeit der zeitliche Summierung der einzelnen (nicht-synchrone) mPSCs ist gering. Mit dieser Begründung, werden synaptische Multiplizität abgeschätzt durch den Vergleich der sPSC Amplitude (mit Aktionspotential-abhängige Version) auf die mPSC Amplitude.
Um die Existenz der Multiplizität untersuchen beschreiben wir vier Experimente und ihre Analysen mit glutamatergen EPSCs als Beispiel. Jedoch kann der gleiche Ansatz verwendet werden, für die schnelle Übertragung der GABAergen/glycinergen (IPSCs). Eine kurze Begründung für jedes Experiment wird nachfolgend beschrieben. Zunächst, wie oben erläutert, synaptische Multiplizität abgeschätzt werden durch den Vergleich der Amplitude der sEPSCs zu mEPSCs. Es gibt zwei Anforderungen für diesen Ansatz; (1) präsynaptischen Axone müssen eine ausreichende Anzahl von Aktionspotentialen Feuer, während der Aufnahme, und (2) PR muss hoch sein, so dass mehrere Synapsen Neurotransmitter bei der Ankunft ein Aktionspotenzial freigeben. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, sEPSCs sind zuerst aufgenommen in niedrigen Ca2 + künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS), und dann in der Gegenwart eine niedrige Konzentration von K+ -Kanal-Antagonisten, 4-Aminopyridine (4-AP) Aktion erhöhen möglichen Zündung und PR. Dann feuern Aktionspotential TTX und Pr sank um ein Voltage-gated Ca2 + -Kanal-Blocker Cd2 +wehrt. Die Amplitude der sEPSCs (mit 4AP) ist im Vergleich zu der mEPSC (mit 4AP, TTX und Cd2 +). Im zweiten Experiment ist Ca2 + äquimolaren Sr2 + in der ACFS, Vesikel Release Synchronisierung abgelöst. Als Ca2 + für die synchrone Version von Vesikeln erforderlich ist, sollte Ersatz mit Sr2 + großer Amplitude sEPSCs beseitigen, die Vielheit bezeichnend sind. Drittens, mechanistisch, Multiplizität kann ergeben sich aus entweder mehrere synaptischen Kontakte gleichen postsynaptischen Neuron oder multivesicular Version (d. h. mehrere Bläschen innerhalb einer einzigen synaptischen Kontakt freigegeben)17,18. Um zwischen den beiden Arten der Vielheit zu unterscheiden, verwendet das dritte Experiment eine geringe Affinität, schnelle trennendem kompetitiver Antagonist des AMPA-Rezeptoren, γ-D-Glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , um festzustellen, ob groß sEPSC sind das Ergebnis der zeitliche Summation der unabhängigen Synapsen oder multivesicular Version, die auf einer überlappenden Bevölkerung der postsynaptischen Rezeptoren. Im Falle großer Amplitude Veranstaltungen von multivesicular Release werden γ-DGG weniger effektiv bei der Hemmung größer im Vergleich zu kleineren sEPSCs während der großen sEPSCs, die durch die zeitliche Summierung von mehreren synaptischen Kontakte entstehen in ähnlicher Weise betroffen sind Γ-DGG. Im vierten Versuch ist eine physiologische Methode zum Aktionspotential brennen, nämlich afferenten synaptic Stimulation zu erhöhen. Platzt der synaptischen Aktivität können vorübergehend erhöhen/die spontane Aktionspotential abfeuern und Freigabe Wahrscheinlichkeit angeregten Afferenzen erleichtern. Dieser Ansatz ermöglicht daher Multiplizität in physiologischer Weise manifestieren.
Das folgende Protokoll beschreibt die Methode für die Durchführung dieser Experimente im Hypothalamus Gewebe Maus. Insbesondere werden Corticotropin releasing Hormon (CRH) Neuronen des Nucleus paraventrikulären des Hypothalamus (PVN) verwendet. Wir beschreiben die Verfahren für die Durchführung der gesamten Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie und erläutern die spezifischen Experimente für synaptische Vielheit zu testen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

In das zentrale Nervensystem bilden ein paar Neuronen oft mehrere synaptischen Kontakte und/oder funktionalen Neurotransmitter Freisetzungsstandorten (synaptische Multiplizität). Synaptische Vielheit ist aus Kunststoff und Änderungen während der Entwicklung und in verschiedenen physiologischen Bedingungen, wird ein wichtiger Faktor für die Effizienz der synaptischen Übertragung. Hier erläutern wir Experimente für die Schätzung des Grades der Vielzahl von Synapsen auf einen bestimmten postsynaptischen Neuron mit ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten zu beenden. Insbesondere ist Voltage-Clamp-Aufnahme verwendet, um die Differenz zwischen der Amplitude des spontanen exzitatorischen postsynaptischen Ströme (sEPSCs) und Miniatur exzitatorischen postsynaptischen Ströme (mEPSCs) zu vergleichen. Die Theorie hinter dieser Methode ist, dass afferenten Inputs, die Vielfalt zu zeigen große, Aktionspotential-abhängigen sEPSCs durch die synchrone Version angezeigt werden, die bei jedem synaptischen Kontakt auftritt. Im Gegensatz dazu wird Aktionspotential-unabhängige Version (das asynchrone) kleiner Amplitude mEPSCs generieren. Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Experimenten und Analysen, die Existenz der synaptischen Vielheit zu charakterisieren und beschreibt die Anforderungen und Grenzen der Technik. Diese Technik kann angewendet werden, wie verschiedene Verhaltensstörungen, pharmakologische oder ökologischen Eingriffe in Vivo betreffen die Organisation der synaptischen Kontakte in verschiedenen Gehirnregionen zu untersuchen.

Das obige Protokoll beschreibt eine Methode für die Verwendung von ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie, um den Grad der synaptischen Vielfältigkeit, mit der Maus Hypothalamus Neuronen als Beispiel zu untersuchen. Diese Scheibe Präparationstechnik sollte gesunde vitaler Zellen ergeben, die nicht über eine geschwollene Membran oder Kern (Abbildung 1). Jeder Schritt im Protokoll ist wichtig für die Gesundheit des Gewebes und der Qualität der Aufnahmen.
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Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Bewertung der synaptischen Multiplizität mit Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Beurteilung der funktionalen synaptischen Mannigfaltigkeit mit ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Im Gehirn bilden ein Paar Von Neuronen oft mehrere synaptische Kontakte, die als synaptische Multiplizität bezeichnet wird. Eine genaue Untersuchung der synaptischen Vielfältigkeit erfordert jedoch technisch anspruchsvolle Experimente. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur groben Abschätzung der synaptischen Multiplizität mit Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie.Diese Methode kann auf jede Art und Gehirnbereich angewendet werden, um synaptische Vielfalt zu untersuchen. Diese Methode erfordert Grundfertigkeiten in der Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Die Beschaffung hochwertiger Aufnahmen mit geringem und stabilem Zugriffswiderstand ist für die genaue Interpretation der Daten von entscheidender Bedeutung.Um eine Ganzzellenkonfiguration zu erhalten, legen Sie die Aufnahmepipette knapp über der Scheibe und den Offsetpipettenstrom in den Spannungsklemmenmodus. Tragen Sie leichten positiven Druck auf die Pipette auf, und verriegeln Sie den Hahn. Wählen Sie als Nächstes eine gesunde Zelle mit einer intakten Membran aus und nähern Sie sich mit der Pipette dem Gewebe.Der positive Druck sollte eine leichte Störung des Gewebes verursachen. Bringen Sie die Pipette in einer diagonalen Bewegung langsam näher an die Zelle heran, bis sich auf der Zelloberfläche ein kleines Grübchen bildet. Lösen Sie dann die positive Drucksperre.Die Zelle beginnt, eine Dichtung zu bilden, und der Widerstand wird über einem Gigaohm steigen. In Spannungsklemme halten Sie die Zelle bei minus 68 Millivolt. Ziehen Sie anschließend die Pipette leicht diagonal von der Zelle weg, um überdendruckbaren Druck zu entfernen.Kompensieren Sie die schnelle und langsame Pipettenkapazität. Tragen Sie eine kurze Absaugung durch das Rohr auf, das mit dem Pipettenhalter verbunden ist, um die Zelle zu durchbrechen und eine Ganzzellkonfiguration zu erhalten. Wechseln Sie dann in einer elektrophysiologischen Datenerfassungs- und Analysesoftware in den Zellmodus im Membrantestfenster.Halten Sie die Temperatur des Aufnahmebades bei 27 bis 30 Grad Celsius und die Durchflussrate bei 1,5 bis zwei Milliliter pro Minute für nachfolgende Experimente. In einer Multiplizitätssynapse synchronisiert ein Aktionspotenzial die Freisetzung von Neurotransmittern und erzeugt einen größeren postsynaptischen Strom. Blockierendes Wirkungspotenzial und kalziumabhängige vesikuläre Freisetzung mit TTX und Cadmium verhindert die postsynaptische Stromsumsumation und verringert die Amplitude.Wenn es keine Multiplizität gibt, ändert das Blockieren des Aktionspotenzials die Amplitude nicht. In Experiment eins, um die Multiplizität zu schätzen, halten Sie die Zelle bei minus 68 Millivolt, während Sie sie mit niedrigem Kalzium-aCSF durchdringen. Zeichnen Sie die spontanen EPSCs für mindestens fünf Minuten auf, um eine stabile Ausgangsbasis zu gewährleisten.Als nächstes fügen Sie 30 Mikromolaren 4-AP zum aCSF hinzu, um handlungspotentialabhängige Ereignisse zu erhöhen, und zeichnen Sie spontane EPSCs für mindestens 10 Minuten auf, um die volle Arzneimittelwirkung zu erzielen. Fügen Sie dann 0,5 Mikromolaren TTX und 10 Mikromolaren Cadmium zum aCSF mit 4-AP hinzu und nehmen Sie die Miniatur-EPSCs für mindestens 10 Minuten auf. Für die Offline-Analyse verwenden Sie die letzte 1 Minute der Baseline unmittelbar vor der Anwendung von 4-AP, die 10. Minute der 4-AP-Anwendung und die 10. Minute der TTX-Anwendung.In diesem Experiment wird extrazelluläres Kalzium durch Strontium ersetzt, um die Freisetzung synaptischer Vesikel zu desynchronisieren. Wenn eine Multiplizität vorhanden ist, sollte dies daher die Amplitude postsynaptischer Ströme verringern. In Experiment zwei nehmen Sie spontane EPSCs für mindestens fünf Minuten auf, während sie die Zelle mit normalem Kalzium aCSF durchdringen.Um die Freisetzung von Vesikel zu desynchronisieren, beginnen Sie mit der Durchlässigung der Zelle mit Strontium aCSF und nehmen Sie spontane EPSCs auf. Um zu ermitteln, ob die spontanen EPSCs mit großer Amplitude auf die synchrone Freisetzung von Vesikeln zurückzuführen sind, vergleichen Sie die letzte Minute der Baseline mit der 10. Minute der Strontium-aCSF-Anwendung. Die Multiplizität kann eine multivesikuläre Freisetzung beinhalten, die eine höhere Neurotransmitterkonzentration in der synaptischen Spalte verursacht.Die Zugabe von Gamma-DGG, einem AMPA-Rezeptor-Antagonisten mit geringer Affinität, führt zu einer weniger wirksamen Hemmung größerer multiquantaler Ströme im Vergleich zu kleineren uniquantalen postsynaptischen Strömen. Ohne multivesikuläre Freisetzung wird Gamma-DGG bei größeren und kleineren postsynaptischen Strömen gleichermaßen wirksam sein. In Experiment drei, um die multivesikuläre Freisetzung zu testen, nehmen Sie spontane EPSCs in low-calcium aCSF für mindestens fünf Minuten auf.Fügen Sie 30 Mikromolaren 4-AP über das Perfusionssystem zum aCSF hinzu. Nehmen Sie die spontanen EPSCs für mindestens 10 Minuten auf. Fügen Sie dann 200 Mikromolaren Gamma-DGG zum aCSF mit 4-AP hinzu und zeichnen Sie die spontanen EPSCs für mindestens 10 Minuten auf.Als Kontrollexperiment in einer separaten Zelle wiederholen Sie die Prozeduren, wenden jedoch eine niedrige Konzentration von DNQX anstelle von Gamma-DGG an. Für die Offline-Analyse, analysieren Sie die letzte Minute jeder Anwendung. Ausbrüche synaptischer Aktivität können vorübergehend spontane Aktionspotenziale erhöhen, die die Wahrscheinlichkeit der stimulierten Afferents auslösen und loslassen.Wenn Neuronen eine Vielzahl aufweisen, sollte die Zunahme der Aktionspotentiale zu einer vorübergehenden Erhöhung der Amplitude postsynaptischer Ströme führen. In Experiment vier nehmen Sie spontane EPSCs in normalem Kalzium-aCSF auf. Um das Wirkungspotenzial zu erhöhen, stimulieren Sie die Afferents mit einer monopolaren Glaselektrode, die mit einer CSF-Rate von 20 Hertz für zwei Sekunden gefüllt ist, und wiederholen Sie 10 Mal mit einem Inter-Burst-Intervall von 20 Sekunden.Verwenden Sie für die Analyse 5.000 Millisekunden spontane EPSCs vor dem ersten Stimulus als Basiswert und vergleichen Sie die spontanen EPSCs von 10 bis 300 Millisekunden nach dem endgültigen Stimulus. Nehmen Sie dann die durchschnittliche Amplitude und Frequenzänderung über 10 Versuche. Analysieren Sie spontane EPSCs und Miniatur-EPSCs mit einem Programm, das synaptische Ströme erkennt und analysiert.Verwenden Sie die vorgeschlagenen Erkennungsparameter und die Nonstop-Analysefunktion, um AMPA-Rezeptor-vermittelte EPSCs zu erkennen. Scannen Sie jede Aufzeichnung manuell, um sicherzustellen, dass das Programm jedes Ereignis genau erkennt. Exportieren Sie die Ereignisdaten, indem Sie sie in die Zwischenablage kopieren, und fügen Sie sie in eine Datenverwaltungssoftware ein.Als Nächstes berechnen Sie die durchschnittliche Häufigkeit und Amplitude für jede medikamentöse Behandlung und führen Die relevanten statistischen Analysen durch. In einem hier gezeigten Beispiel erhöht 4-AP sowohl die Amplitude als auch die Frequenz spontaner EPSCs. Die nachfolgende Anwendung von TTX und Cadmium verringert sowohl die Amplitude als auch die Frequenz.Hier ist die Verteilung der spontanen EPSC-Amplitude aus der Aufnahme. In den hier untersuchten hypothalamischen Neuronen sind die Amplitude und Häufigkeit der Ausgangs- und TTX-Bedingungen identisch, was darauf hindeutet, dass die spontanen Basis-EPSCs nur sehr wenige handlungspotentialabhängige EPSCs enthalten. Dementsprechend können nachfolgende Experimente die Differenz zwischen Baseline und 4-AP vergleichen, um die Multiplizität zu messen.Die Stärke der synaptischen Übertragung kann vorübergehend durch Ausbrüche der synaptischen Aktivität erhöht werden. Um die Multiplizität unter physiologischeren Bedingungen zu untersuchen, kann eine afferent Stimulation verwendet werden, um die potenzielle Abschuss- und Freisetzungswahrscheinlichkeit der Wirkung zu erhöhen. Hier sind die Zusammenfassungen der spontanen EPSC-Frequenz- und Amplitudenänderungen nach synaptischer Stimulation.Stabile Aufnahmen sind für eine genaue Interpretation der Daten unerlässlich. Beschreiben Sie die Daten, wenn sich der Zugriffswiderstand während der Aufzeichnung um mehr als 20 % ändert, da dies die Analyse verwirren könnte. Dieses Protokoll bietet eine einfache Möglichkeit, die synaptische Multiplizität zu schätzen, die ein wichtiger Determinant der synaptischen Wirksamkeit und ihrer Plastizität unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen ist.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Die Züchtung und Elektrophysiologie von Zellen auf NRCC Patch-Clamp-Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Forschung

Neurowissenschaften

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Slice-Patch-Clamp-Technik für die Analyse von Learning-induzierte Plastizität

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...