Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

י. ס קיבל מלגה לתואר שני אונטריו. W.I. קיבל מלגת חוקר חדש למחקר בריאות הנפש קנדה. עבודה זו נתמכת על ידי ההפעלה מענקים כדי W.I של מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (06106-2015 RGPIN) ומכון קנדי למחקר בריאות (PJT 148707).

ניסויים בבעלי חיים כל המאושרים על ידי ועדת אכפת של מאוניברסיטת מערב אונטריו לפי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים (AUP #2014-031) של בעלי חיים.
1. פתרונות
<ol><li>
פתרון עם פרוסות
	<ol>
<li>עיין טבלה 1 לקבלת ההרכב של הפתרון עם פרוסות.</li>
		<li>להכין פתרון מניות 20 x מראש ...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

דרישה חשובה אחת עבור ניסוי אלקטרופיזיולוגיה מלחציים תיקון מוצלח הוא קבלת פרוסות/תאים בריאים. הפרוטוקול המתואר שלנו ממוטב היפותלמי פרוסות המכילות PVN נוירונים. אחרים במוח אזורים עשויים לדרוש ששינה פתרונות, עם פרוסות שיטות21,22,23,<sup class...

הסינאפסית הוא מנגנון בסיסי עבור תקשורת בין נוירונים, לפיכך, תפקוד המוח. הסינאפסית גם יציב, באפשרותך לשנות את יעילותה באופן תלוי-פעילות כמו גם כמו בתגובה אותות modulatory1. לפיכך, בחינת תפקוד סינפטית היה מוקד מרכזי של חקר המוח. אלקטרופיזיולוגיה מלחציים תיקון כל תא הוא טכניקה תכליתי המאפשר לנו להבין, על-ידי להמציא עיצובים מוטוריים וניתוחים נתונים, מעמיק מנגנונים biophysical ומולקולרית של ההעברה הסינאפסית. בגישה נפוץ, אולי בשל הפשטות של טכניקה, קונספט, הוא המדד של זרמי postsynaptic סינאפסות מעכבות מיניאטורי (בי / IPSCs) תחת המתח תהדק את תצורת2,3, 4 , 5 , 6. mPSCs בודדים לייצג את הזרימה של יונים דרך רצפטורים postsynaptic ionotropic (למשל קולטנים אמפא ו- GABAA ) בתגובה הכריכה של נוירוטרנסמיטורים בהתאמה שלהם שוחרר ממסוף presynaptic 7 . כי ההקלטה מתקבל בנוכחות ממותגת מתח Na+ ערוץ חוסם טטרודוטוקסין (TTX), שחרורו אינו תלוי-פוטנציאל הפעולה, בדרך כלל כרוך שלפוחית סינפטית יחיד המכיל עצבי. בהתבסס על הנחה זו, משרעת הממוצע של mPSCs הוא בשימוש נרחב הערכה גסה עבור גודל quantal, המייצגת את המספר ואת הפונקציונליות של קולטנים postsynaptic מנוגדות אתר שחרור יחיד. מצד שני, התדירות של mPSCs נחשבת מייצגים שילוב של המספר הכולל של הסינפסות הפסקת אל התא postsynaptic והסתברות שחרור הממוצע שלהם. עם זאת, פרמטרים אלה לא מאפשרות למדוד משתנה נוסף-multiplicativity של הסינפסות, או ריבוי סינפטית – דבר חשוב היעילות של ההעברה הסינאפסית.
בהתבסס על תורת הסינאפסית7,8,9quantal, הכוח של חיבור נתון בין זוג נוירונים הוא תלוי בשלושה גורמים: המספר של הסינפסות פונקציונלי (N), postsynaptic בתגובה שחרורו של שלפוחית סינפטית יחיד (גודל quantal; Q), ההסתברות של שחרור נוירוטרנסמיטר (Pr). ריבוי סינפטית שווה ל N. הפיתוח של ריבוי סינפטית או על גיזום של הסינפסות אוילר הוא פלסטיק במהלך הפיתוח, מחלות שונות הברית3,4,6,10. מסיבה זו, אפיון ריבוי סינפטית יש השלכות חשובות להבנת את היעילות של ההעברה הסינאפסית על בריאות ומחלה. טכניקות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים ניתן לזהות ראיות מבניות של ריבוי סינפטית על ידי גילוי מספר מגעים סינפטית שמקורם הדנדריטי לאקסון אותו על גבי אותו נוירון postsynaptic11,12, 13,14. עם זאת, multisynapses מזוהה מבחינה מבנית האלו ניתן באופן פונקציונלי שקט15,16. ירידה תפקודית מדוקדקת של N דורש טכנית מאתגר גישות אלקטרופיזיולוגיות, כגון הקלטות שלם-תא לזווג אשר יכול לזהות אם חיבור נתון יש מספר אתרי פרסום פונקציונלי מינימלית גישות גירוי שואפים לגייס של האקסון בשם יחיד.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה פשוטה עבור הערכת ריבוי סינפטית על ידי אימוץ שיטה שפותחה במקור מאת Hsia ואח '2. טכניקה זו כרוכה המדידה של ספונטנית מגירסה (sPSCs), mPSCs באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה, אשר מאפשר לנו לאמוד את מידת הריבוי סינפטית על-פני כל כניסות ליציאה נוירון מסוים.  כפי שהוגדרו בעבר, סינפטית ריבוי משקף את המספר של הסינפסות בין נוירון קדם ו postsynaptic נתון. אם הסינפסות מרובים גייסו בסנכרון ידי פוטנציאל הפעולה, תהיה הסתברות גבוהה של סיכום זמני של הפרט מגירסה (קרי quantal), יצירת של משרעת גדולה PSC.  בהקלטות mPSC (איזה פוטנציאל פעולה הנחסמים על-ידי TTX), ההסתברות של סיכום זמני של הפרט mPSCs (שאינם סינכרוני) הוא נמוך. באמצעות רציונל זה, ריבוי סינפטית יכול להיות מוערך על-ידי השוואת את משרעת sPSC (עם פוטנציאל הפעולה תלוית שחרור) משרעת mPSC.
כדי לבחון את קיומו של ריבוי אנו מתארים ארבעה ניסויים וניתוחים שלהם glutamatergic EPSCs כדוגמא. לעומת זאת, אותה גישה יכול לשמש עבור הצום שידור GABAergic/glycinergic (IPSCs). תירוץ קצר עבור כל הניסוי המתואר להלן. ראשית, כפי שהוסבר לעיל, יכול להיות מוערך ריבוי סינפטית על-ידי השוואת את משרעת של sEPSCs כדי mEPSCs. ישנם שתי דרישות גישה זו; אקסונים presynaptic 1) חייב לירות מספר מספיק של פוטנציאל פעולה במהלך ההקלטה, ועל 2) Pr להיות גבוהה כך הסינפסות מרובים שחרור נוירוטרנסמיטר בעת ההגעה של פוטנציאל הפעולה. על מנת לעמוד בדרישות אלה, sEPSCs הן שהוקלט לראשונה ב נמוך Ca2 + מלאכותי השדרתי (כלנית חדד), לאחר מכן הקליט בנוכחות ריכוז נמוך של אנטגוניסט ערוץ K+ , פמפרידין (4-AP) כדי להגדיל את הפעולה ירי פוטנציאל ו- Pr. ואז פוטנציאל הפעולה ירי חסומה על-ידי TTX ו- Pr הופחתו ממותגת מתח Ca2 + ערוץ חוסם Cd2 +. משרעת של sEPSCs (עם 4AP) בהשוואה לזה של mEPSC (עם 4AP, TTX ו Cd2 +). הניסוי השני, Ca2 + מוחלף על-ידי equimolar Sr2 + ב חנה המבר כדי בטל סינכרון שלפוחית שחרור. כפי Ca2 + נדרש לשחרור סינכרונית של שלפוחית, החלפת עם Sr2 + אמור לחסל את sEPSCs משרעת גדולה זה מרמז על ריבוי. שלישית, mechanistically, ריבוי יכול לנבוע גם קשרים סינפטיים מרובים באותו נוירון postsynaptic או שחרור multivesicular (קרי מספר שלפוחית שוחרר איש קשר סינפטית יחיד)17,18. כדי להבדיל בין שני סוגים של ריבוי, הניסוי השלישי משתמש עם זיקה נמוכה, מהיר בריא תחרותי אנטגוניסט של אמפא רצפטורים, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 כדי לקבוע אם גדול sEPSC הם התוצאה של סיכום טמפורלית הסינפסות עצמאית או שחרור multivesicular פועל על אוכלוסיה חופפים של קולטני postsynaptic. אם האירועים משרעת גדולה נובעים שחרור multivesicular, וγ-DGG יהיה פחות יעיל עיכוב sEPSCs בהשוואה קטן יותר גדול יותר, ואילו sEPSCs גדולים הנובעים מן הסיכום הטמפורלי של אנשי קשר מרובים סינפטית יושפעו באופן דומה על-ידי Γ-DGG. במהלך הניסוי הרביעי, שיטה יותר פיזיולוגית משמש כדי לשפר את פוטנציאל הפעולה בירי, כלומר מביא לגירוי סינפטית. התפרצויות של פעילות סינפטית יכול transiently עלייה/להקל על פוטנציאל הפעולה הספונטנית ירי ושחרור ההסתברות afferents מגורה. לכן, גישה זו מאפשרת ריבוי להפגין בצורה יותר פיזיולוגית.
הפרוטוקול הבא מתאר את שיטת עבור ניסויים אלה ברקמת היפותלמי העכבר. באופן ספציפי, משמשים corticotropin נוירונים הורמון (CRH) שיחרור של גרעין paraventricular ההיפותלמוס (PVN). אנו מתארים את נהלי ביצוע תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה, להסביר את הניסויים ספציפיים כדי לבדוק את הריבוי סינפטית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

במערכת העצבים המרכזית, זוג של הנוירונים יוצרים לעתים קרובות מספר קשרים סינפטיים ו/או אתרים שחרור נוירוטרנסמיטר פונקציונלי (ריבוי סינפטית). ריבוי סינפטית היא פלסטיק ושינויים במהלך הפיתוח, בתנאים פיזיולוגיים שונים, להיות דטרמיננטה חשוב עבור היעילות של ההעברה הסינאפסית. כאן, אנחנו חלוקה לרמות ניסויים עבור הערכת מידת הריבוי של הסינפסות הפסקת אל נוירון postsynaptic נתון באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה פרוסות המוח חריפה. באופן ספציפי, מתח-קלאמפ הקלטה משמש כדי להשוות את ההבדל בין את משרעת של זרמי postsynaptic סינאפסות ספונטנית (sEPSCs) וזרמים מיניאטורי סינאפסות postsynaptic (mEPSCs). התיאוריה מאחורי שיטה זו הוא כי תשומות מביא כי התערוכה ריבוי יראה sEPSCs גדול, תלויי-פוטנציאל הפעולה בעקבות יציאתו סינכרונית המתרחשת על כל איש קשר סינפטית. לעומת זאת, שחרור ללא תלות פוטנציאל הפעולה (וזה אסינכרוני) יפיק mEPSCs משרעת קטנים יותר. מאמר זה מתאר קבוצה של ניסויים וניתוחים לאפיין את קיומו של ריבוי סינפטית ודן את הדרישות ואת המגבלות של הטכניקה. טכניקה זו ניתן להחיל לחקור כמה שונה התערבויות התנהגותיות, תרופתי או סביבתיים בתחום vivo משפיעים על הארגון של קשרים סינפטיים באזורי מוח שונים.

הפרוטוקול הנ ל מתאר שיטה באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה לבחון את מידת הריבוי סינפטית, נוירונים היפותלמי העכבר כדוגמא. טכניקה זו הכנה פרוסה אמור להניב התאים קיימא בריא זה לא יש ממברנה נפוחות או גרעין (איור 1). כל שלב בפרוטוקול זה חשוב לבריאות של רקמות,...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

הערכה של ריבוי סינפטית באמצעות תאים כל תיקון-קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקודית הריבוי סינפטית באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה פרוסות המוח חריפה.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

במוח, זוג נוירונים יוצרים לעתים קרובות מגעים סינפטיים מרובים, הנקראים ריבוי סינפטי. עם זאת, בדיקה מדויקת של ריבוי סינפטי דורשת ניסויים מאתגרים מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה להערכה ברוטו של ריבוי סינפטי באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם.שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מין ואזור המוח כדי לחקור ריבוי סינפטי. שיטה זו דורשת מיומנויות בסיסיות באלקטרופיזיולוגיה של מהדק-טלאי שלם. השגת הקלטות באיכות גבוהה עם עמידות נמוכה ויציבה לגישה היא קריטית לפרשנות המדויקת של הנתונים.כדי להשיג תצורה של תא שלם, מקם את פיפיט ההקלטה ממש מעל הפרוסה והיסט זרם פיפטה במצב מהדק המתח. החל לחץ חיובי קל על פיפטה, ולנעול את stopcock. לאחר מכן, בחר תא בריא עם קרום שלם, והתקרב לרקמה עם פיפטה.הלחץ החיובי אמור לגרום להפרעה קלה ברקמה. לאט לאט לקרב את פיפטה לתא בתנועה אלכסונית עד גומה קטנה נוצרת על פני התא. לאחר מכן, שחרר את נעילת הלחץ החיובית.התא יתחיל ליצור חותם, וההתנגדות תגדל מעל ג'יגה-אוהם אחד. במלקחיים במתח, החזק את התא במינוס 68 מילי-וולט. לאחר מכן, מעט למשוך את פיפטה מן התא באלכסון כדי להסיר לחץ עודף.לפצות על קיבוליות פיפטה מהירה ואיטית. החל יניקה קצרה דרך הצינור המחובר למחזיק פיפטה כדי לפרוץ את התא ולקבל תצורה של תא שלם. לאחר מכן, עבור למצב תא בחלון בדיקת הממברנה בתוכנה לאילופיזיולוגיה של איסוף וניתוח נתונים.שמור על הטמפרטורה של אמבט ההקלטה ב 27 עד 30 מעלות צלזיוס ואת קצב הזרימה ב 1.5 עד שני מיליליטר לדקה לניסויים הבאים. בסינפסה ריבוי, פוטנציאל פעולה מסנכרן שחרור נוירוטרנסמיטר ומייצר זרם פוסט-סינפטי גדול יותר. חסימת פוטנציאל פעולה ושחרור כלי רכב תלוי סידן עם TTX ו קדמיום מונע את הסיכום הנוכחי postsynaptic ומפחית את משרעת.כאשר אין ריבוי, חסימת פוטנציאל הפעולה לא תשנה את משרעת. בניסוי אחד, כדי להעריך ריבוי, להחזיק את התא במינוס 68 מיליבולטים תוך זלוף זה עם aCSF סידן נמוך. הקלט את ה- EPSCs הספונטניים למשך חמש דקות לפחות כדי להבטיח תוכנית בסיסית יציבה.לאחר מכן, להוסיף 30 micromolars 4-AP ל- aCSF כדי להגדיל את הפעולה אירועים תלויים פוטנציאליים, ולהקליט EPSCs ספונטניים לפחות 10 דקות כדי להשיג את אפקט התרופה המלאה. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיקרומולרים TTX ו-10 מיקרומולרים קדמיום ל-aCSF עם 4-AP, והקליטו את ה-EPSCs הזעירים למשך 10 דקות לפחות. לניתוח לא מקוון, השתמש בדקה האחרונה של תוכנית הבסיס מיד לפני היישום של 4-AP, בדקה העשירית של יישום 4-AP ובדקה העשירית של יישום TTX.בניסוי זה, סידן חוץ-תאי מוחלף בסטרונציום כדי לבטל את ההינכרון של שחרור וריצים סינפטיים. לכן, אם קיים ריבוי, זה אמור להקטין את משרעת של זרמים postsynaptic. בניסוי 2, להקליט EPSCs ספונטניים לפחות חמש דקות תוך התלקחות התא עם aCSF סידן נורמלי.כדי לבטל את ניתוק שחרור וקסיק, להתחיל לתפור את התא עם aCSF סטרונציום, ולהקליט EPSCs ספונטניים. לניתוח לא מקוון, כדי לקבוע אם משרעת גדולה EPSCs ספונטניים נובעים שחרור סינכרוני של וקסיקים, להשוות את הדקה האחרונה של הבסיס לדקה העשירית של יישום aCSF סטרונציום. ריבוי יכול לכלול שחרור רב-מערכתי, מה שגורם לריכוז נוירוטרנסמיטר גבוה יותר בסוע הסינפטי.תוספת של גאמא-DGG, אנטגוניסט קולטן אמפא בזיקה נמוכה, מובילה לעיכוב פחות יעיל של רב-קוואנטי גדול יותר בהשוואה לזרמים פוסט-אנטינפטיים קטנים יותר. ללא הפצה רב-מערכתית, גאמא-DGG תהיה יעילה באותה מידה בזרמים פוסט-סינפטיים גדולים וקטנים יותר. בניסוי 3, כדי לבדוק שחרור רב-מערכתי, הקלט EPSCs ספונטניים ב- aCSF עם סידן נמוך למשך חמש דקות לפחות.הוסף 30 מיקרומולרים 4-AP ל- aCSF באמצעות מערכת החיסון. הקלט את ה- EPSCs הספונטניים למשך 10 דקות לפחות. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרומולרים גאמא-DGG ל-ACSF עם 4-AP, והקליטו את ה-EPSCs הספונטניים למשך 10 דקות לפחות.כניסוי בקרה בתא נפרד, חזור על ההליכים, אך החל ריכוז נמוך של DNQX במקום גאמא-DGG. לניתוח לא מקוון, לנתח את הרגע האחרון של כל יישום סמים. פרצי פעילות סינפטית יכולים להגדיל באופן חולף את פוטנציאל הפעולה הספונטני ולשחרר את ההסתברות של afferents מגורה.אם נוירונים מפגינים ריבוי, העלייה בפוטנציאל הפעולה אמורה לגרום לעלייה ארעית משרעת של זרמים פוסט-סינפטיים. בניסוי 4, להקליט EPSCs ספונטניים בסידן aCSF נורמלי. כדי להגביר את פוטנציאל הפעולה, לעורר את afferents באמצעות אלקטרודה זכוכית מונופולארי מלא aCSF בקצב של 20 הרץ במשך שתי שניות, ולחזור 10 פעמים עם מרווח בין פרץ של 20 שניות.לניתוח, השתמש ב- EPSCs ספונטניים של 5,000 אלפיות שניה לפני הגירוי הראשון כבסיס והשווה ל- EPSCs הספונטניים של 10 עד 300 אלפיות השניה לאחר הגירוי הסופי. לאחר מכן, לקחת את משרעת הממוצע ושינוי תדירות מעל 10 ניסויים. נתח EPSCs ספונטניים ו- EPSCs זעירים באמצעות תוכנית המזהה ומנתחת זרמים סינפטיים.השתמש בפרמטרי הזיהוי המוצעים ובפונקציית ניתוח ללא הפסקה לזיהוי EPSCs המתווים על-ידי קולטן אמפא. סרוק באופן ידני כל הקלטה כדי לוודא שהתוכנית מזהה במדויק כל אירוע. יצא את נתוני האירוע על-ידי העתקתם ללוח והדבק אותם בתוכנת ניהול נתונים.לאחר מכן, לחשב את התדירות הממוצעת משרעת עבור כל טיפול תרופתי, ולבצע את הניתוחים הסטטיסטיים הרלוונטיים. בדוגמה המוצגת כאן, 4-AP מגביר הן את משרעת והן את התדירות של EPSCs ספונטניים. היישום הבא של TTX ו קדמיום מקטין הן את משרעת ותדירות.הנה ההפצה של משרעת EPSC ספונטנית מההקלטה. בנוירונים ההיפותלמיים שנבדקו כאן, משרעת ותדירות של תנאי הבסיס ו- TTX זהים, מה שמרמז על כך שה- EPSCs הספונטניים הבסיסיים מכילים מעט מאוד EPSCs תלויי פוטנציאל פעולה. בהתאם לכך, ניסויים עוקבים יכולים להשוות את ההפרש בין קו הבסיס ל- 4-AP כדי למדוד ריבוי.כוחו של שידור סינפטי יכול להיות מוגבר באופן חולף על ידי התפרצויות של פעילות סינפטית. כדי לחקור ריבוי בתנאים פיזיולוגיים יותר, גירוי אדיש יכול לשמש כדי להגדיל את פוטנציאל הפעולה ירי והסתברות שחרור. להלן הסיכומים של תדירות EPSC ספונטנית ושינויים משרעת בעקבות גירוי סינפטי.הקלטות יציבות חיוניות לפרשנות מדויקת של הנתונים. תאר את הנתונים אם ההתנגדות לגישה משתנה ביותר מ- 20% במהלך ההקלטה, מכיוון ש הדבר עלול לבלבל את הניתוח. פרוטוקול זה מציע דרך פשוטה להעריך ריבוי סינפטי, שהוא גורם מפתח ביעילות הסינפטית ובפלסטיות שלה בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים שונים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Culturing ו Electrophysiology של תאים על Patch-clamp צ&#39;יפס NRCC

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

מערכת תיקון מהדק Multi-אלקטרודה בסיוע מחשב

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

פרוסה תיקון קלאמפ טכניקת ניתוח הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...