Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
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J.S. ricevuto Ontario Graduate Scholarship. W.I. ha ricevuto un nuovo investigatore Fellowship dal Canada di ricerca sulla salute mentale. Questo lavoro è supportato da sovvenzioni di funzionamento a w. i da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) e il Canadian Institute for Health Research (PJT 148707).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal comitato di cura di animale della University of Western Ontario in conformità con il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali (AUP n. 2014-031).
1. soluzioni
<ol><li>
Soluzione per affettare
	<ol>
<li>Fare riferimento alla tabella 1 per la composizione della soluzione per affettare.</li>
		<li>Preparare una soluzione stock 20x in anticipo e conservare a 4 ° C per 1 mese.</li>
		<li>P...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

Un importante requisito per un esperimento di successo patch clamp Elettrofisiologia è ottenere fette/cellule sane. Il nostro protocollo descritto è ottimizzato per fette ipotalamici che contengono neuroni PVN. Altre aree potrebbero richiedere di cervello per volta soluzioni e affettare metodi21,22,23,24. Per la registrazione, è fondamentale per accettare solo registrazioni stabile monitoran...

Trasmissione sinaptica è un meccanismo fondamentale per la comunicazione tra neuroni e quindi, funzione cerebrale. Trasmissione sinaptica anche è labile e può cambiare la sua efficacia in maniera dipendente di attività anche come in risposta a segnali modulatoria1. Così, esaminando funzione sinaptica è stato dei principali obiettivi di ricerca in neuroscienza. Elettrofisiologia di cellule intere patch clamp è una tecnica versatile che permette di comprendere, di elaborare disegni sperimentali e analisi dei dati, approfondite meccanismi biofisici e molecolari della trasmissione sinaptica. Un approccio comunemente utilizzato, forse a causa della semplicità del concetto e tecnica, è la misura delle correnti postsinaptico eccitatorio/inibitorio in miniatura (mE / IPSCs) nell'ambito della tensione morsetto configurazione2,3, 4 , 5 , 6. mPSCs individuali rappresentano il flusso di ioni attraverso recettori ionotropici postsinaptici (ad es. recettori AMPA e GABAA ) in risposta all'associazione dei loro rispettivi neurotrasmettitori rilasciati dal terminale presinaptico 7 . Perché la registrazione si ottiene in presenza della tensione-gated Na+ canale bloccanti della tetrodotossina (TTX), l'uscita è indipendente dal potenziale d'azione e prevede normalmente una singolo delle vescicole sinaptiche che contiene del neurotrasmettitore. Basato su questo presupposto, l'ampiezza media di mPSCs è ampiamente usato come una stima grezza per la dimensione quantal, che rappresenta il numero e la funzionalità dei recettori postsinaptici opposte di un singolo sito. D'altra parte, la frequenza di mPSCs è considerata di rappresentare una combinazione del numero totale delle sinapsi che chiude sulla cellula postsinaptica e loro probabilità di rilascio medio. Tuttavia, questi parametri non misurare un'altra variabile-multiplicativity di sinapsi, o molteplicità sinaptica — che è importante per l'efficacia della trasmissione sinaptica.
Basato sulla teoria quantal della trasmissione sinaptica7,8,9, la forza di una determinata connessione tra una coppia di neuroni è dipendente da tre fattori: il numero delle sinapsi funzionali (N), il risposta postsinaptica al rilascio di una singola vescicola sinaptica (quantal dimensione; Q) e la probabilità di rilascio di neurotrasmettitore (Pr). Sinaptica molteplicità equivale a N. Lo sviluppo di molteplicità sinaptica o la potatura delle sinapsi moltiplicative è plastica nel corso dello sviluppo e nella malattia diversi stati3,4,6,10. Per questo motivo, che caratterizzano la molteplicità sinaptica ha implicazioni importanti per comprendere l'efficacia della trasmissione sinaptica nella salute e nella malattia. Tecniche, come il microscopio elettronico possono identificare prove strutturali di molteplicità sinaptica rilevando più contatti sinaptici provenienti dall'assone stesso sulla stesso neurone postsinaptico11,12, 13,14. Tuttavia, questi multisynapses strutturalmente identificati possono essere funzionalmente silenzioso15,16. Esame preciso funzionale di N richiede tecnicamente impegnativi approcci elettrofisiologici, come accoppiati registrazioni della intero-cellula che possono identificare se una determinata connessione dispone di più siti di rilascio funzionale e minimale approcci di stimolazione che mirano a reclutare un singolo assone putativo.
In questo protocollo, descriviamo un metodo semplice per stimare la molteplicità sinaptica adottando un metodo sviluppato originariamente da Hsia et al2. Questa tecnica prevede la misura di spontanea PSC (sPSCs) e mPSCs usando cellule intere patch clamp ed elettrofisiologia, che ci permette di stimare il grado di molteplicità sinaptica attraverso tutti gli ingressi ad un dato neurone.  Come definito in precedenza, sinaptica molteplicità riflette il numero di sinapsi tra un dato neurone pre- e postsinaptico. Se più sinapsi sono reclutate in sincronia di un potenziale di azione, ci sarà un'alta probabilità di temporale sommatoria di singoli sportelli unici (cioè quantali), generando una maggior ampiezza PSC.  Nelle registrazioni mPSC (in cui i potenziali di azione sono bloccati da TTX), la probabilità di temporale sommatoria di singoli mPSCs (asincrono) è bassa. Utilizzando questa logica, molteplicità sinaptica può essere stimata confrontando l'ampiezza sPSC (con rilascio di potenziale di azione-dipendente) per l'ampiezza di mPSC.
Per esaminare l'esistenza di molteplicità Descriviamo quattro esperimenti e loro analisi utilizzando glutamatergic EPSC come esempio. Tuttavia, lo stesso approccio può essere utilizzato per la veloce trasmissione GABAergica/glycinergic (IPSCs). Una breve spiegazione razionale per ogni esperimento è descritto di seguito. In primo luogo, come spiegato sopra, molteplicità sinaptica può essere stimata confrontando l'ampiezza del sEPSC a mIPSCs. Ci sono due requisiti per questo approccio; 1) presinaptici assoni devono sparare un numero sufficiente di potenziali d'azione durante la registrazione, e 2) Pr deve essere alta in modo che le sinapsi più rilasciare neurotrasmettitore dopo l'arrivo del potenziale d'azione. Per soddisfare questi requisiti, sEPSC sono per la prima volta in basso Ca2 + artificiale del liquido cerebrospinale (aCSF) e poi registrato in presenza di una bassa concentrazione dell'antagonista canale K+ , 4-aminopiridina (4-AP) per aumentare l'azione infornamento potenziale e Pr. Quindi di infornamento del potenziale di azione è bloccato da TTX e Pr sono diminuite di una tensione-gated Ca2 + antagonista Cd2 +. L'ampiezza del sEPSC (con 4AP) è paragonato a quello di mEPSC (con 4AP, TTX e Cd2 +). Nel secondo esperimento, Ca2 + è sostituito da equimolare Sr2 + in aCSF a desincronizzarsi rilascio vescicola. Come Ca2 + è necessario per il rilascio sincrono delle vescicole, sostituzione con Sr2 + dovrebbe eliminare il sEPSC di grande ampiezza che sono indicativi di molteplicità. In terzo luogo, meccanicistico, molteplicità può derivare da entrambi più contatti sinaptici alla stesso neurone postsinaptico o multivesicular rilascio (cioè più vescicole rilasciate all'interno di un singolo contatto sinaptico)17,18. Per differenziare tra i due tipi di molteplicità, il terzo esperimento utilizza una bassa affinità, veloce dissociazione antagonista competitivo dei recettori AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 per determinare se grande sEPSC sono il risultato della somma temporale di sinapsi indipendente o multivesicular rilascio che agisce su una popolazione di sovrapposizione dei recettori postsinaptici. Se gli eventi di grande ampiezza derivano dalla release multivesicular, γ-DGG sarà meno efficace ad inibire più grande sEPSC rispetto ai più piccoli, mentre grandi sEPSC che derivano dalla sommatoria temporale dei contatti sinaptici multipli allo stesso modo saranno interessati da Γ-DGG. Nel quarto esperimento, un metodo più fisiologico viene utilizzato per migliorare il potenziale di azione sparando, vale a dire afferente stimolazione sinaptica. Scoppi di attività sinaptica possono transitoriamente aumento/facilitare la probabilità di infornamento e rilascio di potenziale di azione spontanea delle afferenze stimolata. Questo approccio permette quindi di molteplicità di manifestare in maniera più fisiologica.
Il seguente protocollo descrive il metodo per lo svolgimento di questi esperimenti nel tessuto ipotalamico del mouse. In particolare, corticotropina liberantesi ormone (CRH) neuroni del nucleo paraventricolare dell'ipotalamo (PVN) sono utilizzati. Descriviamo le procedure per lo svolgimento di elettrofisiologia di cellule intere patch clamp e spiegare gli esperimenti specifici per testare per molteplicità sinaptica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

Nel sistema nervoso centrale, un paio di neuroni formano spesso più contatti sinaptici e/o siti di rilascio di neurotrasmettitore funzionale (molteplicità sinaptica). Molteplicità di sinaptica è di plastica e cambiamenti nel corso dello sviluppo e in differenti condizioni fisiologiche, essendo un fattore determinante per l'efficacia della trasmissione sinaptica. Qui, descriviamo gli esperimenti per stimare il grado di molteplicità di sinapsi che chiude su un dato neurone postsinaptico usando cellule intere patch ed elettrofisiologia di morsetto in fettine di cervello acuto. In particolare, registrazione di tensione-morsetto viene utilizzato per confrontare la differenza tra l'ampiezza delle correnti postsinaptiche eccitatori spontanee (sEPSC) e in miniatura eccitatori postsinaptici correnti (mIPSCs). La teoria dietro questo metodo è che input afferente che esibiscono molteplicità mostrerà sEPSC grande, potenziale d'azione-dipendente a causa del rilascio sincrono che si verifica a ogni contatto sinaptico. Al contrario, rilascio potenziale di azione indipendente (che è asincrona) genererà più piccola ampiezza mIPSCs. Questo articolo definisce una serie di esperimenti e analisi per caratterizzare l'esistenza di molteplicità sinaptica e vengono illustrati i requisiti e le limitazioni della tecnica. Questa tecnica può essere applicata per studiare come i diversi interventi comportamentali, farmacologici o ambientali in vivo influenzano l'organizzazione dei contatti sinaptici in aree differenti del cervello.

Il protocollo di cui sopra descrive un metodo per l'utilizzo di elettrofisiologia morsetto della intero-cellula patch per esaminare il grado di molteplicità sinaptica, usando neuroni ipotalamici del mouse come un esempio. Questa tecnica di preparazione di fetta dovrebbe produrre sane cellule vitali che non hanno una membrana gonfie o nucleo (Figura 1). Ogni passaggio nel protocollo è importante per la salute del tessuto e la qualità delle registrazioni.
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Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Valutazione di molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere Patch-clamp Elettrofisiologia

Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione funzionale molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere patch ed elettrofisiologia di morsetto in fettine di cervello acuto.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Nel cervello, una coppia di neuroni spesso forma molteplici contatti sinaptici, che è chiamata molteplicità sinaptica. Tuttavia, un esame preciso della molteplicità sinaptica richiede esperimenti tecnicamente impegnativi. Questo protocollo descrive un metodo semplice per la stima lorda della molteplicità sinaptica usando l'elettrofisiologia patch-clamp a celle intere.Questo metodo può essere applicato a qualsiasi specie e area cerebrale per indagare la molteplicità sinaptica. Questo metodo richiede abilità di base nell'elettrofisiologia patch-clamp a cellule intere. Ottenere registrazioni di alta qualità con bassa e stabile resistenza agli accessi è fondamentale per un'interpretazione accurata dei dati.Per ottenere la configurazione a cella intera, posizionare la pipetta di registrazione appena sopra la corrente della pipetta di sezione e offset in modalità morsetto di tensione. Applicare una leggera pressione positiva sulla pipetta e bloccare il fermaviere. Quindi, selezionare una cellula sana con una membrana intatta e avvicinarsi al tessuto con la pipetta.La pressione positiva dovrebbe causare un leggero disturbo sul tessuto. Avvicinare lentamente la pipetta alla cella con un movimento diagonale fino a formare una piccola fossetta sulla superficie della cella. Quindi, rilasciare il blocco di pressione positivo.La cellula inizierà a formare un sigillo e la resistenza aumenterà sopra un gigaohm. Nel morsetto di tensione, tenere la cella a meno 68 millivolt. Successivamente, allontanare leggermente la pipetta dalla cella in diagonale per rimuovere la pressione in eccesso.Compensare la capacità di pipetta veloce e lenta. Applicare una breve aspirazione attraverso il tubo collegato al supporto della pipetta per sfondare la cella e ottenere una configurazione a cella intera. Quindi, passare alla modalità cellulare nella finestra di test della membrana in un software di acquisizione e analisi dei dati di elettrofisiologia.Mantenere la temperatura del bagno di registrazione a 27-30 gradi Celsius e la portata da 1,5 a due millilitri al minuto per gli esperimenti successivi. In una sinapsi molteplicista, un potenziale d'azione sincronizza il rilascio di neurotrasmettitori e genera una corrente postsinaptica più grande. Il potenziale di azione bloccante e il rilascio vescicolare dipendente dal calcio con TTX e cadmio prevengono la sommatoria della corrente postsinaptica e diminuiscono l'ampiezza.Quando non c'è molteplicità, il potenziale di azione di blocco non cambierà l'ampiezza. Nell'esperimento uno, per stimare la molteplicità, tenere la cellula a meno 68 millivolt mentre la perfonde con aCSF a basso calcio. Registrare gli EPSC spontanei per almeno cinque minuti per garantire una linea di base stabile.Successivamente, aggiungere 30 micromolari 4-AP all'aCSF per aumentare gli eventi di azione potenziali dipendenti e registrare EPSC spontanei per almeno 10 minuti per ottenere l'effetto farmacologico completo. Quindi, aggiungere 0,5 micromolari TTX e 10 micromolari cadmio all'aCSF con 4-AP e registrare gli EPSC in miniatura per almeno 10 minuti. Per l'analisi offline, utilizzare l'ultimo minuto di linea di base immediatamente prima dell'applicazione di 4-AP, il 10 ° minuto dell'applicazione 4-AP e il 10 ° minuto dell'applicazione TTX.In questo esperimento, il calcio extracellulare viene sostituito con stronzio per de sincronizzare il rilascio di vescicole sinaptiche. Pertanto, se la molteplicità è presente, questo dovrebbe diminuire l'ampiezza delle correnti postsinaptiche. Nell'esperimento due, registrare EPSC spontanei per almeno cinque minuti mentre si perfonde la cellula con il normale aCSF di calcio.Per sincronizzare il rilascio di vescicola, iniziare a perfondere la cellula con aCSF stronzio e registrare EPSC spontanei. Per l'analisi offline, per determinare se gli EPSC spontanei di grande ampiezza sono dovuti al rilascio sincrono di vescicole, confrontare l'ultimo minuto della linea di base con il 10 ° minuto dell'applicazione aCSF stronzio. La molteplicità può comportare il rilascio multivesicolare, che causa una maggiore concentrazione di neurotrasmettitori nella fessura sinaptica.L'aggiunta di gamma-DGG, un antagonista del recettore AMPA a bassa affinità, porta ad un'inibizione meno efficace di più grandi correnti postnaptiche uniquantali. Senza rilascio multivesicolare, gamma-DGG sarà ugualmente efficace su correnti postsinaptiche sempre più grandi. Nell'esperimento tre, per testare il rilascio multivesicolare, registrare EPSC spontanei in aCSF a basso calcio per almeno cinque minuti.Aggiungere 30 micromolari 4-AP all'aCSF attraverso il sistema di perfusione. Registrare gli EPSC spontanei per almeno 10 minuti. Quindi, aggiungere 200 micromolari gamma-DGG all'aCSF con 4-AP e registrare gli EPSC spontanei per almeno 10 minuti.Come esperimento di controllo in una cella separata, ripetere le procedure, ma applicare una bassa concentrazione di DNQX anziché gamma-DGG. Per l'analisi offline, analizza l'ultimo minuto di ogni applicazione farmacologica. Raffiche di attività sinaptica possono aumentare transitoriamente il potenziale di azione spontanea sparando e rilasciando la probabilità degli afferenti stimolati.Se i neuroni mostrano molteplicità, l'aumento dei potenziali d'azione dovrebbe causare un aumento transitorio dell'ampiezza delle correnti postsinaptiche. Nell'esperimento quattro, registrare EPSC spontanei nel calcio normale aCSF. Per aumentare il potenziale d'azione, stimolare gli afferenti utilizzando un elettrodo di vetro monopolare riempito con aCSF ad una velocità di 20 hertz per due secondi e ripetere 10 volte con un intervallo inter-burst di 20 secondi.Per l'analisi, utilizzare EPSC spontanei di 5.000 millisecondi prima del primo stimolo come linea di base e confrontarli con gli EPSC spontanei da 10 a 300 millisecondi dopo lo stimolo finale. Quindi, prendi l'ampiezza media e il cambio di frequenza in 10 prove. Analizza EPSC spontanei ed EPSC in miniatura utilizzando un programma che rileva e analizza le correnti sinaptiche.Utilizzare i parametri di rilevamento suggeriti e la funzione di analisi non-stop per rilevare gli EPSC mediati dal recettore AMPA. Scansiona manualmente ogni registrazione per assicurarti che il programma rilevi con precisione ogni evento. Esportare i dati dell'evento copiarli negli Appunti e incollarli in un software di gestione dei dati.Successivamente, calcolare la frequenza media e l'ampiezza per ogni trattamento farmacologico ed eseguire le analisi statistiche pertinenti. In un esempio mostrato qui, 4-AP aumenta sia l'ampiezza che la frequenza degli EPSC spontanei. La successiva applicazione del TTX e del cadmio diminuisce sia l'ampiezza che la frequenza.Ecco la distribuzione dell'ampiezza EPSC spontanea dalla registrazione. Nei neuroni ipotalamici qui esaminati, l'ampiezza e la frequenza delle condizioni di base e TTX sono le stesse, suggerendo che gli EPSC spontanei di base contengono pochissimi EPSC potenziali-dipendenti dall'azione. Di conseguenza, gli esperimenti successivi possono confrontare la differenza tra basale e 4-AP per misurare la molteplicità.La forza della trasmissione sinaptica può essere aumentata transitoriamente da raffiche di attività sinaptica. Per studiare la molteplicità in condizioni più fisiologiche, la stimolazionefferente può essere utilizzata per aumentare la probabilità di attivazione e rilascio potenziale di azione. Ecco i riassunti dei cambiamenti spontanei di frequenza e ampiezza dell'EPSC a seguito della stimolazione sinaptica.Registrazioni stabili sono essenziali per un'interpretazione accurata dei dati. Descrivere i dati se la resistenza all'accesso cambia di oltre il 20% durante la registrazione, in quanto ciò potrebbe confondere l'analisi. Questo protocollo offre un modo semplice per stimare la molteplicità sinaptica, che è un fattore determinante dell'efficacia sinaptica e della sua plasticità in diverse condizioni fisiologiche e fisiopatiche.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Coltura ed Elettrofisiologia di Celle NRCC patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Ricerca

Neuroscienze

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

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Sezione tecnica del Patch Clamp per l'analisi di plasticità indotta su apprendimento

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Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

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Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

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