Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
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J. s. は、オンタリオ州の大学院の奨学金を受け取った。ウィスコンシン. は、精神的な健康の研究のカナダから新しい研究者フェローシップを受けた。この作品は、健康の研究 (PJT 148707) 自然科学と工学研究会のカナダ (06106-2015 RGPIN) およびカナダの研究所から W.I に運営費交付金によってサポートされます。

すべての動物実験は、動物のケア委員会のウェスタン オンタリオ大学動物ケアのガイドライン (AUP #2014-031) のカナダの評議会に従ってによって承認されます。
1. ソリューション
<ol><li>
ソリューションをスライス
	<ol>
<li>スライスの溶液組成は表 1を参照してください。</li>
		<li>20 x の原液を事前に準備、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。</li>
		<li>1 x...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

成功したパッチ クランプ電気生理学実験のための重要な要件の 1 つが健康的なスライス/セルを取得します。ご説明されているプロトコルは、PVN ニューロンを含む視床下部のスライスに最適です。他の脳領域が必要があります変更・ スライス方法21,22,23,24。録音だけ膜抵抗などセルのプロパティ?...

シナプス伝達機構はニューロン間のコミュニケーションのため、したがって、脳の機能。シナプス伝達は、不安定なも、変調信号1への応答ようにも活動に依存した方法でその効果を変更できます。したがって、シナプス機能を調べると、神経科学研究の主要な焦点がされています。全細胞パッチ クランプ電気生理学は私たちを案出する実験デザインとデータ解析によるシナプス伝達の詳細な生物物理・分子機構を理解することができる汎用性の高いテクニックです。一般的なアプローチ、おそらく技術とコンセプトのシンプルさ、ためにミニチュア興奮性/抑制性シナプス後電流の測定は (私/Ips) 電圧クランプ構成2,3,4,5,6個々 Mpsc は、それぞれ神経伝達物質シナプス前ターミナル7 から解放の結合への応答のイオン型シナプス後受容体 (例えば AMPA とギャバA受容体) を介してイオンの流れを表す。.電位依存性 Na+チャネル ブロッカー テトロドトキシン (TTX) の存在下で記録を取得するとため、リリースの活動電位非依存および通常単一シナプス小胞神経伝達物質が含まれているが含まれます。この仮定に基づいて、Mpsc の平均振幅広くとして粗見積もり素量のサイズは、数と反対のシングル リリース サイト シナプス後受容体の機能を表します。その一方で、Mpsc の周波数は、シナプス シナプス後細胞とその平均放出確率に終了の合計数の組合せを表すと見なされます。ただし、これらのパラメーターは、シナプスのシナプスの多様性別変数 multiplicativity を測定しない-シナプス伝達の有効性のために重要であります。
シナプス伝達7,8,9の量子理論に基づく、ニューロンのペア間の特定の接続の強さは 3 つの要因に依存している: 機能性シナプス (N) の数、単一シナプス小胞 (量子サイズのリリースにシナプス応答Q) および神経伝達物質のリリース (Pr) の確率。シナプスの多様性は、 Nと同じです。乗法性シナプスの刈り込みやシナプスの多様性の開発は、開発全体と別の病気の状態3,4,6,10にプラスチックです。このため、健康と病気におけるシナプス伝達の有効性を理解するための重要な含意をシナプスの多様性を特徴付けます。電子顕微鏡などの手法は、同じシナプス後ニューロン11,12、上に同じ軸索からシナプスの複数の連絡先を検出することによりシナプスの多様性の構造的な証拠を識別できます。 13,14。しかし、これらの構造的に識別された multisynapses は機能的サイレント15,16をすることができます。指定された接続は、複数の機能リリース サイトかどうかを識別することができます対の全体セルの録音などの電気生理学的アプローチを技術的に困難なNの精密機能検査が必要最小限と単一推定軸索を募集することを目指す刺激アプローチ。
このプロトコルではもともと夏ら2によって開発された方法を採用することによりシナプスの多様性を推定するための簡単な方法をについて説明します。この手法には、自発の Psc (sPSCs) ・ Mpsc 全体細胞のパッチ クランプ電気生理学、特定のニューロンに対するすべての入力間シナプスの多様性の程度を推定することができますを使用しての測定が含まれます。 以前に定義した、シナプスの多様性は、与えられた前及びシナプス後ニューロン間のシナプスの数を反映します。複数のシナプス活動電位によって同調で募集、大きい振幅 PSC を生成する個々 の (すなわち素量) Psc の時間加算の高確率になります。 MPSC 録音で (どの活動電位 TTX によってブロックされる) で個々 の (非同期) Mpsc の時間加算の確率は低い。この原理を使用して、mPSC 振幅に (活動電位依存型リリース) 用の振幅を比較することによってシナプスの多様性を推定できます。
多様性の存在を確認するには、は、4 つの実験とその解析例としてグルタミン酸作動性工を使用してについて説明します。高速の同じ方法を使用することができますただし、gaba 作動性/グリシン作動性神経伝達 (Ips)。各実験のための簡単な理論的根拠を説明します。まず、前述のように、シナプスの多様性は mEPSCs に sEPSCs の振幅を比較することによって推定できます。このアプローチの 2 つの要件があります。1) シナプス前の軸索は、録音中は、活動電位の十分な数を発火しなければならないし、複数のシナプス活動電位の到着時に神経伝達物質を解放するように、2) Prが高くなる必要があります。これらの要件を満たすために sEPSCs を最初低 Ca2 +人工髄液 (アプライド) に記録された、K+のチャネル拮抗薬 4 アミノピリジン (4 AP) を行動を高めるための低濃度存在下で記録されます。潜在的な発砲と Pr。その後、活動電位発火は TTX と電位依存性 Ca2 +チャネル ブロッカー Cd2 +減 Pr によってブロックされます。MEPSC の sEPSCs (4AP) での振幅を比較 (4AP、TTX、Cd と2 +)。2 番目の実験では、Ca2 +に置換されますモル Sr2 + desynchronize 小胞の放出にアプライドで。Ca2 +は小胞の同期のリリースに必要な Sr2 +交換多重度を示している大振幅 sEPSCs を削除してください。第三に、機械論的に、多様性起因できるいずれかの複数のシナプス連絡先同じシナプス後ニューロンまたは多胞性のリリース (すなわち複数小胞の放出単一シナプスの接触内)17,18。多様性の 2 つのタイプを区別するために第 3 実験使用低親和性、高速分離競争力の拮抗薬 AMPA 受容体 γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18大きいかどうかを決定するにはsEPSC は、独立したシナプスのシナプス後受容器の重なり人口に作用する多胞性のリリース時間の加算の結果です。多胞性のリリースから大振幅イベントが発生した場合、複数のシナプスの接触の時間の総和から生じる大規模な sEPSCs によって同様に影響されるに対し γ-DGG は大きいのより小さいのに比べて sEPSCs を抑制することで有効性が低くなりますΓ-武神。4 番目の実験より生理学的方法を使用して、活動電位発火、すなわち求心性のシナプス刺激を強化します。シナプスのバーストは、刺激の求心性神経の自発性活動電位発火と放出確率を促進/増加できる一過性。したがって、このアプローチはより生理的な方法でマニフェストに多様性をことができます。
次のプロトコルは、マウス視床下部組織のこれらの実験を行う方法を説明します。具体的には、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン (CRH) (PVN) 視床下部の室傍核ニューロンが使用されます。全体細胞のパッチ クランプ電気生理学を実施するための手順について説明し、シナプスの多様性をテストする特定の実験を説明します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

中枢神経系のニューロンのペアはしばしば複数のシナプスの連絡先および/または機能神経伝達物質のリリース サイト (シナプス多重度) を形成します。シナプスの多様性は開発中とされているシナプス伝達の有効性の重要な決定要因、さまざまな生理的条件で変化とプラスチック。ここでは、我々 は終了急性脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ電気生理学を使用して指定されたシナプス後ニューロンにシナプスの多様性の程度を推定するための実験を概説します。具体的には、自発性興奮性シナプス電流 (sEPSCs) の振幅とミニチュア興奮性シナプス電流 (mEPSCs) の違いを比較する電圧クランプ記録がされます。このメソッドの背後にある理論は、多様性を示す求心性入力は各シナプスの接触時に発生する同期のリリースのための大きい、電位依存性 sEPSCs を表示すること。対照的に、活動電位に依存しないリリース (これは非同期) 小さい振幅 mEPSCs が生成されます。この記事は一連の実験とシナプスの多様性の存在を特徴付けるための分析の概要し、要件と技術の限界について説明します。この手法は、生体に影響を与える異なった頭脳区域でシナプスの連絡先の組織でどのように異なる行動、薬理学的または環境介入を調査に適用できます。

上記のプロトコルでは、例としてマウス視床下部ニューロンを用いたシナプスの多様性の度合いを調べる細胞パッチ クランプ電気生理学を使用する方法について説明します。このスライスの準備方法は、腫れ膜または核 (図 1) を持っていない健康な生菌を得られるはず。プロトコルの各ステップは組織や録音の質の健康のために重要です。
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Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

全細胞パッチク電気生理学を用いたシナプスの多様性の評価

ここでは、急性脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ電気生理学を使用して機能的なシナプスの多様性を評価するためのプロトコルを提案する.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

脳では、ニューロンのペアはしばしばシナプス多重度と呼ばれる複数のシナプス接触を形成する。しかし、シナプス多重度の精密な検査には、技術的に困難な実験が必要です。このプロトコルは全細胞パッチクランプ電気生理学を用いたシナプス多重度の総推定のための簡単な方法を記述する。この方法は、シナプス多重度を調査するために、任意の種および脳領域に適用することができる。この方法は、全細胞パッチクランプ電気生理学の基本的なスキルを必要とします。低く、安定したアクセス抵抗で高品質の記録を得ることは、データの正確な解釈のために重要です。全セル構成を取得するには、録音ピペットをスライスの上に置き、ピペット電流を電圧クランプモードでオフセットします。ピペットにわずかな正圧を加え、栓をロックします。次に、無傷の膜を有する健康な細胞を選択し、ピペットで組織に近づく。陽圧は組織に若干の障害を引き起こすはずです。細胞表面に小さなディンプルが形成されるまで、ピペットを斜めの動きでゆっくりと細胞に近づけます。次に、陽圧ロックを解除します。セルはシールを形成し始め、抵抗は1ギガオームを超えて増加します。電圧クランプで、セルをマイナス68ミリボルトで保持します。その後、ピペットを細胞から斜めにわずかに引き離し、余分な圧力を取り除きます。速く、遅いピペットの容量を補う。ピペットホルダーに接続されたチューブを通して短い吸引を施して、細胞を突破し、全細胞構成を得ます。次に、電気生理学データ取得および解析ソフトウェアで膜試験ウィンドウ上の細胞モードに切り替えます。その後の実験では、記録浴の温度を摂氏27~30度、流量を1分あたり1.5~2ミリリットルに保ちます。多重度シナプスでは、作用電位は神経伝達物質放出を同期させ、より大きなポストナプティック電流を生成する。TTXおよびカドミウムによるブロッキング作用電位およびカルシウム依存性の小胞放出は、ポストナプティック電流の総和を妨げ、振幅を減少させる。多重度がない場合、ブロックアクション電位は振幅を変えない。実験1では、多重度を推定するために、細胞をマイナス68ミリボルトで保持し、低カルシウムaCSFを浸透させます。自発性のEPSを少なくとも5分間記録して、安定したベースラインを確保します。次に、30マイクロモル4-APをaCSFに加え、作用電位依存事象を増加させ、自発的なエプチクを少なくとも10分間記録して薬物効果を完全に得る。次に、4-APでaCSFに0.5マイクロモルTTXと10マイクロモルカドミウムを加え、ミニチュアのEPSCを少なくとも10分間記録します。オフライン分析の場合は、4-AP の適用直前のベースラインの最後の 1 分、4-AP アプリケーションの 10 分、および TTX アプリケーションの 10 分を使用します。この実験では、シナプス小胞の放出を非同期化するために細胞外カルシウムをストロンチウムに置き換える。したがって、多重度が存在する場合、これは、ポストナプティック電流の振幅を減少させる必要があります。実験2では、通常のカルシウムaCSFで細胞を浸透させながら、少なくとも5分間自発的なEPSを記録する。ベシクル放出を解除するには、ストロンチウムaCSFで細胞を浸透させ、自発的なEPSを記録します。オフライン解析では、大きな振幅の自発的なエプティックが小胞の同期放出によるものかどうかを判断するために、ベースラインの最後の1分間をストロンチウムaCSFアプリケーションの10分と比較します。多重度は多面的な放出を伴い、シナプス裂に高い神経伝達物質濃度を引き起こす。低親和性AMPA受容体拮抗薬であるγ-DGGの添加は、小さな単一回の回価の心鼻波流に比べてより大きな多量体の効果的な阻害を招く。多面放出がなければ、ガンマ-DGGは大きく、より小さいポストナプティック電流に対して同様に有効である。実験3では、多面的な放出をテストするために、少なくとも5分間、低カルシウムaCSF中の自発的なエプチを記録する。灌流システムを介してaCSFに30マイクロモル4-APを追加します。自発的なEPSを少なくとも10分間記録します。次に、4-AP を搭載した aCSF に 200 マイクロモルガンマ DGG を加え、少なくとも 10 分間、自発的なエプティクスを記録します。別のセルでの制御実験として、手順を繰り返しますが、ガンマDGGの代わりに低濃度のDNQXを適用します。オフライン分析の場合は、各薬物アプリケーションの最後の分を分析します。シナプス活動のバーストは、一過性の自発的作用の潜在的な発火と刺激された発泡剤の放出確率を増加させることができます.ニューロンが多重度を示す場合、作用電位の増加は、ポストナプティック電流の振幅の一過性増加を引き起こすはずです。実験4では、通常のカルシウムaCSFに自発的なエプティクスを記録する。作用電位焼成を高めるには、aCSFを充填した単極ガラス電極を2秒間20ヘルツの割合で刺激し、インターバースト間隔20秒で10回繰り返します。分析には、最初の刺激の前に5,000ミリ秒の自発的なEPSをベースラインとして使用し、最終的な刺激の後の10〜300ミリ秒の自発的なEPSCと比較します。次に、平均振幅と周波数変化を10回の試行で行います。シナプス電流を検出して解析するプログラムを用いて、自発性のEPCやミニチュアEPCを解析します。AMPA受容体媒介性のEPSを検出するために、推奨される検出パラメータとノンストップ解析機能を使用してください。各記録を手動でスキャンして、プログラムが各イベントを正確に検出していることを確認します。イベント データをクリップボードにコピーしてエクスポートし、データ管理ソフトウェアに貼り付けます。次に、各薬剤治療の平均頻度と振幅を計算し、関連する統計分析を行います。ここに示す例では、4-AP は、自発的な EPS の振幅と周波数の両方を増加させます。TTXとカドミウムのその後の適用は振幅および頻度の両方を減少させる。ここでは、記録からの自発的なEPSC振幅の分布です。ここで調べた視床下部ニューロンでは、ベースラインとTTX条件の振幅と周波数は同じであり、ベースラインの自発的なEPSCは非常に少数の作用電位依存性のEPSを含み、示唆している。したがって、その後の実験では、ベースラインと4-APの差を比較して多重度を測定することができる。シナプス伝達の強度は、シナプス活性のバーストによって一過性増加することができる。より生理的条件下での多重度を調べるには、不感な刺激を用いて、作用電位の発火および放出確率を高めることができる。シナプス刺激に続く自発的なEPSC周波数と振幅変化の要約を次に示します。データを正確に解釈するには、安定した記録が不可欠です。このデータは、分析を混乱させる可能性があるため、記録中にアクセス抵抗が 20% 以上変化した場合にデータを記述します。このプロトコルは、シナプス多重度を推定する簡単な方法を提供します, これは、異なる生理学的および病態生理学的条件におけるシナプス効果とその可塑性の重要な決定要因であります.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

NRCCパッチクランプチップ上で細胞の培養と電気生理学

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

コンピュータ支援多電極パッチクランプシステム

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

チャンネルロドプシンにおけるイオン選択性の電気生理学的測定のための全細胞パッチクランプ記録

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

スライス パッチ ・ クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

膠様質ニューロンの細胞パッチク ランプ記録のため急性脊髄スライスの準備

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...