Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

제는 온타리오 대학원 장학금을 받았다. W.I. 정신 건강 연구의 캐나다에서 새로운 탐정 친교를 받았다. 이 작품은 건강 연구 (PJT 148707) 자연과학 및 공학 연구 위원회의 캐나다 (06106-2015 RGPIN)와 캐나다 연구소에서 W.I 보조금 운영 지원.

모든 동물 실험 동물 관리 위원회의는 웨스턴 온타리오 대학 동물 관리 지침 (AUP #2014-031)에 캐나다 위원회에 의해 승인 됩니다.
1입니다. 솔루션
<ol><li>
조각화 솔루션
	<ol>
<li>조각화 솔루션의 구성 표 1 을 참조 하십시오.</li>
		<li>20 x 재고 솔루션을 사전에 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 그것을 저장.</li>
		<li>1 x 조각화 솔루션, NaHCO3, 포도 ?...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

성공적인 패치 클램프 전기 생리학 실험에 대 한 한 가지 중요 한 요구 건강 한 조각/셀을 얻는 이다. 우리의 설명된 프로토콜 hypothalamic 조각 PVN의 뉴런을 포함 하는 최적화 되어 있습니다. 다른 뇌 영역 해야 수정 솔루션 및 조각화 방법21,22,,2324. 기록, 그것은 막 저항 등 셀 속성을 지속적으로 모니터?...

시 냅 스 전송 뉴런 간의 통신에 대 한 근본적인 메커니즘 이며 따라서, 두뇌 기능. 시 냅 스 전송 또한 불안정 하 고 방식 활동-종속 뿐만 modulatory 신호1응답에서 그 효능을 변경할 수 있습니다. 따라서, 시 냅 스 기능 검사 신경 과학 연구의 주요 초점 되었습니다. 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학 있도록 고안 실험적인 디자인 및 데이터 분석, 시 냅 시스 전송의 깊이 있는 생물 및 분자 메커니즘을 이해 하는 다양 한 기술입니다. 일반적으로 사용 되, 아마도 때문에 기술과 개념의 단순 방식은 미니어처 흥분 성의/금지 postsynaptic 전류 측정 (나 / Ipsc) 전압 아래 클램프 구성2,3, 4 , 5 , 6. 개별 mPSCs 연 접 터미널 7에서에서 발표 했다 그들의 각각 신경 전달 물질의 바인딩에 응 postsynaptic ionotropic 수용 체 (예: AMPA 및 GABAA 수용 체)를 통해 이온의 흐름을 나타내는 . 전압 개폐 나+ 채널 차단제 테트로도톡신 (TTX) 존재 녹음을 얻을 있기 때문에 릴리스 활동 전위 독립적 이며 일반적으로 신경 전달 물질을 포함 하는 단일 시 냅 스 소포를 포함 한다. 이 가정에 기초를 두어, mPSCs의 평균 진폭 널리 이용 된다 원유 견적으로 수와 단일 릴리스 사이트를 반대 하는 postsynaptic 수용 체의 기능을 나타내는 quantal 크기에 대 한. 다른 한편으로, mPSCs의 주파수 대표 postsynaptic 세포 그리고 그들의 평균 출시 확률에 종료 시 냅 스의 총 수의 조합으로 간주 됩니다. 그러나, 이러한 매개 변수는 시 냅 스, 또는 시 냅 스 다양성의 또 다른 변수 multiplicativity 측정 하지 않습니다-시 냅 시스 전송의 효능에 대 한 중요 하다.
시 냅 스 전송7,,89의 quantal 이론에 따라, 신경 세포의 쌍 사이 지정된 된 연결의 힘은 세 가지 요소에 따라 달라 집니다: 기능 시 냅 스 (N)의 수는 단일 시 냅 스 소포 (quantal 크기;의 출시에 postsynaptic 응답 Q)와 신경 전달 물질 방출 (Pr)의 확률. 시 냅 스 다양성은 n과 같습니다. 시 냅 스 다양성의 개발 또는 곱셈 시 냅 스의 가지 치기는 플라스틱 개발에 걸쳐 및 다른 질병 국가3,4,,610에. 이러한 이유로, 건강 및 질병에 시 냅 시스 전송의 효능을 이해 하기 위한 중요 한 의미는 다양성을 시 냅 스 특성화. 기법, 전자 현미경 등 여러 시 냅 스 연락처는 동일한 postsynaptic 신경11,12, 이전에 동일한 축 삭에서 발생을 감지 하 여 다양성을 시 냅 스의 구조적 증거를 확인할 수 있습니다. 13,14. 그러나, 이러한 구조적으로 확인 된 multisynapses 기능 자동15,16수 있습니다. N 의 정확한 기능 시험 주어진된 연결에 여러 기능 릴리스 사이트를 식별할 수 있는 짝된 전체 셀 녹음 등 electrophysiological 방법을 기술적으로 도전적인 필요 최소한의 단일 putative 축 삭을 모집을 목표로 하는 자극 접근.
이 프로토콜에서 우리 Hsia 외2에 의해 원래 개발 방법을 채택 하 여 시 냅 스 다양성을 추정을 위한 간단한 방법을 설명 합니다. 이 기술은 자연 Psc (sPSCs) 및 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학, 특정된 뉴런에 대 한 모든 입력에 걸쳐 시냅틱 복합성의 정도 예측할 수 있는 사용 하 여 mPSCs의 측정을 포함 한다.  로 이전에 정의 된, 시 냅 스 다양성 주어진된 사전 및 postsynaptic 신경 세포 사이의 시 냅 스의 수를 반영 합니다. 여러 개의 시 냅 스는 활동 전위에 의해 synchrony에서 모집 하 고, 큰 진폭 PSC를 생성 하는 개별 (즉, quantal) Psc의 일시적인 합계의 확률이 매우 높은 있을 것입니다.  MPSC 기록에서 (에 있는 활동 전위는에 의해 차단 TTX), 개인 (비 동기) mPSCs의 일시적인 합계의 확률은 낮습니다. 이 논리를 사용 하 여, 시 냅 스 다양성 sPSC 진폭 (활동 전위 종속 자료)와 mPSC 진폭을 비교 하 여 추정 수 있습니다.
다중성의 존재를 검사 4 개의 실험 및 예를 들어 glutamatergic EPSCs를 사용 하 여 그들의 분석을 설명 합니다. 그러나, 동일한 접근 방식을 사용할 수 있습니다 빠른 GABAergic/glycinergic 전송 (Ipsc). 각 실험에 대 한 간략 한 근거 아래 설명 되어 있습니다. 첫째, 위에서 설명한 mEPSCs에 sEPSCs의 진폭을 비교 하 여 시 냅 스 다를 추정 수 있습니다. 이 접근;에 대 한 두 가지 요구 사항이 있습니다. 1) 연 접 축 삭 한다 활동 전위의 충분 한 수 기록, 중 고 2) Pr 수 있어야 합니다 높은 여러 시 냅 스 신경 활동 전위의 도착 시 해제. 이러한 요구 사항을 충족, sEPSCs는 낮은 Ca2 + 인공 뇌 척수 (실제)에 처음 기록 된 고 K+ 채널 길 항 제, 행동 증가 4-Aminopyridine (4-AP)의 낮은 농도의 기록 잠재적인 발사 하 고 Pr. 다음 발사 하는 활동 전위는 TTX 및 홍보 전압-문이 캘리포니아2 + 채널 차단 Cd2 +감소에 의해 차단 됩니다. MEPSC의 sEPSCs (4AP)와 비교 (4AP, TTX와 Cd2 +). 두 번째 실험에서 캘리포니아2 + 아데닌 Sr2 + 기 출시 desynchronize를 실제에 의해 대체 됩니다. 캘리포니아2 + vesicles의 동기 릴리스에 대 한 필요는, Sr2 + 교체 다양성을 나타내는 큰 진폭 sEPSCs를 제거 한다. 셋째, mechanistically, 다양성에 발생할 수 있습니다 여러 개의 시 냅 스 연락처 중에서 동일한 postsynaptic 신경 또는 multivesicular 릴리스 (즉, 단일 시 냅 스 접촉 내 발표는 여러 vesicles)17,18. 다양성의 두 종류를 구분 하는 세 번째 실험 사용 하 여 낮은 선호도, 빠른 출신과 경쟁 길 항 근 AMPA 수용 체, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,의18 큰 있는지 여부를 확인 하 sEPSC 독립 시 냅 스의 multivesicular 릴리스 postsynaptic 수용 체의 겹치는 인구에 일시적인 합계의 결과입니다. 큰 진폭 이벤트 multivesicular 방출에서 발생 하는 경우 γ-DGG 효과가 있을 것입니다 덜 큰 작은에 비해 sEPSCs 억제에 큰 sEPSCs 여러 개의 시 냅 스 연락처의 일시적인 합계에서 발생 하는 것입니다 마찬가지로 영향을 받을 반면 Γ-DGG입니다. 4 실험에서 더 생리 메서드는 활동 전위 발사, 즉 입성 시 냅 시스 자극을 향상 시키기 위해 사용 됩니다. 시 냅 스 활동의 파열 수 뚜렷이 증가/촉진 자극된 afferents의 자발적인 활동 전위 발생 및 릴리스 확률. 따라서,이 이렇게 다양성이 더 생리 적인 방법으로 매니 페스트 수 있습니다.
다음 프로토콜 마우스 hypothalamic 조직에 이러한 실험을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 특히, corticotropin 공개 호르몬 (CRH) 신경 시상 하 부 (PVN)의 paraventricular 핵의 사용 됩니다. 우리는 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 실시 하기 위한 절차를 설명 하 고 시냅틱 다양성에 대 한 테스트를 특정 실험을 설명.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

중앙 신경 조직에서 뉴런의 쌍 종종 여러 개의 시 냅 스 연락처 및/또는 기능 신경 전달 물질 방출 사이트 (synaptic 다양성)를 형성 한다. 시 냅 스 다 플라스틱 이며 개발에 걸쳐 변화와 다른 생리 적인 조건에서 시 냅 시스 전송의 효능에 대 한 중요 한 결정 되 고. 여기, 우리는 실험 종료 급성 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 주어진된 postsynaptic 신경에 시 냅 스의 복합성의 정도 추정에 대 한 개요. 특히, 전압 클램프 녹음 자발적인 흥분 성의 postsynaptic 전류 (sEPSCs)의 진폭 및 미니어처 흥분 성의 postsynaptic 전류 (mEPSCs)의 차이 비교 하는 데 사용 됩니다. 이 방법의 뒤에 이론은 이다 다양성을 전시 하는 구심 성 입력 큰, 활동 전위 종속 sEPSCs 각 시 냅 스 접촉에서 발생 하는 동기식 릴리스 때문에 표시 됩니다. 반면에, 활동 전위 독립적인 릴리스 (비동기) 인 작은 진폭 mEPSCs를 생성 합니다. 이 문서는 실험 및 분석 시 냅 스 다양성의 존재의 특성의 집합을 설명 하 고 요구 사항 및 기술의 한계에 설명 합니다. 이 기술은 vivo 영향 서로 다른 뇌 영역에 시 냅 스 연락처의 조직에에서 어떻게 다른 행동, 약리학 또는 환경적 개입 조사에 적용할 수 있습니다.

위의 프로토콜 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 예를 들어 마우스 hypothalamic 뉴런을 사용 하 여 시 냅 스 복합성의 정도 검사 하는 방법을 설명 합니다. 이 슬라이스 준비 기술은 건강 한 가능한 세포가 없는 부 어 막 또는 핵 (그림 1) 항복 한다. 프로토콜의 각 단계 조직 및 녹음의 품질의 건강을 위해 중요 하다.
<p class="jove_content" fo:keep-together.w...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

전기 생리학 전체 셀 패치 클램프를 사용 하 여 시 냅 스 다양성의 평가

여기, 선물이 급성 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 기능 시 냅 스 다양성을 평가 하기 위한 프로토콜.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

두뇌에서, 신경 쌍의 쌍은 수시로 시냅스 복합성에게 불린 다중 시냅스 접촉을 형성합니다. 그러나 시냅스 복합성에 대한 정확한 검사는 기술적으로 도전적인 실험이 필요합니다. 이 프로토콜은 전세포 패치 클램프 전기 생리학을 사용하여 시냅스 복합성의 총 추정을 위한 간단한 방법을 설명합니다.이 방법은 시냅스 복합성을 조사하기 위해 모든 종과 뇌 영역에 적용 될 수있다. 이 방법은 전세포 패치 클램프 전기 생리학에서 기본적인 기술이 필요합니다. 낮은 안정적인 액세스 저항으로 고품질 레코딩을 얻는 것은 데이터의 정확한 해석에 매우 중요합니다.전체 셀 구성을 얻으려면 기록 파이펫을 슬라이스 바로 위에 놓고 전압 클램프 모드에서 파이펫 전류를 오프셋합니다. 파이펫에 약간의 양압을 바르고 스톱콕을 잠급니다. 다음으로, 그대로 막으로 건강한 세포를 선택하고 파이펫으로 조직에 접근하십시오.양압은 조직에 약간의 장애를 야기한다. 작은 보조제가 세포 표면에 형성될 때까지 피펫을 대각선 동작으로 셀에 더 가깝게 가져옵니다. 그런 다음 양압 잠금을 해제합니다.셀은 씰을 형성하기 시작하고 저항은 하나의 기가옴 이상으로 증가합니다. 전압 클램프에서 셀을 마이너스 68 밀리볼트로 고정합니다. 이어서, 피펫을 세포에서 대각선으로 당겨 과도한 압력을 제거합니다.빠르고 느린 파이펫 커패시턴스를 보상합니다. 파이펫 홀더에 연결된 튜브를 통해 간단한 흡입을 적용하여 세포를 돌파하고 전세포 구성을 얻습니다. 그런 다음, 전기생리학 데이터 수집 및 분석 소프트웨어에서 멤브레인 테스트 창에 셀 모드로 전환한다.기록 용 목욕의 온도를 섭씨 27~30도에서 유지하며, 후속 실험을 위해 분당 1.5~2밀리리터의 유속량을 유지한다. 복합성 시냅스에서, 행동 잠재력신경 전달 물질 방출을 동기화 하 고 더 큰 포스트 naptic 전류를 생성. TTX와 카드뮴으로 작용 잠재력 및 칼슘 의존성 혈관 방출을 차단하면 포스트냅틱 전류가 합산되지 않도록 하고 진폭을 감소시다.다각성이 없는 경우 차단 작업 잠재력은 진폭을 변경하지 않습니다. 실험 1에서, 복합성을 추정하기 위하여는, 저칼슘 aCSF로 그것을 견딜 동안 영하 68 밀리볼트에서 세포를 보유합니다. 안정적인 기준선을 보장하기 위해 자발적인 EPSC를 최소 5분 동안 기록합니다.다음으로, aCSF에 30개의 마이크로몰라 4-AP를 추가하여 작용 잠재력 에 의존하는 이벤트를 늘리고, 완전한 약물 효과를 얻기 위해 최소 10분 동안 자발적인 EPSC를 기록한다. 이어서, 4-AP로 aCSF에 0.5 마이크로몰라 TTX 및 10개의 마이크로몰라 카드뮴을 추가하고, 미니어처 EPSC를 최소 10분 동안 기록한다. 오프라인 분석을 위해 4-AP 적용 직전의 마지막 1분, 4-AP 애플리케이션의 10분, TTX 애플리케이션의 10분을 사용하십시오.이 실험에서 세포외 칼슘은 시냅스 소포의 방출을 비동기화하기 위해 스트론튬으로 대체됩니다. 따라서 다각성이 있는 경우, 이것은 포스트냅스 전류의 진폭을 감소시켜야 한다. 실험 2에서는, 일반적인 칼슘 aCSF를 가진 세포를 perfusing하는 동안 적어도 5 분 동안 자발적인 EPSCs를 기록합니다.소포 방출의 비동기화를 위해 스트론튬 aCSF로 셀을 인코딩하기 시작하고 자발적인 EPSC를 기록하십시오. 오프라인 분석을 위해, 큰 진폭 자발적 EPSC가 소포의 동기 방출때문인지 여부를 확인하려면 기준기의 마지막 순간을 스트론튬 aCSF 응용 프로그램의 10분에 비교한다. 다발성은 시냅스 갈라진 에서 더 높은 신경 전달 물질 농도를 일으키는 다발성 방출을 관련시킬 수 있습니다.감마-DGG의 추가, 낮은 친화 AMPA 수용체 길항제, 작은 uniquantal 포스트 naptic 전류에 비해 더 큰 다콴탈의 덜 효과적인 억제로 이끌어 냅니다. 다각적 방출없이, 감마-DGG는 더 크고 작은 포스트 냅스 전류에 동등하게 효과적일 것입니다. 실험 3에서는 다각성 방출을 테스트하기 위해 저칼슘 aCSF에서 최소 5분 동안 자발적인 EPSC를 기록합니다.관류 시스템을 통해 aCSF에 30 개의 미세 몰라 4-AP를 추가하십시오. 자발적인 EPSC를 최소 10분 동안 기록합니다. 그런 다음 4-AP로 200 개의 마이크로 몰라 감마-DGG를 aCSF에 추가하고 자발적인 EPSC를 최소 10 분 동안 기록합니다.별도의 셀에서 대조군 실험으로서 절차를 반복하지만 감마-DGG 대신 DNQX의 낮은 농도를 적용한다. 오프라인 분석을 위해 각 약물 응용 프로그램의 마지막 순간을 분석합니다. 시냅스 활동의 버스트는 자극된 포렌트의 자발적인 작용 잠재적 발사 및 방출 확률을 일시적으로 증가시킬 수 있다.뉴런이 복합성을 나타내는 경우, 행동 잠재력의 증가는 포스트 냅스 전류의 진폭의 일시적인 증가를 야기한다. 실험 4에서는 정상적인 칼슘 aCSF에서 자발적인 EPSC를 기록합니다. 작용 잠재력 발사를 증가시키기 위해 aCSF로 채워진 단극성 유리 전극을 2초 동안 20 헤르츠의 속도로 자극하고, 20초 의 인터버스트 간격으로 10회 반복합니다.분석을 위해 첫 번째 자극 전에 5, 000밀리초 자발적 EPSC를 베이스라인으로 사용하고 최종 자극 후 10~300밀리초 의 자발적 EPSC와 비교합니다. 그런 다음 평균 진폭및 주파수 변화를 10번 이상 수행합니다. 시냅스 전류를 감지하고 분석하는 프로그램을 사용하여 자발적인 EPSC 및 소형 EPSC를 분석합니다.AMPA 수용체 매개 EPSC를 검출하기 위해 제안된 검출 파라미터 및 논스톱 분석 기능을 사용합니다. 프로그램이 각 이벤트를 정확하게 감지하고 있는지 확인하기 위해 각 레코딩을 수동으로 검사합니다. 이벤트 데이터를 클립보드에 복사하여 내보내고 데이터 관리 소프트웨어에 붙여넣습니다.다음으로, 각 약물 치료에 대한 평균 주파수 및 진폭을 계산하고 관련 통계 분석을 수행한다. 여기에 표시된 예에서 4-AP는 자발적인 EPSC의 진폭과 빈도를 모두 증가시킵니다. TTX와 카드뮴의 후속 적용은 진폭과 주파수를 모두 감소시다.다음은 레코딩에서 자발적인 EPSC 진폭의 분포입니다. 여기서 조사된 시상 하부 뉴런에서 기준선 및 TTX 조건의 진폭및 주파수는 동일하며, 이는 기준선 자발적 EPSC에 잠재적 인 EPSC가 거의 포함되어 있지 않습니다. 따라서 후속 실험은 기준선과 4-AP 간의 차이를 비교하여 복합성을 측정할 수 있다.시냅스 전송의 강도는 시냅스 활동의 버스트에 의해 일시적으로 증가 될 수있다. 더 많은 생리적 조건 하에서 복합성을 조사하기 위해, 포퍼런트 자극은 행동 잠재적 인 발사 및 방출 확률을 증가시키기 위해 사용될 수있다. 다음은 시냅스 자극 다음의 자발적EPSC 주파수 및 진폭 변경 사항에 대한 요약입니다.안정적인 기록은 데이터의 정확한 해석을 위해 필수적입니다. 이 분석을 혼동 할 수 있기 때문에, 기록 중에 액세스 저항이 20 % 이상 변경하는 경우 데이터를 설명합니다. 이 프로토콜은 시냅스 복합성을 추정하는 간단한 방법을 제공합니다, 이는 다른 생리학적 및 병리학 적 조건에서 시냅스 효능과 가소성의 주요 결정요인입니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

NRCC 패치 - 클램프 칩에 대한 세포의 Culturing 및 전기 생리학

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

연구

신경과학

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

적외선 신경 자극의 메커니즘을 조사하는 전체 세포 패치 클램프

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

컴퓨터를 이용한 다중 전극 패치 클램프 시스템

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

조각 패치 클램프 기술 학습 유도 소성을 분석 하기 위한

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...