Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

JS fikk Ontario Graduate Scholarship. W.I. fikk en ny etterforsker Fellowship fra Mental Health Research Canada. Dette arbeidet er støttet av drift tilskudd til W.I naturvitenskap Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) og Canadian Institute for Health Research (PJT 148707).

Alle dyreforsøk godkjennes av dyr omsorg komiteen av The University of Western Ontario i samsvar med kanadiske Rådet for dyr omsorg retningslinjer (AUP #2014-031).
1. løsninger
<ol><li>
Kutting løsning
	<ol>
<li>Se tabell 1 for sammensetningen av kutting løsningen.</li>
		<li>Forberede en 20 x lagerløsning på forhånd og lagre den på 4 ° C i opptil 1 måned.</li>
		<li>1 x kutting løsning, oppløse NaHCO3, glukose og sukrose i ddH2<...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

En viktig forutsetning for en vellykket oppdatering klemme elektrofysiologi eksperimentet er å få sunn skiver/celler. Våre beskrevet protokollen er optimalisert for hypothalamus skiver som inneholder PVN neurons. Andre hjernen områder kan kreve endret løsninger og slicing metoder21,22,23,24. Opptaket, er det avgjørende å bare godta stabil opptak ved å kontinuerlig overvåke egenskaper s...

Synaptiske overføring er en fundamental mekanisme for kommunikasjon mellom nerveceller, og derfor hjernefunksjonen. Synaptiske overføring er også labilt og kan endre effekt i en aktivitet-avhengige måte også som svar på modulatory signaler1. Derfor har undersøke synaptiske funksjon vært et viktig fokus nevrovitenskap forskning. Hele celle oppdateringen klemme elektrofysiologi er en allsidig teknikk som gjør det muliggjør for oss å forstå, utarbeide eksperimentell design og data analyser, grundig Biofysiske og molekylære mekanismer av synaptic overføring. En brukte tilnærming, kanskje på grunn av enkelhet av teknikk og konsept, er måling av miniatyr eksitatoriske/hemmende postsynaptic strøm (meg / IPSCs) under spenning klemme konfigurasjon2,3, 4 , 5 , 6. individuelle mPSCs representerer flyten av ioner gjennom postsynaptic ionotropic reseptorer (f.eks AMPA og GABAA reseptorer) svar binding av sine respektive nevrotransmittere utgitt fra presynaptic terminal 7 . Fordi opptaket er oppnådd i nærvær av spenning-gated Na+ kanal blokkering tetrodotoxin (TTX), utgivelsen er handlingen potensial-uavhengig og innebærer vanligvis en enkelt synaptic vesicle som inneholder nevrotransmitter. Basert på denne forutsetningen, er gjennomsnittlig amplituden til mPSCs mye brukt som en grov anslag for quantal størrelsen, som representerer antallet og funksjonaliteten til postsynaptic reseptorer motstridende en singelutgivelse nettsted. Frekvensen for mPSCs regnes derimot, representerer en kombinasjon av antall synapser avslutning på postsynaptic cellen og deres gjennomsnittlige utgivelsen sannsynlighet. Men disse parameterne ikke mål en annen variabel-multiplicativity synapser eller synaptic mangfold, som er viktig for effekten av synaptic overføring.
Basert på quantal teorien om synaptic overføring7,8,9, styrken i en gitt sammenheng mellom neurons er avhengig av tre faktorer: antall funksjonelle synapser (N), den postsynaptic svar på utgivelsen av en enkelt synaptic vesicle (quantal størrelse; Q) og sannsynligheten for nevrotransmitter-løslate (P-r). Synaptiske mangfold tilsvarer N. Utviklingen av synaptic mangfold eller beskjæring av multiplikativ synapser er plast i utvikling og i ulike sykdom stater3,4,6,10. Derfor har karakteriserer synaptic mangfoldet viktige implikasjoner for å forstå effekten av synaptic overføring i helse og sykdom. Teknikker, som elektronmikroskop kan identifisere strukturelle bevis på synaptic mangfold av oppdager flere synaptic kontakter fra samme axon på de samme postsynaptic Nevron11,12, 13,14. Disse strukturelt identifisert multisynapses kan imidlertid være funksjonelt stille15,16. Presis funksjonelle undersøkelse av N krever teknisk utfordrende elektrofysiologiske tilnærminger, slik som sammenkoblede hele celle innspillinger som kan identifisere om en gitt tilkobling har flere funksjonell løslate områder og minimal stimulering tilnærminger som mål å rekruttere et enkelt antatte axon.
I denne protokollen beskriver vi en enkel metode for å estimere synaptic mangfold ved å vedta en metode opprinnelig utviklet av Hsia et al2. Denne teknikken innebærer måling av spontane PSCer (sPSCs) og mPSCs med hele celle oppdateringen klemme elektrofysiologi, som tillater oss å estimere graden av synaptic mangfold på tvers av alle innganger til en gitt Nevron.  Som tidligere definert, synaptic mangfold gjenspeiler antall synapser mellom en gitt før og postsynaptic Nevron. Hvis flere synapser er rekruttert i synkronisering av en handling potensial, blir det en høy sannsynlighet for timelige summering av personlige (dvs. quantal) PSCer, genererer en større amplitude PSC.  I mPSC opptak (i hvilken handling potensialer blokkeres av TTX), sannsynligheten for timelige summering av personlige (ikke-synkron) mPSCs er lav. Bruker denne begrunnelsen, kan synaptic mangfold beregnes ved å sammenligne sPSC amplituden (med handlingen potensial-avhengige utgivelse) til mPSC amplituden.
For å undersøke eksistensen av mangfold beskriver vi fire eksperimenter og deres analyser med glutamatergic EPSCs som eksempel. Imidlertid den samme fremgangsmåten kan brukes for rask GABAergic/glycinergic-overføring (IPSCs). En kort begrunnelse for hvert eksperiment beskrives nedenfor. Som forklart ovenfor, kan først synaptic mangfold beregnes ved å sammenligne amplituden til sEPSCs til mEPSCs. Det er to krav til denne tilnærmingen; 1) presynaptic axons må skyte et tilstrekkelig antall handling potensialer under opptak, og 2) Pr må være høy slik at flere synapser løslate nevrotransmitter ved ankomsten av en handling potensial. For å møte disse kravene, er sEPSCs første gang registrert i lav Ca2 + kunstig cerebrospinalvæske (aCSF), og deretter registreres i nærvær av en lav konsentrasjon av K+ kanal antagonist, 4-Aminopyridine (4-AP) øke handling potensielle skyte og Pr. Handlingen potensial avfyring blokkeres av TTX og Pr redusert med en spenning-gated Ca2 + kanal blokker Cd2 +. Amplituden til sEPSCs (med 4AP) er sammenlignet med mEPSC (4AP, TTX og Cd2 +). I andre forsøket, er Ca2 + erstattet av ekvimolare Sr2 + i aCSF å desynchronize vesicle utgivelsen. Ca2 + er nødvendig for synkron utgivelsen av blemmer, bør erstatning med Sr2 + fjerne den store amplituden sEPSCs som mangfold. Tredje mechanistically, mangfold kan resultere fra flere synaptic kontakter til samme postsynaptic Nevron eller multivesicular release (dvs. flere blemmer utgitt innen en enkelt synaptic kontakt)17,18. For å skille mellom de to typene mangfold, bruker tredje forsøket en lav affinitet, rask dissociating konkurransedyktig antagonist av AMPA reseptorer, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 til å bestemme om store sEPSC er et resultat av timelige summering av uavhengige synapser eller multivesicular løslate opptrer på en overlappende befolkning på postsynaptic reseptorene. Hvis store amplituden hendelsene oppstår fra multivesicular utgivelse, blir γ-DGG mindre effektiv på hemme større sammenlignet med mindre sEPSCs, mens store sEPSCs som oppstår fra timelige summering av flere synaptic kontakter vil bli like påvirket av DEN BLE-DGG. I fjerde forsøket brukes en mer fysiologiske metoden til å forbedre handling potensial skyting, nemlig afferente synaptic stimulering. Pakker med synaptic aktivitet kan transiently økning/lette spontan handling potensial skyting og slipp sannsynligheten stimulert afferente. Derfor kan denne tilnærmingen mangfold å manifestere i en mer fysiologiske måte.
Følgende protokollen beskriver metoden for å gjennomføre disse eksperimentene i musen hypothalamus vev. Spesielt brukes corticotropin slippe hormone (CRH) nevroner i paraventricular kjernen i hypotalamus (PVN). Vi beskriver fremgangsmåtene for å gjennomføre hele celle oppdateringen klemme electrophysiology og forklare de bestemte eksperimentene for å teste for synaptic mangfold.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

I det sentrale nervesystemet, et par av neurons ofte danner flere synaptic kontakter og/eller funksjonelle nevrotransmitter release nettsteder (synaptic mangfold). Synaptiske mangfold er plast og endringer i utvikling og i ulike fysiologiske forhold, er en viktig determinant for effekten av synaptic overføring. Her skissere vi eksperimenter for å estimere graden av mangfoldet av synapser avslutning på en gitt postsynaptic Nevron bruker hele-celle oppdateringen klemme elektrofysiologi i akutt hjernen skiver. Spesielt brukes spenning-klemme opptak til å sammenligne forskjellen amplituden til spontan eksitatoriske postsynaptic strøm (sEPSCs) og miniatyr eksitatoriske postsynaptic strøm (mEPSCs). Teorien bak denne metoden er at afferente innganger som viser mangfold vises store, action potensial-avhengige sEPSCs grunn til synkron utgivelsen som oppstår på hver synaptic kontakt. Derimot genererer handling potensial-uavhengig utgivelse (som er asynkron) mindre amplituden mEPSCs. Denne artikkelen skisserer en rekke eksperimenter og analyser som karakteriserer eksistensen av synaptic mangfold og diskuterer krav og begrensninger av teknikken. Denne teknikken kan brukes for å undersøke hvordan forskjellige atferdsmessige, farmakologiske eller miljømessige tiltak vivo påvirker organiseringen av synaptic kontakter i ulike hjernen områder.

Over protokollen beskriver en metode for å bruke hele celle oppdateringen klemme elektrofysiologi for å undersøke graden av synaptic mangfold, bruke musen hypothalamus nevroner som et eksempel. Denne stykke forberedelse teknikken skal gi friske levedyktig celler som ikke har en hoven membran eller kjernen (figur 1). Hvert trinn i protokollen er viktig for helsen til vev og kvaliteten på opptakene.
<img alt="...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Evaluering av Synaptic mangfold bruker hele-celle Patch-klemme elektrofysiologi

Her presenterer vi en protokoll for å vurdere funksjonelle synaptic multiplisiteten bruker hele-celle oppdateringen klemme elektrofysiologi i akutt hjernen skiver.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

I hjernen danner et par nevroner ofte flere synaptiske kontakter, som kalles synaptisk mangfold. Nøyaktig undersøkelse av synaptisk mangfold krever imidlertid teknisk utfordrende eksperimenter. Denne protokollen beskriver en enkel metode for grov estimering av synaptisk mangfold ved hjelp av helcellede patch-clamp elektrofysiologi.Denne metoden kan brukes på alle arter og hjerneområde for å undersøke synaptisk mangfold. Denne metoden krever grunnleggende ferdigheter i helcellede patch-klemme elektrofysiologi. Å få opptak av høy kvalitet med lav og stabil tilgangsmotstand er avgjørende for nøyaktig tolkning av dataene.For å oppnå helcellekonfigurasjon plasserer du opptakspipetten like over skiven og motveie pipettestrømmen i spenningsklemmemodus. Påfør lite positivt trykk på pipetten, og lås stoppekranen. Deretter velger du en sunn celle med en intakt membran, og nærmer seg vevet med pipetten.Det positive trykket bør forårsake en liten forstyrrelse på vevet. Sakte bringe pipetten nærmere cellen i en diagonal bevegelse til en liten dimple dannes på celleoverflaten. Slipp deretter den positive trykklåsen.Cellen vil begynne å danne et segl, og motstanden vil øke over en gigaohm. Hold cellen på minus 68 millivolt i spenningsklemmen. Deretter trekker du pipetten litt bort fra cellen diagonalt for å fjerne overflødig trykk.Kompensere for rask og langsom pipette kapasitans. Påfør en kort suging gjennom røret som er koblet til pipetteholderen for å bryte gjennom cellen og få en helcellekonfigurasjon. Deretter bytter du til cellemodus på membrantestvinduet i en elektrofysiologidatainnsamlings- og analyseprogramvare.Opprettholde temperaturen på opptaksbadet ved 27 til 30 grader Celsius og strømningshastigheten på 1,5 til to milliliter per minutt for påfølgende eksperimenter. I et mangfoldsynapse synkroniserer et handlingspotensial nevrotransmitterutgivelse og genererer en større postsynaptisk strøm. Blokkering av virkningspotensial og kalsiumavhengig vesikulær frigjøring med TTX og kadmium forhindrer den postsynaptiske strømsummen og reduserer amplituden.Når det ikke er noen multiplisitet, vil blokkering av handlingspotensial ikke endre amplituden. I eksperiment en, for å estimere multiplisitet, hold cellen på minus 68 millivolt mens perfusing den med lav kalsium aCSF. Registrer de spontane EPSCene i minst fem minutter for å sikre en stabil grunnlinje.Deretter legger du til 30 mikromolars 4-AP til aCSF for å øke potensielle hendelser for handling, og registrere spontane EPSCer i minst 10 minutter for å oppnå full legemiddeleffekt. Deretter legger du til 0,5 mikromolars TTX og 10 mikromolars kadmium til aCSF med 4-AP, og registrerer miniatyr EPSCs i minst 10 minutter. For frakoblet analyse, bruk det siste minuttet av baseline umiddelbart før anvendelsen av 4-AP, det tiende minuttet av 4-AP-programmet og det tiende minuttet av TTX-programmet.I dette eksperimentet erstattes ekstracellulær kalsium med strontium for å desynkronisere frigjøringen av synaptiske vesikler. Derfor, hvis multiplisitet er til stede, bør dette redusere amplituden av postsynaptiske strømmer. I eksperiment to registrerer du spontane EPSCer i minst fem minutter mens du perfuserer cellen med normal kalsium aCSF.For å desynkronisere vesikkelutgivelse, begynn å perfusere cellen med strontium aCSF, og registrere spontane EPSCer. For frakoblet analyse, for å finne ut om den store amplituden spontane EPSCer skyldes synkron frigjøring av vesikler, sammenligner du siste minutt av baseline med det tiende minuttet av strontium aCSF-programmet. Mangfold kan innebære multivesikulær frigjøring, noe som forårsaker høyere nevrotransmitterkonsentrasjon i synaptisk kløft.Tilsetning av gamma-DGG, en ampareseptorantagonist med lav affinitet, fører til mindre effektiv hemming av større multiquantal sammenlignet med mindre enkeptiske postsynaptiske strømmer. Uten multivesikulær frigjøring vil gamma-DGG være like effektiv på større og mindre postsynaptiske strømmer. I eksperiment tre, for å teste for multivesikulær utgivelse, registrere spontane EPSCer i lav kalsium aCSF i minst fem minutter.Tilsett 30 mikromolars 4-AP til aCSF gjennom perfusjonssystemet. Ta opp spontane EPSCer i minst 10 minutter. Deretter legger du til 200 mikromolars gamma-DGG til aCSF med 4-AP, og registrerer spontane EPSCer i minst 10 minutter.Som et kontrolleksperiment i en egen celle gjentar du prosedyrene, men bruker en lav konsentrasjon av DNQX i stedet for gamma-DGG. For offline analyse, analyser siste minutt av hvert legemiddelprogram. Utbrudd av synaptisk aktivitet kan midlertidig øke spontan virkning potensiell avfyring og frigjøring sannsynlighet for stimulerte afferents.Hvis nevroner viser mangfold, bør økningen i handlingspotensialer forårsake en forbigående økning i amplituden av postsynaptiske strømmer. I eksperiment fire registrerer du spontane EPSCer i normal kalsium aCSF. For å øke virkningen potensiell avfyring, stimulere afferents ved hjelp av en monopolær glass elektrode fylt med aCSF med en hastighet på 20 hertz i to sekunder, og gjenta 10 ganger med en inter-burst intervall på 20 sekunder.For analyse, bruk 5000 millisekunder spontane EPSCer før den første stimulansen som baseline og sammenlignet med 10 til 300 millisekunder spontane EPSCer etter den endelige stimulansen. Deretter tar du gjennomsnittlig amplitude og frekvensendring over 10 studier. Analyser spontane EPSCer og miniatyr-EPSCer ved hjelp av et program som oppdager og analyserer synaptiske strømmer.Bruk de foreslåtte gjenkjenningsparametrene og funksjonen for kontinuerlig analyse for å oppdage AMPA-reseptormedierte EPSCer. Skann hvert opptak manuelt for å sikre at programmet nøyaktig oppdager hver hendelse. Eksporter hendelsesdataene ved å kopiere dem til utklippstavlen, og lim dem inn i en programvare for databehandling.Deretter beregner du gjennomsnittlig frekvens og amplitude for hver legemiddelbehandling, og utfører de relevante statistiske analysene. I et eksempel vist her øker 4-AP både amplituden og frekvensen av spontane EPSCer. Etterfølgende påføring av TTX og kadmium reduserer både amplituden og frekvensen.Her er fordelingen av spontan EPSC amplitude fra opptaket. I hypothalamus nevroner undersøkt her, amplitude og hyppigheten av baseline og TTX forhold er de samme, noe som tyder på at baseline spontane EPSCer inneholder svært få handling potensielle avhengige EPSCer. Sammenlignet med påfølgende eksperimenter kan du sammenligne forskjellen mellom baseline og 4-AP for å måle multiplisitet.Styrken av synaptisk overføring kan økes forbigående ved utbrudd av synaptisk aktivitet. For å undersøke mangfold under mer fysiologiske forhold, kan afferent stimulering brukes til å øke virkningen potensiell avfyring og frigjøre sannsynlighet. Her er sammendragene av spontan EPSC frekvens og amplitude endringer etter synaptisk stimulering.Stabile opptak er avgjørende for nøyaktig tolkning av dataene. Beskriv dataene hvis tilgangsmotstanden endres med mer enn 20 % under opptaket, da dette kan forvirre analysen. Denne protokollen tilbyr en enkel måte å estimere synaptisk mangfold, som er en viktig determinant for synaptisk effekt og dens plastisitet i forskjellige fysiologiske og patofysiologiske forhold.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Dyrking og Elektrofysiologi celler på NRCC Patch-Clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Hele Cell Patch Clamp for Gransker Mekanismer for Infrared Neural Stimulering

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

En datamaskin-assistert Multi-elektrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Hel-celle Patch-clamp Opptak fra Morphologically- og Neurochemically-identifiserte hippocampus interneuroner

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-celle Patch-clamp Recordings i hjernen skiver

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Hele-celle Patch-klemmeopptak for elektrofysiologisk bestemmelse av ion selektivitet i Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Skive Patch klemme teknikk for å analysere læring-indusert plastisitet

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Auditory hjernestammen respons og ytre hår cellen hele celle Patch klemme opptak i Postnatal rotter

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Forberedelser og protokoller for hele cellen Patch klemme opptak i Xenopus laevis Tectal nerveceller

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Utarbeidelse av akutt ryggmargen skiver for hele celle Patch-klemme opptak i Substantia Gelatinosa nerveceller

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...