Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
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J.S. recebeu bolsa de pós-graduação de Ontário. Wi recebeu uma nova bolsa de investigador de pesquisa de Saúde Mental do Canadá. Este trabalho é apoiado por subvenções de funcionamento para Wi de ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá (06106-2015 RGPIN) e o Instituto Canadense para pesquisa em saúde (PJT 148707).

Todas as experiências com animais são aprovadas na Comissão de cuidado Animal da Universidade de Ontário ocidental em conformidade com o Conselho canadense sobre orientações de cuidado Animal (AUP #2014-031).
1. soluções
<ol><li>
Solução de corte
	<ol>
<li>Consulte a tabela 1 para a composição da solução de corte.</li>
		<li>Preparar uma solução stock de 20x com antecedência e armazená-lo em 4 ° C por até 1 mês.</li>
		<li>Para 1 x solu?...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

Um requisito importante para um experimento de eletrofisiologia braçadeira remendo bem sucedida é a obtenção de fatias/células saudáveis. Nosso protocolo descrito é otimizado para fatias hipotalâmicas que contêm neurônios PVN. Outro áreas podem exigir de cérebro modificado soluções e fatiamento métodos21,22,23,24. Para a gravação, é fundamental para aceitar apenas gravações ...

Transmissão sináptica é um mecanismo fundamental para a comunicação entre os neurônios e, portanto, funcionamento do cérebro. Transmissão sináptica também é lábil e pode alterar sua eficácia de forma dependente da atividade, bem como em resposta a sinais moduladora1. Assim, examinando a função sináptica tem sido um foco importante de pesquisa da neurociência. Eletrofisiologia do grampo de remendo de célula inteira é uma técnica versátil que permite-nos compreender, pela elaboração de projetos experimentais e análises de dados, em profundidade mecanismos biofísicos e moleculares da transmissão sináptica. Uma abordagem comumente usada, talvez devido a simplicidade da técnica e conceito, é a medição das correntes de pós-sináptico excitatório/inibitório em miniatura (mE / IPSCs) sob a tensão braçadeira configuração2,3, 4 , 5 , 6. mPSCs individuais representam o fluxo de íons através de receptores pós-sinápticos geleificação (por exemplo, os receptores GABA e GABAA ) em resposta à ligação de seus respectivos neurotransmissores liberados do terminal pré-sináptica 7 . Porque a gravação é obtida na presença da voltagem-dependente Na+ canal bloqueador tetrodotoxina (TTX), o lançamento é independente do potencial de ação e normalmente envolve uma única vesícula sináptica que contém o neurotransmissor. Partindo deste pressuposto, a amplitude média de mPSCs é amplamente utilizada como uma estimativa crua para o tamanho de quantal, que representa o número e funcionalidade dos receptores pós-sinápticos, opondo-se um único lançamento de site. Por outro lado, a frequência de mPSCs é considerada para representar uma combinação do número total de sinapses encerra para a célula pós-sináptica e sua probabilidade média de lançamento. No entanto, esses parâmetros não meça outra variável-multiplicatividade de sinapses, ou multiplicidade sináptica — que é importante para a eficácia da transmissão sináptica.
Com base na teoria quantal da transmissão sináptica7,8,9, a força de uma determinada conexão entre um par de neurônios é dependente de três fatores: o número de sinapses funcionais (N), o resposta pós-sináptica para o lançamento de uma única vesícula sináptica (tamanho quantal; Q) e a probabilidade de liberação do neurotransmissor (Pr). Sináptica multiplicidade é equivalente a N. O desenvolvimento da multiplicidade sináptica ou a poda das sinapses multiplicativas é plástico durante todo o desenvolvimento e doença diferentes Estados3,4,6,10. Por esta razão, caracterizando a multiplicidade sináptica tem implicações importantes para compreender a eficácia da transmissão sináptica na saúde e na doença. Técnicas, tais como a microscopia eletrônica podem identificar evidências estruturais da multiplicidade sináptica através da detecção de múltiplos contatos sinápticos provenientes do mesmo axônio para o mesmo neurônio pós-sináptico11,12, 13,14. No entanto, essas multisynapses estruturalmente identificados podem ser funcionalmente silenciosa15,16. Análise funcional precisa de N exige que tecnicamente desafiador eletrofisiológicas abordagens, tais como gravações de células inteiras emparelhadas que podem identificar se uma determinada conexão tem vários sites de lançamento funcional mínima e abordagens de estimulação que visam recrutar um único axônio putativo.
Neste protocolo, descrevemos um método simples para estimar a multiplicidade sináptica, adoptando um método originalmente desenvolvido por Hsia et al2. Esta técnica envolve a medição de espontânea PSCs (sPSCs) e mPSCs usando eletrofisiologia braçadeira remendo de célula inteira, o que nos permite estimar o grau de multiplicidade sináptica através de todas as entradas para um determinado neurônio.  Como definida anteriormente, sináptica multiplicidade reflete o número de sinapses entre um determinado neurônio pré e pós-sinápticas. Se múltiplas sinapses são recrutadas em sincronia por um potencial de ação, haverá uma grande probabilidade do somatório temporal das EPS (ou seja, quantal) individuais, gerando uma maior amplitude PSC.  Nas gravações do mPSC (em que potenciais de ação são bloqueados por TTX), a probabilidade de somação temporal dos individuais (não-síncronas) mPSCs é baixa. Usando esta lógica, multiplicidade sináptica pode ser estimada, comparando a amplitude de sPSC (com liberação de dependente do potencial de ação) para a amplitude do mPSC.
Para examinar a existência de multiplicidade, descrevemos quatro experimentos e suas análises usando glutamatérgico EPSCs como exemplo. No entanto, a mesma abordagem pode ser usada para a rápida transmissão gabaérgica/glycinergic (IPSCs). Uma breve fundamentação para cada experimento é descrita abaixo. Em primeiro lugar, conforme explicado acima, multiplicidade sináptica pode ser estimada, comparando a amplitude de sEPSCs para mEPSCs. Há dois requisitos para esta abordagem; 1) pré-sináptica axônios de disparar um número suficiente de potenciais de ação durante a gravação, e 2) Pr deve ser alta para que múltiplas sinapses liberar neurotransmissores após a chegada de um potencial de ação. A fim de atender a esses requisitos, sEPSCs são primeiramente registrados em baixo Ca2 + artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) e em seguida na presença de uma baixa concentração do antagonista de canal de K+ , 4-aminopiridina (4-AP) para aumentar a ação disparo de potencial e Pr. Então disparando do potencial de ação é bloqueado por TTX e Pr diminuída uma voltagem Ca2 + bloqueador dos canais de Cd2 +. A amplitude da sEPSCs (com 4AP) é comparada com a de mEPSC (com 4AP, TTX e Cd2 +). No segundo experimento, Ca2 + é substituído por equimolar Sr2 + na aCSF para desynchronize liberação de vesículas. Como Ca2 + é necessária para a versão síncrona de vesículas, substituição com Sr2 + deve eliminar a sEPSCs de grande amplitude que sejam indicativos de multiplicidade. Em terceiro lugar, mecanicamente, multiplicidade pode resultar de qualquer vários contatos sinápticos ao mesmo neurônio pós-sináptico ou liberação multivesiculares (ou seja, múltiplas vesículas lançadas dentro de um único contato sináptico)17,18. Para diferenciar entre os dois tipos de multiplicidade, o terceiro experimento utiliza uma baixa afinidade, rápida dissociando antagonista competitivo dos receptores GABA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , para determinar se o grande sEPSC são o resultado de uma soma temporal das sinapses independentes ou liberação multivesiculares atuando sobre uma população de sobreposição de receptores pós-sinápticos. Se os acontecimentos de grande amplitude surgem de lançamento multivesiculares, γ-DGG será menos eficaz inibe a maior sEPSCs em relação ao menor, Considerando que grande sEPSCs que surgem a partir do somatório temporal de vários contatos sinápticos serão afetados da mesma forma por Γ-DGG. No quarto experimento, um método mais fisiológico é usado para aumentar o potencial de ação mista, nomeadamente aferente estimulação sináptica. Picos de atividade sináptica podem transitoriamente aumento/facilitar a probabilidade de queima e liberação de potencial de ação espontânea das afferents estimulada. Portanto, esta abordagem permite que a multiplicidade de manifestar de forma mais fisiológica.
O seguinte protocolo descreve o método para a realização dessas experiências no tecido hipotalâmico de rato. Especificamente, os neurônios de hormônio (CRH) liberando corticotropina do núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) são utilizados. Descrevemos os procedimentos para a realização de eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras e explicar as experiências específicas para testar a multiplicidade sináptica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

No sistema nervoso central, um par de neurônios formam frequentemente múltiplos contatos sinápticos e/ou sites de liberação de neurotransmissor funcional (multiplicidade sináptica). Sináptica multiplicidade é plástico e mudanças ao longo do desenvolvimento e em diferentes condições fisiológicas, sendo um importante determinante para a eficácia da transmissão sináptica. Aqui, nós esboçamos experimentos para estimar o grau de multiplicidade das sinapses de terminação para um determinado neurônio pós-sináptico usando eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras em fatias cerebral aguda. Especificamente, a gravação de tensão-braçadeira é usada para comparar a diferença entre a amplitude das correntes pós-sináptico excitatórias espontâneas (sEPSCs) e correntes de pós-sinápticos excitatórios em miniatura (mEPSCs). A teoria por trás deste método é que entradas aferentes que apresentam multiplicidade mostrará sEPSCs grande, dependente do potencial de ação, devido à liberação de síncrona que ocorre em cada contato sináptico. Em contraste, o lançamento independente de potencial de ação (que é assíncrono) irá gerar menor amplitude mEPSCs. Este artigo descreve um conjunto de experiências e análises para caracterizar a existência de multiplicidade sináptica e discute os requisitos e limitações da técnica. Esta técnica pode ser aplicada para investigar como diferentes intervenções comportamentais, farmacológicas ou ambientais em vivo, afectar a organização de contatos sinápticos em áreas diferentes do cérebro.

O protocolo acima descreve um método para usar eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras para examinar o grau de multiplicidade sináptica, usando hipotalâmico neurônios de rato como exemplo. Esta técnica de preparação de fatia deve produzir células viáveis saudáveis que não possuem uma membrana inchada ou núcleo (Figura 1). Cada passo no protocolo é importante para a saúde do tecido e da qualidade das gravações.
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Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a multiplicidade sináptica funcional usando eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras em fatias cerebral aguda.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

No cérebro, um par de neurônios frequentemente formam múltiplos contatos sinápticos, o que é chamado de multiplicidade sináptica. No entanto, o exame preciso da multiplicidade sináptica requer experimentos tecnicamente desafiadores. Este protocolo descreve um método simples para estimativa bruta da multiplicidade sináptica usando eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras.Este método pode ser aplicado a qualquer espécie e área cerebral para investigar a multiplicidade sináptica. Este método requer habilidades básicas na eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras. A obtenção de gravações de alta qualidade com baixa e estável resistência ao acesso é fundamental para a interpretação precisa dos dados.Para obter a configuração de células inteiras, coloque a pipeta de gravação logo acima da corrente de pipeta de corte e compense a corrente de pipeta no modo de fixação de tensão. Aplique uma leve pressão positiva na pipeta e bloqueie a torneira. Em seguida, selecione uma célula saudável com uma membrana intacta, e aproxime-se do tecido com a pipeta.A pressão positiva deve causar um leve distúrbio no tecido. Aproxime lentamente a pipeta da célula em um movimento diagonal até que uma pequena covinha se forme na superfície da célula. Em seguida, solte o bloqueio de pressão positivo.A célula começará a formar uma vedação, e a resistência aumentará acima de um gigaohm. No grampo de tensão, segure a célula a menos 68 milvolts. Posteriormente, puxe ligeiramente a pipeta para longe da célula diagonalmente para remover o excesso de pressão.Compensar a capacidade rápida e lenta da pipeta. Aplique uma breve sucção através do tubo conectado ao suporte da pipeta para quebrar a célula e obter uma configuração de célula inteira. Em seguida, mude para o modo celular na janela de teste de membrana em um software de aquisição e análise de dados eletrofisiológicos.Mantenha a temperatura do banho de gravação em 27 a 30 graus Celsius e a vazão em 1,5 a dois mililitros por minuto para experimentos subsequentes. Em uma sinapse multiplicidade, um potencial de ação sincroniza a liberação de neurotransmissores e gera uma corrente postsináptica maior. O potencial de ação de bloqueio e a liberação vesicular dependente de cálcio com TTX e cádmio impedem a soma da corrente postsiática e diminuem a amplitude.Quando não há multiplicidade, o potencial de ação de bloqueio não mudará a amplitude. No experimento um, para estimar a multiplicidade, mantenha a célula a menos 68 milvolts enquanto a perfuz com aCSF de baixo cálcio. Regisse os EPSCs espontâneos por pelo menos cinco minutos para garantir uma linha de base estável.Em seguida, adicione 30 micromolars 4-AP ao aCSF para aumentar eventos potenciais dependentes da ação e registigue EPSCs espontâneos por pelo menos 10 minutos para obter o efeito completo da droga. Em seguida, adicione 0,5 micromolars TTX e 10 micromolars de cádmio ao aCSF com 4-AP, e registe os EPSCs em miniatura por pelo menos 10 minutos. Para análise offline, use o último minuto da linha de base imediatamente antes da aplicação do 4-AP, o 10º minuto do aplicativo 4-AP e o 10º minuto do aplicativo TTX.Neste experimento, o cálcio extracelular é substituído por estrôncio para dessincronizar a liberação de vesículas sinápticas. Portanto, se a multiplicidade estiver presente, isso deve diminuir a amplitude das correntes postsinásticas. No experimento dois, regise EPSCs espontâneos por pelo menos cinco minutos enquanto perfusa a célula com aCSF de cálcio normal.Para dessincronizar a liberação vesícula, comece a perfumar a célula com estrôncio aCSF e regis frequentes espontâneas. Para análise offline, para determinar se os EPSCs espontâneos de grande amplitude são devido à liberação síncrona de vesículas, compare o último minuto da linha de base com o 10º minuto do aplicativo estrôncio aCSF. A multiplicidade pode envolver liberação multivesicular, o que causa maior concentração de neurotransmissores na fissura sináptica.A adição de gama-DGG, um antagonista receptor AMPA de baixa afinidade, leva a uma inibição menos eficaz de correntes pós-sinápticas uniquantais menores. Sem a versão multivesicular, o gama-DGG será igualmente eficaz em correntes postsináspticas maiores e menores. No experimento três, para testar a liberação multivesicular, registos espontâneos em aCSF de baixo cálcio por pelo menos cinco minutos.Adicione 30 micromolars 4-AP ao aCSF através do sistema de perfusão. Regisse os EPSCs espontâneos por pelo menos 10 minutos. Em seguida, adicione 200 micromolars gama-DGG ao aCSF com 4-AP, e regisse os EPSCs espontâneos por pelo menos 10 minutos.Como um experimento de controle em uma célula separada, repita os procedimentos, mas aplique uma baixa concentração de DNQX em vez de gama-DGG. Para análise offline, analise o último minuto de cada aplicação de medicamentos. Rajadas de atividade sináptica podem aumentar transitoriamente a potencial de ação espontânea de disparo e probabilidade de liberação dos diferentes aferentes estimulados.Se os neurônios apresentarem multiplicidade, o aumento dos potenciais de ação deve causar um aumento transitório na amplitude das correntes postsináspticas. No experimento quatro, registos espontâneos em aCSF de cálcio normal. Para aumentar o potencial de disparo de ação, estimule os aferentes usando um eletrodo de vidro monopolar cheio de aCSF a uma taxa de 20 hertz por dois segundos, e repita 10 vezes com um intervalo entre rajadas de 20 segundos.Para análise, use EPSCs espontâneos de 5.000 milissegundos antes do primeiro estímulo como linha de base e compare com os EPSCs espontâneos de 10 a 300 milissegundos após o estímulo final. Em seguida, tome a amplitude média e a mudança de frequência ao longo de 10 ensaios. Analise EPSCs espontâneos e EPSCs em miniatura usando um programa que detecta e analisa correntes sinápticas.Use os parâmetros de detecção sugeridos e a função de análise sem escalas para detectar EPSCs mediados por receptores AMPA. Escaneie manualmente cada gravação para garantir que o programa esteja detectando com precisão cada evento. Exporte os dados do evento copiando-os para a área de transferência e cole-os em um software de gerenciamento de dados.Em seguida, calcule a frequência média e a amplitude de cada tratamento medicamentoso e realize as análises estatísticas relevantes. Em um exemplo mostrado aqui, o 4-AP aumenta tanto a amplitude quanto a frequência de EPSCs espontâneos. A aplicação subsequente de TTX e cádmio diminui tanto a amplitude quanto a frequência.Aqui está a distribuição da amplitude espontânea do EPSC a partir da gravação. Nos neurônios hipotalâmicos aqui examinados, a amplitude e a frequência das condições de linha de base e TTX são as mesmas, sugerindo que os EPSCs espontâneos da linha de base contêm pedênicos de ação potenciais dependentes dos EPSCs. Assim, experimentos subsequentes podem comparar a diferença entre linha de base e 4-AP para medir a multiplicidade.A força da transmissão sináptica pode ser aumentada transitoriamente por rajadas de atividade sináptica. Para investigar a multiplicidade em condições mais fisiológicas, a estimulação aferente pode ser usada para aumentar a probabilidade de disparo e liberação de ações. Aqui estão os resumos das frequência espontâneas e mudanças de amplitude após a estimulação sináptica.Gravações estáveis são essenciais para uma interpretação precisa dos dados. Descreva os dados se a resistência de acesso mudar em mais de 20% durante o registro, pois isso pode confundir a análise. Este protocolo oferece uma maneira simples de estimar a multiplicidade sináptica, que é um determinante fundamental da eficácia sináptica e sua plasticidade em diferentes condições fisiológicas e fioficológicas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Cultura e Eletrofisiologia de células em NRCC patch-clamp-Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Neurociência

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Fatia Patch Clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...