Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
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J.S. Beca Ontario Graduate. Panamá recibió una nueva beca de investigador de investigación de Salud Mental de Canadá. Este trabajo es apoyado por subvenciones de funcionamiento para W.I de las ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá (06106-2015 RGPIN) y el Instituto canadiense de investigación en salud (PJT 148707).

Todos los experimentos con animales son aprobados por el Comité de cuidado Animal de la Universidad de Ontario Occidental según el Consejo Canadiense sobre directrices de cuidado Animal (AUP #2014-031).
1. las soluciones
<ol><li>
Solución de corte
	<ol>
<li>Consulte la tabla 1 para la composición de la solución de corte.</li>
		<li>Prepara una solución madre de 20 x con antelación y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.</li>
		<li>1 x solución corte, dis...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

Un requisito importante para un éxito parche abrazadera electrofisiológico experimento es la obtención de rodajas/las células sanas. Nuestro protocolo descrito está optimizado para rebanadas hipotalámicas que contienen neuronas PVN. Otro cerebro áreas pueden requerir modifica soluciones y corte métodos21,22,23,24. Para la grabación, es crítica para aceptar sólo grabaciones estables c...

Transmisión sináptica es un mecanismo fundamental para la comunicación entre las neuronas y por lo tanto, la función del cerebro. Transmisión sináptica es también lábil y puede cambiar su eficacia de una manera dependiente de la actividad, así como en respuesta a moduladores señales1. Por lo tanto, examinar la función sináptica ha sido un foco clave de la investigación de la neurociencia. Electrofisiología de abrazadera de parche de células enteras es una técnica versátil que nos permite entender, por idear diseños experimentales y análisis de datos, profundidad mecanismos biofísicos y moleculares de la transmisión sináptica. Un enfoque comúnmente utilizado, quizás debido a la simplicidad de la técnica y el concepto, es la medida de miniatura excitatoria/inhibitoria postsináptica (mE / IPSCs) bajo la tensión de la abrazadera de configuración2,3, 4 , 5 , 6. mPSCs individuales representan el flujo de iones a través de receptores ionotrópicos postsinápticos (por ejemplo, receptores AMPA y GABAA ) en respuesta a la Unión de sus respectivos neurotransmisores liberados desde la terminal presináptica 7 . Porque la grabación se obtiene en presencia del voltaje-bloqueado Na+ canal bloqueador tetrodotoxin (TTX), el lanzamiento es independiente del potencial de acción y consiste normalmente en una sola vesícula sináptica que contiene el neurotransmisor. Partiendo de este supuesto, la amplitud media de mPSCs es ampliamente utilizada como una estimación cruda del tamaño cuántico, que representa el número y la funcionalidad de los receptores postsinápticos oponerse un sitio sencillo. Por otra parte, la frecuencia de mPSCs se considera representan una combinación del número total de sinapsis que termina en la célula postsináptica y la probabilidad de liberación promedio. Sin embargo, estos parámetros no miden otra variable-multiplicativity de sinapsis, o multiplicidad sináptica — que es importante para la eficacia de la transmisión sináptica.
Basado en la teoría cuántico de la transmisión sináptica7,8,9, la fuerza de una conexión determinada entre un par de neuronas depende de tres factores: el número de sinapsis funcionales (N), el respuesta postsináptica a la liberación de una sola vesícula sináptica (tamaño cuántico; Q) y la probabilidad de liberación de neurotransmisor (Pr). Multiplicidad de Synaptic es equivalente a N. El desarrollo de multiplicidad de synaptic o la poda de las sinapsis multiplicativas es plástico a lo largo de desarrollo y en enfermedades diferentes Estados3,4,6,10. Por ello, caracterizar multiplicidad sináptica tiene implicaciones importantes para la comprensión de la eficacia de la transmisión sináptica en salud y enfermedad. Técnicas como la microscopia electrónica pueden identificar evidencia estructural de multiplicidad sináptica mediante la detección de múltiples contactos sinápticos origina el axón mismo sobre la misma neurona postsynaptic11,12, 13,14. Sin embargo, estos multisynapses estructuralmente identificados pueden ser funcionalmente silencioso15,16. Examen funcional precisa de N requiere técnicamente difícil métodos electrofisiológicos, como pares grabaciones de celulares que pueden determinar si una conexión determinada tiene múltiples sitios de liberación funcional y mínima enfoques de estimulación que tienen como objetivo reclutar un solo axón putativo.
En este protocolo, se describe un método simple para estimar la multiplicidad sináptica mediante la adopción de un método desarrollado originalmente por Hsia et al2. Esta técnica consiste en la medición de espontánea PSC (sPSCs) y mPSCs mediante electrofisiología de abrazadera de parche de células enteras, que nos permite estimar el grado de multiplicidad sináptica a través de todas las entradas a una determinada neurona.  Previamente definida, synaptic multiplicidad refleja el número de sinapsis entre la neurona pre y postsináptica dada. Si múltiples sinapsis son reclutadas en sincronía por un potencial de acción, habrá una alta probabilidad de suma temporal de PSC (es decir cuántico) individual, generando una mayor amplitud PSC.  En grabaciones de mPSC (en que los potenciales de acción son bloqueados por TTX), es baja la probabilidad de la suma temporal de los mPSCs (asíncronos). Utilizando este razonamiento, multiplicidad sináptica puede estimarse mediante la comparación de la amplitud de nacionales (con lanzamiento dependiente del potencial de acción) a la amplitud del mPSC.
Para examinar la existencia de multiplicidad Describimos cuatro experimentos y sus análisis mediante EPSCs glutamatérgica como ejemplo. Sin embargo, el mismo enfoque puede ser utilizado para la rápida transmisión de GABAergic/glycinergic (IPSCs). A continuación se describe una breve justificación para cada experimento. En primer lugar, como se explicó anteriormente, multiplicidad sináptica puede estimarse mediante la comparación de la amplitud de sEPSCs a mEPSCs. Existen dos requisitos para ello; axones 1) presinápticas deben disparar un número suficiente de potenciales de acción durante la grabación, y 2) Pr debe ser alta para que múltiples sinapsis liberan neurotransmisores a la llegada de un potencial de acción. Para cumplir estos requisitos, sEPSCs se registró por primera vez en baja Ca2 + artificial líquido cerebroespinal (aCSF) y luego grabados en presencia de una concentración baja del antagonista de canales de K+ , 4-aminopiridina (4-AP) para aumentar la acción potencial disparo y Pr. Entonces potencial de acción de la leña se bloquea por TTX y Pr disminuido por un voltaje Ca2 + bloqueador de canales de Cd2 +. La amplitud de sEPSCs (con 4AP) es comparada con la de mEPSC (con 4AP, TTX y Cd2 +). En el segundo experimento, Ca2 + se sustituye por equimolar Sr2 + en la aCSF a desincronizar la liberación de la vesícula. Como Ca2 + se requiere para la versión sincrónica de vesículas, reemplazo con Sr2 + debe eliminar la sEPSCs de gran amplitud que son indicativos de la multiplicidad. En tercer lugar, mecánico, multiplicidad puede resultar de cualquiera de los dos múltiples contactos sinápticos a la misma neurona postsináptica o liberación multivesicular (es decir, múltiples vesículas lanzadas dentro de un único contacto sináptico)17,18. Para distinguir entre los dos tipos de multiplicidad, el tercer experimento utiliza una baja afinidad, la rápida disociación antagonista competitivo de los receptores AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 para determinar si grandes sEPSC son el resultado de la suma temporal de sinapsis independiente o lanzamiento multivesicular actuando sobre una población de superposición de los receptores postsinápticos. Si los eventos de gran amplitud surgen de liberación multivesicular, γ-DGG serán menos eficaces en la inhibición de sEPSCs comparado con el más pequeño más grande, mientras que sEPSCs grandes que surgen de la suma temporal de múltiples contactos sinápticos se verán afectados de manera similar por Γ-DGG. En el cuarto experimento, un método más fisiológico se utiliza para mejorar el potencial de acción disparar, es decir, aferente estimulación sináptica. Ráfagas de actividad sináptica pueden transitorio aumento/facilitar la probabilidad de disparo y liberación de potencial de acción espontáneo de los aferentes estimuladas. Por lo tanto, este enfoque permite multiplicidad de manifestar de una manera más fisiológica.
El siguiente protocolo describe el método para realizar estos experimentos en tejido hipotalámico de ratón. Específicamente, se utilizan las neuronas de la hormona (CRH) liberando corticotropina del núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN). Describir los procedimientos para la realización de electrofisiología de celulares patch clamp y explicar los experimentos específicos para probar la multiplicidad sináptica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

En el sistema nervioso central, un par de neuronas forman a menudo múltiples contactos sinápticos o sitios de liberación de neurotransmisor funcional (multiplicidad sináptica). Multiplicidad sináptica es de plástico y cambios a lo largo de desarrollo y en diferentes condiciones fisiológicas, siendo un factor determinante para la eficacia de la transmisión sináptica. Aquí, describimos experimentos para estimar el grado de multiplicidad de sinapsis que termina en una neurona postsináptica dada utilizando electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera en rebanadas de cerebro agudo. Concretamente, grabación de pinza de voltaje se utiliza para comparar la diferencia entre la amplitud de las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (sEPSCs) y miniatura corrientes postsinápticas excitatorias (mEPSCs). La teoría detrás de este método es que las entradas aferentes que exhiben multiplicidad mostrará sEPSCs grande, dependiente del potencial de acción debido a la liberación sincrónica que se produce en cada contacto sináptico. Por el contrario, lanzamiento independiente del potencial de acción (que es asincrónico) generará más pequeño amplitud mEPSCs. Este artículo describe un conjunto de experimentos y análisis para caracterizar la existencia de multiplicidad de synaptic y discute los requisitos y limitaciones de la técnica. Esta técnica puede aplicarse para investigar cómo las diferentes intervenciones conductuales, farmacológicas o ambientales en vivo afectan la organización de contactos sinápticos en diversas áreas del cerebro.

El anterior protocolo describe un método para el uso de electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera para examinar el grado de multiplicidad sináptica, mediante neuronas hipotalámicas de ratón como un ejemplo. Esta técnica de preparación de rebanada debe generar células viables sanas que no tienen una membrana hinchada o núcleo (figura 1). Cada paso en el protocolo es importante para la salud del tejido y la calidad de las grabaciones.
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Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Evaluación de multiplicidad sináptica mediante electrofisiología Patch-clamp de celulares

Aquí, presentamos un protocolo para la evaluación de la multiplicidad sináptica funcional utilizando electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera en rebanadas de cerebro agudo.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

En el cerebro, un par de neuronas a menudo forman múltiples contactos sinápticos, que se llama multiplicidad sináptica. Sin embargo, el examen preciso de la multiplicidad sináptica requiere experimentos técnicamente desafiantes. Este protocolo describe un método simple para la estimación bruta de la multiplicidad sináptica utilizando electrofisiología de la abrazadera de parche de células enteras.Este método se puede aplicar a cualquier especie y área del cerebro para investigar la multiplicidad sináptica. Este método requiere habilidades básicas en la electrofisiología de la abrazadera de parche de células enteras. La obtención de grabaciones de alta calidad con baja y estable resistencia al acceso es fundamental para la interpretación precisa de los datos.Para obtener la configuración de toda la celda, coloque la pipeta de grabación justo encima de la corriente de la pipeta de corte y offset en el modo de abrazadera de voltaje. Aplique una ligera presión positiva a la pipeta y bloquee la llave. A continuación, seleccione una célula sana con una membrana intacta y acérquese al tejido con la pipeta.La presión positiva debe causar una ligera alteración en el tejido. Lentamente acerque la pipeta a la celda en un movimiento diagonal hasta que se forme un pequeño hoyuelo en la superficie de la célula. A continuación, suelte el bloqueo de presión positivo.La célula comenzará a formar un sello, y la resistencia aumentará por encima de un gigaohm. En la abrazadera de voltaje, sostenga la celda en menos 68 milivoltios. Posteriormente, tire ligeramente de la pipeta lejos de la celda diagonalmente para eliminar el exceso de presión.Compensar la capacitancia de pipeta rápida y lenta. Aplique una breve succión a través del tubo conectado al soporte de la pipeta para atravesar la celda y obtener una configuración de celda completa. A continuación, cambie al modo celular en la ventana de prueba de membrana en un software de adquisición y análisis de datos de electrofisiología.Mantenga la temperatura del baño de grabación en 27 a 30 grados centígrados y el caudal de 1,5 a dos mililitros por minuto para experimentos posteriores. En una sinapsis multiplicidad, un potencial de acción sincroniza la liberación de neurotransmisores y genera una corriente postsináptica más grande. El potencial de acción de bloqueo y la liberación vesicular dependiente del calcio con TTX y cadmio previenen la suma de corriente postsináptica y disminuyen la amplitud.Cuando no hay multiplicidad, el potencial de acción de bloqueo no cambiará la amplitud. En el experimento uno, para estimar la multiplicidad, sostenga la célula en menos 68 milivoltios mientras la perfunde con aCSF con bajo contenido de calcio. Registre las EPSC espontáneas durante al menos cinco minutos para garantizar una línea de base estable.A continuación, agregue 30 micromolares 4-AP al aCSF para aumentar los eventos dependientes del potencial de acción y registre las EPSC espontáneas durante al menos 10 minutos para obtener el efecto completo del fármaco. A continuación, agregue 0,5 micromolares TTX y 10 micromolares cadmio al aCSF con 4-AP, y grabe los EPSC en miniatura durante al menos 10 minutos. Para el análisis sin conexión, utilice el último minuto de línea base inmediatamente antes de la aplicación de 4-AP, el minuto 10 de la aplicación 4-AP y el minuto 10 de la aplicación TTX.En este experimento, el calcio extracelular se sustituye por estroncio para desincronizar la liberación de vesículas sinápticas. Por lo tanto, si la multiplicidad está presente, esto debe disminuir la amplitud de las corrientes postsinápticas. En el experimento dos, registre las EPSC espontáneas durante al menos cinco minutos mientras perfunde la célula con aCSF de calcio normal.Para desincronizar la liberación de vesículas, comience a perfundirse la célula con aCSF de estroncio y registre las EPSC espontáneas. Para el análisis fuera de línea, para determinar si los EPSC espontáneos de gran amplitud se deben a la liberación síncrona de vesículas, compare el último minuto de línea de base con el minuto 10 de aplicación de estroncio aCSF. Multiplicidad puede implicar liberación multivesicular, que causa una mayor concentración de neurotransmisores en la hendidura sináptica.La adición de gamma-DGG, un antagonista del receptor AMPA de baja afinidad, conduce a una inhibición menos eficaz de un multicuántal más grande en comparación con las corrientes postsinápticas uniquanales más pequeñas. Sin liberación multivesicular, gamma-DGG será igualmente eficaz en corrientes postsinápticas más grandes y más pequeñas. En el experimento tres, para probar la liberación multivesicular, registre las EPSC espontáneas en aCSF con bajo contenido de calcio durante al menos cinco minutos.Añadir 30 micromolares 4-AP al aCSF a través del sistema de perfusión. Registre los EPSC espontáneos durante al menos 10 minutos. A continuación, agregue 200 micromolares gamma-DGG al aCSF con 4-AP y registre los EPSC espontáneos durante al menos 10 minutos.Como experimento de control en una célula separada, repita los procedimientos, pero aplique una concentración baja de DNQX en lugar de gamma-DGG. Para el análisis fuera de línea, analice el último minuto de cada aplicación de fármaco. Las ráfagas de actividad sináptica pueden aumentar transitoriamente la probabilidad de disparo y liberación de los aferentes estimulados.Si las neuronas exhiben multiplicidad, el aumento en los potenciales de acción debe causar un aumento transitorio en la amplitud de las corrientes postsinápticas. En el experimento cuatro, registre las EPSC espontáneas en el ACSF de calcio normal. Para aumentar el disparo potencial de acción, estimule los aferentes usando un electrodo de vidrio monopolar lleno de aCSF a una velocidad de 20 hercios durante dos segundos, y repita 10 veces con un intervalo de inter-ráfaga de 20 segundos.Para el análisis, utilice 5.000 milisegundos de EPSC espontáneos antes del primer estímulo como línea de base y compárelos con los EPSC espontáneos de 10 a 300 milisegundos después del estímulo final. A continuación, tome la amplitud media y el cambio de frecuencia durante 10 ensayos. Analizar EPSC espontáneos y EPSC en miniatura utilizando un programa que detecta y analiza corrientes sinápticas.Utilice los parámetros de detección sugeridos y la función de análisis sin parar para detectar los EPSC mediados por receptores AMPA. Escanee manualmente cada grabación para asegurarse de que el programa detecta con precisión cada evento. Exporte los datos del evento copiándolos en el portapapeles y péguelos en un software de administración de datos.A continuación, calcule la frecuencia y amplitud medias para cada tratamiento farmacológico y realice los análisis estadísticos pertinentes. En un ejemplo mostrado aquí, 4-AP aumenta la amplitud y la frecuencia de los EPSC espontáneos. La aplicación posterior de TTX y cadmio disminuye tanto la amplitud como la frecuencia.Aquí está la distribución de la amplitud espontánea EPSC de la grabación. En las neuronas hipotalámicas examinadas aquí, la amplitud y frecuencia de las condiciones basales y TTX son las mismas, lo que sugiere que las EPSC espontáneas basales contienen muy pocas APE dependientes del potencial de acción. En consecuencia, los experimentos posteriores pueden comparar la diferencia entre la línea de base y 4-AP para medir la multiplicidad.La fuerza de la transmisión sináptica se puede aumentar transitoriamente mediante ráfagas de actividad sináptica. Para investigar la multiplicidad en condiciones más fisiológicas, se puede utilizar una estimulación aferente para aumentar la probabilidad de disparo y liberación potencial de acción. Estos son los resúmenes de los cambios espontáneos de frecuencia y amplitud de la EPSC después de la estimulación sináptica.Las grabaciones estables son esenciales para una interpretación precisa de los datos. Describa los datos si la resistencia al acceso cambia en más de un 20% durante la grabación, ya que esto podría confundir el análisis. Este protocolo ofrece una forma sencilla de estimar la multiplicidad sináptica, que es un determinante clave de la eficacia sináptica y su plasticidad en diferentes condiciones fisiológicas y fisiopatológicas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

El cultivo y la electrofisiología de las células en NRCC de patch-clamp chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Investigación

Neurociencias

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Grabaciones con abrazadera de parche de células enteras para la determinación electrofisiológica de la selectividad iónica en canalrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Slice Patch Clamp técnica para analizar la plasticidad inducida por el aprendizaje

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...