Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

J.S. fick Ontario Graduate stipendium. W.I. fått en ny utredare Fellowship från Mental Health Research Kanada. Detta arbete stöds av administrationsbidrag till W.I från naturvetenskap och Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) och kanadensiska Institutet för hälsoforskning (PJT 148707).

Alla djurförsök är godkända av Animal Care kommittén av The University of Western Ontario i enlighet med kanadensisk rådet om Animal Care riktlinjer (AUP nr 2014-031).
1. lösningar
<ol><li>
Skivning lösning
	<ol>
<li>Se tabell 1 för sammansättningen av skivning lösningen.</li>
		<li>Förbereda en 20 x stamlösning i förväg och förvara den vid 4 ° C i upp till 1 månad.</li>
		<li>1 x skivning lösning, upplösa NaHCO3, glukos och sa...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

En viktig förutsättning för en framgångsrik patch clamp elektrofysiologi experiment är att få friska skivor/celler. Våra beskrivna protokollet är optimerad för hypotalamus skivor som innehåller PVN nervceller. Andra hjärnan områden kan kräva modifierade lösningar och skivning metoder21,22,23,24. För inspelning, är det viktigt att bara acceptera stabil inspelningar genom att stä...

Synaptisk transmission är en grundläggande mekanism för kommunikationen mellan nervceller, och därmed hjärnans funktion. Synaptisk transmission är också labila och kan ändra dess effektivitet i en verksamhet-beroende sätt också som svar på immunmodulerande signaler1. Således har att pröva synaptic funktion varit viktiga fokus av neurovetenskapliga forskning. Hela-cell patch clamp elektrofysiologi är en mångsidig teknik som gör det möjligt för oss att förstå, genom att utarbeta experimentell design och dataanalyser, djupgående biofysiska och molekylära mekanismer av synaptisk transmission. En vanligt förekommande strategi, kanske på grund av enkelheten i tekniken och konceptet, är mätning av miniatyr excitatoriska/hämmande postsynaptiska strömmar (mig / IPSCs) under spänningen klämma konfiguration2,3, 4 , 5 , 6. individuella mPSCs representerar flödet av joner genom postsynaptiska jonotropa receptorer (t.ex. AMPA och GABAA -receptorer) som svar på bindningen av deras respektive neurotransmittorer frigörs från presynaptiska terminalen 7 . Eftersom inspelningen erhålls i närvaro av de spänningskänsliga Na+ kanal blockerare tetrodotoxinen (TTX), utgivningen är oberoende av aktionspotential och innebär normalt en enda synaptiskt vesikelprotein som innehåller signalsubstansen. Baserat på detta antagande, används genomsnittliga amplituden av mPSCs allmänt som en grov uppskattning för den kvantfysikaliska storlek, vilket representerar antalet och funktionalitet av postsynaptiska receptorer motsätta sig en enda utsättningsplatsen. Frekvensen av mPSCs anses däremot, utgör en kombination av det totala antalet synapser avslutas på den postsynaptiska cellen och deras genomsnittliga release sannolikhet. Dessa parametrar mäter dock inte en annan variabel-multiplicativity av synapser, eller synaptic multiplicity — vilket är viktigt för effekten av synaptisk transmission.
Baserat på kvantfysikaliska teorin av synaptisk transmission7,8,9, styrkan i en viss anslutning mellan ett par av nervceller är beroende av tre faktorer: antalet funktionella synapser (N), den postsynaptiska svar till frigöraren av en enda synaptiskt vesikelprotein (kvantfysikaliska storlek; Q) och probabilityen av neurotransmitterfrigöraren (Pr). Synaptic multiplicity motsvarar N. Utvecklingen av synaptic multiplicity eller beskärning av multiplikativ synapser är plast i hela utvecklingen och i olika sjukdomen staterna3,4,6,10. Av denna anledning har kännetecknar synaptic multiplicity stor betydelse för att förstå effekten av synaptisk transmission i hälsa och sjukdom. Tekniker, såsom elektronmikroskopi kan identifiera strukturella bevis av synaptic multiplicity genom att upptäcka flera synaptiska kontakter med ursprung från samma axon på samma postsynaptiska neuron11,12, 13,14. Dessa strukturellt identifierade multisynapses kan dock vara funktionellt tyst15,16. Exakt funktionell undersökning av N kräver tekniskt utmanande elektrofysiologiska metoder, såsom Parade hela-cell inspelningar som kan fastställa huruvida en viss anslutning har flera funktionella release webbplatser och minimal stimulering strategier som syftar till att rekrytera en enda förmodade axon.
I detta protokoll beskriver vi en enkel metod för att uppskatta synaptic multiplicity genom att anta en metod som ursprungligen utvecklades av Hsia et al2. Denna teknik innebär mätning av spontana PSC (sPSCs) och mPSCs med hela-cell patch clamp elektrofysiologi, som tillåter oss att uppskatta graden av synaptic multiplicityen över alla ingångar till en given neuron.  Som tidigare definierade, synaptic multiplicity återspeglar antalet synapser mellan en given pre- och postsynaptiska neuron. Om flera synapser rekryteras på samma gång av en aktionspotential, blir det en hög sannolikhet för temporal summering av enskilda (dvs kvantfysikaliska) gemensamma kontaktpunkter, genererar en större amplitud PSC.  I mPSC recordings (i vilken handlingspänningar blockeras av TTX), sannolikheten för temporal summering av enskilda (icke-synkrona) mPSCs är låg. Med denna logik, kan synaptic multiplicity uppskattas genom att jämföra sPSC amplituden (med potentiell handling-beroende release) till mPSC amplituden.
För att undersöka förekomsten av multiplicity beskriver vi fyra experiment och sina analyser med glutamaterg EPSCs som exempel. Dock samma tillvägagångssätt kan användas för snabb GABAergic/glycinergic överföring (IPSCs). En kortfattad motivering för varje experiment beskrivs nedan. Först, som förklarats ovan, synaptic multiplicity kan uppskattas genom att jämföra amplituden av sEPSCs till mEPSCs. Det finns två krav för detta tillvägagångssätt; 1) presynaptiska axoner måste avfyra ett tillräckligt antal handlingspänningar under inspelningen, och 2) Pr måste vara hög så att flera synapser frigöra signalsubstansen vid ankomsten av en aktionspotential. För att möta dessa krav, sEPSCs först registreras i låg Ca2 + konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF), och sedan registreras i närvaro av en låg koncentration av K+ kanal antagonisten, 4-Aminopyridin (4-AP) att öka åtgärd potentiella bränning och Pr. Då blockeras aktionspotential bränning av TTX och Pr minskade med en spänningskänsliga Ca2 + kanal blockerare Cd2 +. Amplituden av sEPSCs (med 4AP) jämförs med det av mEPSC (med 4AP, TTX och Cd2 +). I det andra experimentet ersättas Ca2 + med equimolar Sr2 + i aCSF till desynchronize vesikler release. Ca2 + krävs för synkrona frigöraren av blåsor, bör ersättning med Sr2 + eliminera den stora amplitud sEPSCs som är vägledande för mångfald. För det tredje, slentrianmässigt, multiplicity kan följd antingen flera synaptiska kontakter till samma postsynaptiska neuron eller multivesicular release (dvs flera blåsor släppas inom en enda synaptisk kontakt)17,18. För att skilja mellan de två typerna av multiplicity, använder tredje experimentet en låg affinitet, snabb separera kompetitiv antagonist till AMPA-receptorer, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 att avgöra om stora sEPSC är resultatet av den temporal summeringen av oberoende synapser eller multivesicular release agerar på en överlappande befolkning av postsynaptiska receptorer. Om de stora amplitud händelserna uppstår från multivesicular release, kommer att γ-DGG vara mindre effektiva på att hämma större jämfört med mindre sEPSCs, medan stora sEPSCs som uppstår från den temporal summeringen av flera synaptiska kontakter påverkas på samma sätt av Γ-DGG. I fjärde försöket används en mer fysiologisk metod att förbättra aktionspotential bränning, nämligen afferenta synaptic stimulering. Skurar av synaptisk aktivitet kan övergående ökning/underlätta spontana aktionspotential bränning och release sannolikheten att den stimulerade afferenter. Därför, detta tillvägagångssätt tillåter mångfald manifesteras på ett mer fysiologiska sätt.
Följande protokoll beskriver metoden för att genomföra dessa experiment i mus hypotalamus vävnad. Specifikt, används kortikotropin frigöra hormon (CRH) nervceller av paraventricular kärnan i hypothalamus (PVN). Vi beskriva förfarandena för att genomföra hela-cell patch clamp elektrofysiologi och förklara de specifika experiment att testa för synaptic multiplicity.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

I det centrala nervsystemet, ett par av nervceller bildar ofta flera synaptiska kontakter och/eller funktionella signalsubstansen release webbplatser (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity är plast och förändringar i hela utvecklingen och olika fysiologiska förhållanden, att vara en viktig faktor för effekten av synaptisk transmission. Här, beskriver vi experiment för att uppskatta graden av multiplicityen av synapser som avslutas på en given postsynaptiska neuron med hela-cell patch clamp elektrofysiologi i akut hjärnskada skivor. Specifikt, används spänning-clamp inspelning för att jämföra skillnaden mellan amplituden av spontana excitatoriska postsynaptiska strömmar (sEPSCs) och miniatyr excitatoriska postsynaptiska strömmar (mEPSCs). Teorin bakom denna metod är att afferenta ingångar som uppvisar mångfald kommer att visa stora, potentiell handling-beroende sEPSCs på grund av synkron lanseringen som sker vid varje synaptisk kontakt. Däremot genererar aktionspotential-oberoende release (som är asynkron) mindre amplitud mEPSCs. Denna artikel beskriver en uppsättning experiment och analyser att karakterisera förekomsten av synaptic multiplicity och diskuterar de krav och begränsningar av tekniken. Denna teknik kan användas för att undersöka hur olika beteendemässiga, farmakologiska eller miljömässiga insatser i vivo påverkar organisationen av synaptiska kontakter i olika hjärnområden.

Det ovannämnda protokollet beskriver en metod för att undersöka graden av synaptic multiplicity, med musen hypotalamus nervceller som exempel med hela-cell patch clamp elektrofysiologi. Denna skiva förberedelse teknik bör ge friska viabla celler som inte har en svullen membran eller nucleus (figur 1). Varje steg i protokollet är viktigt för hälsa av vävnad och kvaliteten på inspelningarna.
<img alt="Fi...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Utvärdering av Synaptic Multiplicity använder hela-cell Patch-clamp elektrofysiologi

Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma funktionella synaptic multiplicityen använder hela-cell patch clamp elektrofysiologi i akut hjärnskada skivor.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

I hjärnan bildar ett par nervceller ofta flera synaptiska kontakter, som kallas synaptisk multiplicity. Men, exakt undersökning av synaptisk multiplicity kräver tekniskt utmanande experiment. Detta protokoll beskriver en enkel metod för brutto uppskattning av synaptisk multiplicity med hela-cell patch-clamp elektrofysiologi.Denna metod kan tillämpas på alla arter och hjärnan område för att undersöka synaptisk multiplicity. Denna metod kräver grundläggande färdigheter i hela-cell patch-clamp elektrofysiologi. Att få inspelningar av hög kvalitet med lågt och stabilt åtkomstmotstånd är avgörande för att data ska kunna tolkas korrekt.För att erhålla helcellskonfiguration placerar du inspelningspipetten precis ovanför skiva och offsetpipettström i spänningsklämningsläget. Applicera lätt positivt tryck på pipetten, och lås stopcock. Därefter väljer du en frisk cell med ett intakt membran, och närmar dig vävnaden med pipetten.Det positiva trycket bör orsaka en lätt störning på vävnaden. Ta långsamt pipetten närmare cellen i en diagonal rörelse tills en liten grop bildas på cellytan. Släpp sedan det positiva trycklåset.Cellen kommer att börja bilda en tätning, och motståndet kommer att öka över en gigaohm. I spänningsklämma håller du cellen på minus 68 millivolt. Därefter dra något pipetten bort från cellen diagonalt för att avlägsna övertryck.Kompensera för den snabba och långsamma pipettkaacitansen. Applicera en kort uppsugning genom röret som är anslutet till pipetthållaren för att bryta igenom cellen och få en helcellskonfiguration. Sedan, växla till cellläge på membranet testfönstret i en elektrofysiologi datainsamling och analys programvara.Bibehåll temperaturen i inspelningsbadet vid 27 till 30 grader Celsius och flödet på 1,5 till två milliliter per minut för efterföljande experiment. I en multiplikitet synaps, en åtgärd potential synkroniserar signalsubstansen release och genererar en större postsynaptic ström. Blockera åtgärder potential och kalcium-beroende vesicular release med TTX och kadmium förhindrar den postynaptic ström summering och minskar amplituden.När det inte finns någon multiplicity kommer blockeringsåtgärdspotential inte att ändra amplituden. I experiment ett, för att uppskatta multiplicitet, håll cellen på minus 68 millivolt medan perfusing det med låg kalcium aCSF. Registrera de spontana EPSC:erna i minst fem minuter för att säkerställa en stabil baslinje.Därefter lägger du till 30 mikromolarer 4-AP till aCSF för att öka åtgärder potentialberoende händelser, och spela in spontana EPSCs i minst 10 minuter för att få full läkemedelseffekt. Lägg sedan till 0,5 mikromolarer TTX och 10 mikromolarer kadmium till aCSF med 4-AP, och spela in miniatyr EPSCs i minst 10 minuter. För offlineanalys, använd den sista minuten av baslinjen omedelbart före tillämpningen av 4-AP, den 10: e minuten av 4-AP-program och den 10: e minuten av TTX-tillämpning.I detta experiment ersätts extracellulärt kalcium med strontium för att desynkronisera frisättningen av synaptiska vesiklar. Därför, om multiplikitet är närvarande, bör detta minska amplituden av postsynaptiska strömmar. I experiment två, spela in spontana EPSCs i minst fem minuter medan perfusing cellen med normal kalcium aCSF.För att desynkronisera vesicle release, börja perfusing cellen med strontium aCSF och spela in spontana EPSCs. För offline-analys, för att avgöra om de stora amplitud spontana EPSC beror på den synkrona frisättningen av vesiklar, jämför sista minuten av baslinjen till den 10: e minuten av strontium aCSF ansökan. Multiplicitet kan innebära multivesicular frisättning, vilket orsakar högre signalsubstanskoncentration i synaptiska spalten.Tillägg av gamma-DGG, en låg-affinitet AMPA-receptorantagonist, leder till mindre effektiv hämning av större multiquantal jämfört med mindre uniquantal postynaptic strömmar. Utan multivesicular release, kommer gamma-DGG vara lika effektiva på större och mindre postsynaptic strömmar. I experiment tre, för att testa för multivesicular release, spela in spontana EPSCs i låg kalcium aCSF i minst fem minuter.Lägg till 30 mikromolarer 4-AP till aCSF genom perfusionssystemet. Spela in de spontana EPSC:erna i minst 10 minuter. Lägg sedan till 200 mikromolarer gamma-DGG till aCSF med 4-AP, och spela in de spontana EPSC:erna i minst 10 minuter.Som ett kontrollexperiment i en separat cell, upprepa procedurerna, men applicera en låg koncentration av DNQX istället för gamma-DGG. För offlineanalys, analysera sista minuten av varje läkemedelsapplikation. Skurar av synaptisk aktivitet kan transiently öka spontana åtgärder potentiella bränning och frisättning sannolikheten för de stimulerade afferents.Om nervceller uppvisar multiplicitet, bör ökningen av åtgärder potentialer orsaka en övergående ökning av amplituden av postsynaptiska strömmar. I experiment fyra, registrera spontana EPSCs i normala kalcium aCSF. För att öka åtgärder potentiella bränning, stimulera afferents med hjälp av en monopolär glaselektrod fylld med aCSF med en hastighet av 20 hertz i två sekunder, och upprepa 10 gånger med en inter-burst intervall på 20 sekunder.För analys, använd 5, 000 millisekunder spontana EPSCs före den första stimulans som baslinjen och jämföra med de 10 till 300 millisekunder spontana EPSCs efter den slutliga stimulans. Sedan, ta den genomsnittliga amplituden och frekvensen förändras över 10 prövningar. Analysera spontana EPSCs och miniatyr EPSCs med hjälp av ett program som upptäcker och analyserar synaptiska strömmar.Använd de föreslagna detektionsparametrarna och nonstop-analysfunktionen för att upptäcka AMPA-receptormedierade EPSC:er. Manuellt skanna varje inspelning för att säkerställa att programmet är korrekt upptäcka varje händelse. Exportera händelsedata genom att kopiera den till urklipp, och klistra in dem i en programvara för datahantering.Därefter beräkna den genomsnittliga frekvensen och amplituden för varje läkemedelsbehandling, och utför de relevanta statistiska analyserna. I ett exempel som visas här ökar 4-AP både amplituden och frekvensen av spontana EPSC. Efterföljande applicering av TTX och kadmium minskar både amplituden och frekvensen.Här är fördelningen av spontan EPSC amplitud från inspelningen. I de hypotalamic nervcellerna som undersöks här, amplituden och frekvensen av baslinjen och TTX villkor är desamma, vilket tyder på att baslinjen spontana EPSCs innehåller mycket få åtgärder potential-beroende EPSCs. Följaktligen kan efterföljande experiment jämföra skillnaden mellan baslinjen och 4-AP för att mäta multiplicitet.Styrkan av synaptic överföring kan transiently ökas av skurar av synaptisk aktivitet. För att undersöka multiplicitet under mer fysiologiska förhållanden, afferent stimulering kan användas för att öka åtgärder potentiella bränning och frisättning sannolikhet. Här är sammanfattningarna av spontana EPSC frekvens och amplitud förändringar efter synaptisk stimulering.Stabila inspelningar är väsentliga för korrekt tolkning av uppgifterna. Beskriv data om åtkomstmotståndet ändras med mer än 20 %under inspelningen, eftersom detta kan förvirra analysen. Detta protokoll erbjuder ett enkelt sätt att uppskatta synaptisk multiplicity, som är en viktig avgörande faktor för synaptisk effekt och dess plasticitet i olika fysiologiska och patofysiologiska tillstånd.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Odling och Elektrofysiologi av celler på NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Whole Cell Patch Clamp för att undersöka mekanismer Infraröd nervstimulering

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Ett Datorstödd Multi-elektrod Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Hel-cell Patch-clamp Inspelningar från Morphologically- och neurokemiskt identifierade Hippocampus Interneuroner

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-cell patch-clamp inspelningar i hjärnan skivor

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Whole-cell Patch-clamp inspelningar för elektrofysiologisk bestämning av jonselektivitet i Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Slice Patch Clamp teknik för att analysera lärande-inducerad plasticitet

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Auditiv hjärnstammen svar och yttre hår Cell hela-cell Patch Clamp inspelning i Postnatal råttor

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparat och protokoll för hela cellen Patch Clamp inspelningen av Xenopus laevis Tectal nervceller

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Beredning av akut ryggmärgen skivor för hela-cell Patch-clamp inspelning i Substantia Gelatinosa nervceller

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...