Name: evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

JS Ontario lisansüstü öğrenim bursu aldım. W.I. zihinsel sağlık araştırma Kanada'dan yeni bir araştırmacı bursu aldı. Bu eser hibe W.I için Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada (06106-2015 RGPIN) ve Kanada Enstitüsü Sağlık Araştırma (PJT 148707) tarafından desteklenen işletim.

Tüm hayvan deneyleri hayvan bakımı Komitesi, University of Western Ontario'dan uygun olarak hayvan bakım kuralları (AUP #2014-031) Kanada Konseyi tarafından onaylanır.
1. çözümler
<ol><li>
Çözüm Dilimleme
	<ol>
<li>Dilimleme çözüm kompozisyon için Tablo 1 ' e bakın.</li>
		<li>20 x hisse senedi çözüm önceden hazırlamak ve 4 ° C'de 1 ay için saklayın.</li>
		<li>1 x Dilimleme çözüm, NaHCO3, glikoz ve sukroz GKD2</s...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity:+taming+the+beast.">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li><li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus.">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior.">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons.">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).</li><li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus.">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li><li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system.">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation.">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li><li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex.">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).</li><li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation.">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li><li>Mikl&#243;s, I. H., Kov&#225;cs, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats.">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li><li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+responses+at+a+central+synapse:+n+of+binomial+fit+predicts+number+of+stained+presynaptic+boutons.">Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons.</a> Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).</li><li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat.">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li><li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials.">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li><li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition.">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li><li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ard&#243;, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell&#8217;s+ribbon+synapse.">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell&#8217;s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li><li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses.">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li><li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus.">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li><li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses.">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li><li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li><li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity:+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response.">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li><li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons.">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li><li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons.">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li><li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse.">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).</li></ol>

Başarılı yama kelepçe Elektrofizyoloji deneme için bir önemli şart sağlıklı dilimleri/hücre almaktır. Bizim açıklanan protokol PVN nöronlar içeren hipotalamik dilimler için optimize edilmiştir. Diğer beyin alanları gerektirebilir çözümleri ve dilimleme yöntemleri21,22,23,24değiştiren. Kayıt için yalnızca hücre özellikleri membran direnç gibi sürekli izleyerek is...

Sinaptik iletimi nöronlar arasındaki iletişim için temel bir mekanizmadır ve dolayısıyla, beyin işlev. Sinaptik iletimi aynı zamanda değişken ve onun etkinliğini de yanıt düzenleyici sinyaller1gibi bir etkinlik bağlı şekilde değiştirebilirsiniz. Böylece, sinaptik fonksiyon incelenmesi nörolojik araştırma anahtar bir odağı olmuştur. Bütün hücre yama kelepçe Elektrofizyoloji anlamak, tasarlayarak Deneysel Tasarımlar ve veri analizleri, derinlemesine biyofiziksel ve moleküler mekanizmaları sinaptik iletimi için bize sağlar çok yönlü bir tekniktir. Yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım, belki teknik ve kavramı sayesinde, minyatür eksitatör/inhibitör postsinaptik akımların ölçülmesi basitliğidir (bana / IPSCs) gerilim altında yapılandırma2,3, kelepçe 4 , 5 , 6. bireysel ÇATOM presynaptic terminalden 7 serbest bırakmak onların anılan sıraya göre nörotransmitter bağlama cevaben iyonlar aracılığıyla postsinaptik ionotropic reseptörleri (örneğin AMPA ve GABAA reseptörleri) akışını temsil . Kayıt voltaj Na+ kanal engelleyici Tetradotoksin varlığında (TTX) elde edilir çünkü serbest aksiyon potansiyeli bağımsızdır ve normalde nörotransmitter içeren tek bir sinaptik vezikül içerir. Bu duymadığını, ÇATOM ortalama genliği yaygın sayı ve bir tek yayın sitesi karşı postsinaptik reseptörleri işlevini temsil eden quantal boyutu için kaba bir tahmin olarak kullanılır. Öte yandan, ÇATOM sıklığını postsinaptik hücre ve onların ortalama yayın olasılık üzerine sonlandırma sinapslarda toplam sayısı bir arada temsil etmek için kabul edilir. Ancak, bu parametreler başka bir değişken-multiplicativity sinapslar veya sinaptik çeşitlilik ölçüyor musunuz — hangisi sinaptik iletimi etkinliği için önemli.
Sinaptik iletimi7,8,9quantal teorisi üzerinde bağlı olarak, bir çift nöronların arasında belirli bir bağlantı gücü üç faktöre bağlıdır: fonksiyonel sinapslarda (N) sayısı postsinaptik yanıt-e doğru serbest bırakmak-in tek sinaptik vezikül (quantal boyutu; Q) ve nörotransmitter yayın (Pr) olasılığı. Sinaptik çeşitlilik Niçin eşdeğerdir. Sinaptik çeşitlilik geliştirilmesi veya çarpma sinapslarda budama boyunca geliştirme ve farklı hastalık Birleşik3,4,6,10plastiktir. Bu nedenle, sinaptik çeşitlilik karakterize sağlık ve hastalığında sinaptik iletimi etkinliğini anlamak için önemli sonuçları vardır. Elektron mikroskobu gibi teknikleri sinaptik çeşitlilik yapısal kanıtı aynı postsinaptik nöron11,12üzerine aynı axon kaynaklanan birden fazla sinaptik kişi tespit ederek belirleyebilir, 13,14. Ancak, bu yapısal olarak tanımlanan multisynapses işlevsel olarak sessiz15,16olabilir. N kesin fonksiyonel inceleme gerektirir teknik olarak Elektrofizyolojik yaklaşımlar, belirli bir bağlantı birden çok fonksiyonel yayın siteleri olup olmadığını belirleyebilir eşleştirilmiş bütün hücreli kayıtları gibi zorlu ve en az tek bir sözde axon işe hedefliyoruz stimülasyon yaklaşımlar.
Bu protokol için başlangıçta Hsia ark2tarafından geliştirilmiş bir yöntem benimseyerek sinaptik çeşitlilik tahmin etmek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik kendiliğinden PSC'ler (sPSCs) ve belirli bir neuron için tüm girişleri arasında sinaptik çeşitlilik derecesini tahmin etmek için bize izin verir tüm hücreli yama kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak ÇATOM ölçümü içerir.  Gibi önceden tanımlanmış, sinaptik çeşitlilik belirli bir öncesi ve postsinaptik nöron arasındaki sinapslar sayısını yansıtır. Birden çok sinapslarda senkronizasyonu içinde bir aksiyon potansiyeli tarafından işe, büyük genlik PSC üreten bireysel (yani quantal) PSC zamansal toplamı yüksek bir olasılık olacak.  ÇATOM kayıtları (hangi aksiyon potansiyelleri TTX tarafından engellenen), geçici bireysel (zaman uyumlu) ÇATOM toplamı olasılığı düşüktür. Bu mantığı kullanarak, sinaptik çeşitlilik (Aksiyon potansiyeli bağımlı sürümüyle) sPSC genlik ÇATOM genlik için karşılaştırarak tahmin edilebilir.
Çeşitlilik varlığını incelemek için dört deneyleri ve onların analizleri glutamatergic EPSCs örnek olarak kullanarak açıklar. Ancak, aynı yaklaşımı-ebilmek var olmak kullanılmış için hızlı GABAergic/glycinergic iletim (IPSCs). Her deneme için kısa bir gerekçe aşağıda açıklanmıştır. İlk olarak, yukarıda açıklandığı gibi sinaptik çeşitlilik sEPSCs mEPSCs için genliği karşılaştırarak tahmin edilebilir. Bu yaklaşım için iki gereksinim vardır; 1) presynaptic akson kayıt sırasında aksiyon potansiyelleri yeterli sayıda yangın gerekir ve böylece birden çok sinapslarda sinir bir aksiyon potansiyeli girişte yayın 2) Pr yüksek olmalıdır. Bu gereksinimleri karşılamak üzere, sEPSCs ilk düşük Ca2 + yapay serebrospinal sıvı (aCSF) kaydedilir ve düşük konsantrasyon K+ kanal antagonisti, 4-eylem artırmak için Aminopyridine (4-AP) huzurunda kaydedildi potansiyel ateş ve Pr. O zaman aksiyon potansiyeli ateş TTX ve Pr bir voltaj Ca2 + kanal engelleyici tarafından Cd2 +azalmış tarafından engellendi. SEPSCs (4AP ile) genliği bu mEPSC karşılaştırılır (4AP, TTX ve Cd2 +). İkinci denemede Ca2 + ekimolar Sr2 + vezikül yayın desynchronize aCSF olarak değiştirilir. CA2 + veziküller zaman uyumlu sürümü için gerekli olduğu gibi değiştirme ile Sr2 + çokluğu işaret etmektedir büyük genlik sEPSCs ortadan kaldırmak gerekir. Üçüncü olarak, mechanistically, çeşitlilik birden çok sinaptik ilgili kişiler aynı postsinaptik nöron veya multivesicular açıklaması (içinde tek bir sinaptik kişiyi serbest Yani çoklu veziküller) neden olabilir17,18. Çeşitlilik iki tür arasında ayırt etmek için üçüncü deneme kullandığı bir düşük benzeşme, hızlı dissociating rekabetçi antagonist AMPA reseptör, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,büyük olup olmadığını belirlemek için18 sEPSC multivesicular serbest postsinaptik reseptörleri örtüşen bir popülasyon üzerinde hareket veya bağımsız sinapslarda zamansal özetleme sonucudur. Büyük genlik olayları multivesicular yayınlamasını ortaya çıkarsa, birden fazla sinaptik kişi zamansal toplamı ortaya büyük sEPSCs benzer şekilde etkilenecek ise γ-DGG büyük kıyasla daha küçük sEPSCs, engelleme daha az etkili olacak γ-DGG. Dördüncü denemede daha fizyolojik bir yöntem aksiyon potansiyeli ateş, yani afferent sinaptik uyarma arttırmak için kullanılır. Sinirsel aktivite patlamaları geçici artış/uyarılan afferents spontan aksiyon potansiyeli ateş ve yayın olasılığını kolaylaştırabilir. Bu nedenle, bu yaklaşım daha fizyolojik bir şekilde tezahür etmeye çeşitlilik sağlar.
Aşağıdaki iletişim kuralı bu deneyler fare hipotalamik doku yöntemler açıklanmıştır. Özellikle, kortikotropin serbest hormon (İBB) nöronlar hipotalamus (PVN) paraventricular çekirdeği kullanılır. Biz bütün hücreli yama kelepçe Elektrofizyoloji yürütmek için yordamlar açıklar ve sinaptik çeşitlilik için test etmek için belirli deneyler açıklamak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 blade</td>
			<td>Fisher Scientific/others</td>
			<td>35698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 blade</td>
			<td>VWR/others</td>
			<td>21909-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 uM syringe filters</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>09-719-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson foreceps</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled sharp scissors</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Sigma/others</td>
			<td>1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paintbrush</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>15-183-35/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LG-8680-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi/others</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini analysis</td>
			<td>Synaptosoft</td>
			<td>MiniAnalysis 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmomoter</td>
			<td>Wescor Inc</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20-ATC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 3</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle No. 4</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>72-8356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q Academic A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate lid</td>
			<td>Fisher/various</td>
			<td>07-201-590/various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>275875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPTA</td>
			<td>molecular probes</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SUC507.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Alamone Labs</td>
			<td>T-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yDGG</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6729-55-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology

Merkezi sinir sistemi nöronlar bir çift sık sık birden çok sinaptik kişiler ve/veya fonksiyonel nörotransmitter yayın siteleri (sinaptik çeşitlilik) oluşturur. Sinaptik plastik ve değişiklikler geliştirme boyunca ve sinaptik iletimi etkinliği için önemli bir belirleyici olmak farklı fizyolojik koşullarda olduğunu. Burada, Bütün hücre yama kelepçe Elektrofizyoloji akut beyin dilimler halinde kullanarak belirli bir postsinaptik nöron üzerine sonlandırma sinapslarda çokluğu derecesini tahmin etmek için deneyler anahat. Özellikle, Gerilim Tipi Kelepçe kayıt spontan eksitatör postsinaptik akımları (sEPSCs) genliği ve minyatür eksitatör postsinaptik akımları (mEPSCs) arasında fark karşılaştırmak için kullanılır. Bu yöntem arkasında çeşitlilik gösteren afferent girişleri her sinaptik temas oluşur zaman uyumlu sürümü nedeniyle büyük, Aksiyon potansiyeli bağımlı sEPSCs gösterecektir teoridir. Buna ek olarak, (zaman uyumsuz olan) aksiyon potansiyeli bağımsız yayın daha küçük genlik mEPSCs oluşturur. Bu makalede birtakım deneyler ve analizler sinaptik çeşitlilik varlığını karakterize için özetliyor ve teknik sınırlamaları ve gereksinimleri verilmektedir. Bu teknik vivo etkiler sinaptik kişiler farklı beyin bölgeleri'organizasyonu nasıl farklı davranış, farmakolojik ya da çevresel müdahaleleri araştırmak için uygulanabilir.

Yukarıdaki Protokolü fare hipotalamik nöronlar örnek olarak kullanarak sinaptik çeşitlilik derecesini incelemek için bütün hücreli yama kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak bir yöntem açıklanır. Bu dilim hazırlama tekniği bir şişmiş membran veya çekirdek (şekil 1) sahip olmayan sağlıklı hücrelerin verim. İletişim kuralı her adımda doku ve kalite kayıtları sağlığı için önemlidir.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology at JoVE.com

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Sinaptik çeşitlilik bütün hücreli yama-kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak değerlendirilmesi

Burada, Bütün hücre yama kelepçe Elektrofizyoloji akut beyin dilimler halinde kullanarak fonksiyonel sinaptik çeşitlilik değerlendirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Beyinde, nöronların bir çift genellikle sinaptik çokluk denir birden fazla sinaptik temas, formu. Ancak, sinaptik çokluğun hassas incelenmesi teknik olarak zorlu deneyler gerektirir. Bu protokol, tüm hücreli yama-kıskaç elektrofizyolojisi kullanılarak sinaptik çokluğun brüt tahmini için basit bir yöntem tanımlanmaktadır.Bu yöntem sinaptik çokluğu araştırmak için herhangi bir tür ve beyin bölgesine uygulanabilir. Bu yöntem, tüm hücreli yama-kıskaç elektrofizyolojisinde temel beceriler gerektirir. Düşük ve kararlı erişim direncine sahip yüksek kaliteli kayıtların elde edilmesi, verilerin doğru yorumlanması için çok önemlidir.Tüm hücre yapılandırmasını elde etmek için, kayıt pipetini dilimin hemen üzerine yerleştirin ve pipet akımını voltaj kelepçesi moduna ayırın. Pipete hafif pozitif basınç uygulayın ve stopcock kilitleyin. Daha sonra, sağlam bir membran ile sağlıklı bir hücre seçin ve pipet ile doku yaklaşım.Pozitif basınç dokuda hafif bir bozulmaya neden olmalıdır. Hücre yüzeyinde küçük bir gamze oluşana kadar pipeti çapraz hareketle yavaşça hücreye yaklaştırın. Sonra, pozitif basınç kilidi bırakın.Hücre bir mühür oluşturmaya başlayacak ve direnç bir gigaohm üzerinde artacak. Voltaj kıskacında, hücreyi eksi 68 milivoltta tutun. Daha sonra, aşırı basıncı kaldırmak için pipeti çapraz olarak hücreden hafifçe çekin.Hızlı ve yavaş pipet kapasitansını telafi edin. Hücreyi kırmak ve tam hücre yapılandırması elde etmek için pipet tutucuya bağlı tüp emerek kısa bir emme uygulayın. Daha sonra, elektrofizyoloji veri toplama ve analiz yazılımında membran test penceresindeki hücre moduna geçin.Kayıt banyosunun sıcaklığını 27 ila 30 santigrat derece, akış hızını ise sonraki deneyler için dakikada 1,5 ila iki mililitrede koruyun. Çokluk sinaps, bir eylem potansiyeli nörotransmitter salınımı senkronize ve daha büyük bir postsinaptik akım oluşturur. TTX ve kadmiyum ile etki potansiyelinin ve kalsiyuma bağımlı veziküler salınımın engellenmesi postsinaptik akım özetini önler ve genliği azaltır.Çokluk olmadığında, engelleme eylem potansiyeli genliği değiştirmez. Deneyde, çokluğu tahmin etmek için, düşük kalsiyum aCSF ile perfüzyon sırasında eksi 68 milivolt hücre tutun. Kararlı bir taban çizgisi sağlamak için spontan EPSC'leri en az beş dakika kaydedin.Daha sonra, eylem potansiyeline bağlı olayları artırmak için aCSF'ye 30 mikromolar 4-AP ekleyin ve tam ilaç etkisini elde etmek için spontan EPSC'leri en az 10 dakika kaydedin. Daha sonra, 4-AP ile aCSF'ye 0,5 mikromolar TTX ve 10 mikromolar kadmiyum ekleyin ve minyatür EPSC'leri en az 10 dakika kaydedin. Çevrimdışı çözümleme için, 4-AP uygulamasından hemen önce taban çizgisinin son bir dakikasını, 4-AP uygulamasının 10.Bu deneyde, ekstrasellüler kalsiyum sinaptik veziküllerin salınımını senkronize etmek için stronsiyum ile değiştirilir. Bu nedenle, çokluk varsa, bu postsinaptik akımların genliğini azaltmalıdır. İkinci deneyde, hücreyi normal kalsiyum aCSF ile perfüzyon yaparken spontan EPSC'leri en az beş dakika kaydedin.Vezikül salınımını senkronize etmek için hücreyi stronsiyum aCSF ile perfüzyona başlayın ve spontan EPSC'leri kaydedin. Çevrimdışı analiz için, büyük genlik spontan EPSC'lerin veziküllerin senkron salınımından kaynaklanıp kaynaklmadığını belirlemek için, taban çizgisinin son dakikasını stronsiyum aCSF uygulamasının 10. Çokluk multivesiküler salınım içerebilir, hangi sinaptik yarık yüksek nörotransmitter konsantrasyonu neden olur.Gama-DGG eklenmesi, düşük afiniteli AMPA reseptör antagonisti, daha küçük uniquantal postsynaptic akımlara göre daha küçük multiquantal daha az etkili inhibisyonu yol açar. Multiveziküler salınım olmadan, gama-DGG daha büyük ve daha küçük postsinaptik akımlar üzerinde eşit derecede etkili olacaktır. Üçüncü deneyde, multivesiküler salınım ı test etmek için, spontan EPSC'leri düşük kalsiyumlu aCSF'de en az beş dakika kaydedin.Perfüzyon sistemi ile aCSF'ye 30 mikromolar 4-AP ekleyin. Spontan EPSC'leri en az 10 dakika kaydedin. Daha sonra, 4-AP ile aCSF'ye 200 mikromolar gama-DGG ekleyin ve spontan EPSC'leri en az 10 dakika kaydedin.Ayrı bir hücrede bir kontrol deneyi olarak, yordamları tekrarlayın, ancak gama-DGG yerine düşük konsantrasyonda DNQX uygulayın. Çevrimdışı analiz için, her ilaç uygulamasının son dakikasını analiz edin. Sinaptik aktivite patlamaları geçici olarak spontan eylem potansiyelini artırabilir ve uyarılmış afferents serbest olasılık.Nöronlar çokluk sergilerse, etki potansiyellerinin artması postsinaptik akımların genliğinde geçici bir artışa neden olmalıdır. Dördüncü deneyde, normal kalsiyum aCSF'de spontan EPSC'leri kaydedin. Eylem potansiyelini artırmak için, aCSF ile doldurulmuş monopolar cam elektrotu kullanarak afferentleri iki saniye boyunca 20 hertz hızında uyarın ve 20 saniyelik bir ara aralıkla 10 kez tekrarlayın.Analiz için, ilk uyarıcıdan önce temel olarak 5,000 milisaniyesi spontan EPSC'ler kullanın ve son uyarıcıdan sonraki 10 ila 300 milisaniyesi spontan EPSC'lerle karşılaştırın. Daha sonra, 10 deneme üzerinde ortalama genlik ve frekans değişikliği almak. Spontan EPSC'leri ve minyatür EPSC'leri sinaptik akımları algılayan ve analiz eden bir program kullanarak analiz edin.AMPA reseptör aracılı EPSC'leri tespit etmek için önerilen algılama parametrelerini ve aralıksız analiz fonksiyonunu kullanın. Programın her olayı doğru bir şekilde algıladığından emin olmak için her kaydı el ile taz.rile. Olay verilerini panoya kopyalayarak dışa aktarın ve bir veri yönetimi yazılımına yapıştırın.Ardından, her ilaç tedavisi için ortalama sıklığı ve genliği hesaplayın ve ilgili istatistiksel analizleri gerçekleştirin. Burada gösterilen bir örnekte, 4-AP spontan EPSC'lerin genliğini ve sıklığını artırır. TTX ve kadmiyum un sonraki uygulaması hem genliği hem de frekansı azaltır.Burada kayıt spontan EPSC genlik dağılımıdır. Burada incelenen hipotalamik nöronlarda, bazal ve TTX koşullarının genliği ve sıklığı aynıdır, bu da bazal spontan EPSC'lerin çok az etki potansiyeline bağlı EPSC içerdiğini düşündürmektedir. Buna göre, sonraki denemeler çokluğu ölçmek için taban çizgisi ve 4-AP arasındaki farkı karşılaştırabilirsiniz.Sinaptik iletimin gücü sinaptik aktivite patlamaları ile geçici olarak arttırılabilir. Daha fizyolojik koşullar altında çokluğu araştırmak için, afferent stimülasyon eylem potansiyel ateş ve serbest olasılık artırmak için kullanılabilir. Sinaptik stimülasyon sonrası spontan EPSC frekans ı ve genlik değişikliklerinin özetleri aşağıda verilmiştir.Kararlı kayıtlar verilerin doğru yorumlanması için gereklidir. Giriş sırasında erişim direnci %20'den fazla değişirse verileri açıklayın, çünkü bu analizleri rahatsız edebilir. Bu protokol, farklı fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda sinaptik etkinliğin ve plastisitenin önemli bir belirleyicisi olan sinaptik çokluğu tahmin etmek için basit bir yol sunar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Hücreler NRCC Patch-klemp Chips kültür ve Elektrofizyoloji

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Kızılötesi Sinir Stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm Hücre Patch Kelepçe

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Bilgisayar destekli Çoklu elektrot Patch-kelepçe Sistemi

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Channelrhodopsins&#39;teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Dilim yama klemp tekniği öğrenme kaynaklı plastisite analiz etmek için

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Akut omurilik dilimleri hazırlanması gözlemliyorum Gelatinosa nöronlar bütün hücreli yama-kelepçe kayıt için

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...