Name: a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters
Uploaded: 2019-06-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af Kinas naturvidenskabelige fundament (tilskudsnummer 31471703, A0201300537 og 31671854 til J.V. og L.L., tilskudsnummer 31470435 til G.Y.) og 100-planen for udenlandske talenter (tilskuds nummeret JSB2014012 til J.V.).

Bemærk: der vises en skematisk oversigt i figur 1.
1. indsamling af prøver
<ol><li>Få østers prøver. Hold østers på is i løbet af perioden, transport og før laboratoriebrug og proces inden for 4-7 dage efter købet. Bemærk: for denne protokol blev østers købt fra Zhong Cai Wholesale Market i Nanjing (som kommer fra Ningde, Fujian, Kina og Lianyungang, Jiangsu, Kina), Haijie Aquatic Product Company i Qingdao (som kommer fra Qingdao, Shandong, China...

<ol>
	<li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+a+DNA+taxonomy.">The promise of a DNA taxonomy.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).</li><li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+identification+of+dried+shellfish+(oyster,+clam+and+mussel)+products+sold+on+the+Chinese+market.">Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market.</a> Food Control. 90, 199-204 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+cob+and+cox1+genes+and+editing+of+the+corresponding+mRNAs+in+Dinophysis+acuminata+from+Narragansett+Bay,+with+special+reference+to+the+phylogenetic+position+of+the+genus+Dinophysis.">Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).</li><li>Sell, J., Spirkovski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+differentiation+between+two+forms+of+trout+Salmo+letnica,+endemic+to+the+Balkan+Lake+Ohrid,+reflects+their+reproductive+isolation.">Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation.</a> Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).</li><li>Karadjian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+rearranged+mitochondrial+genome+in+Nycteria+parasites+(Haemosporidia)+from+bats.">Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).</li><li>Morga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+from+flat+oyster+Ostrea+edulis+as+suitable+housekeeping+genes+for+quantitative+real+time+PCR.">Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR.</a> Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).</li><li>Delsuc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+systematics+of+armadillos+(Xenarthra,+Dasypodidae):+contribution+of+maximum+likelihood+and+Bayesian+analyses+of+mitochondrial+and+nuclear+genes.">Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+UDP-Glucose+Dehydrogenase+from+Akkermansia+muciniphila.">Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).</li><li>Gu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+the+UDP-Xylose+Biosynthesis+Pathway+in+Sphaerobacter+thermophilus.">Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).</li><li>Duan, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+UDP-xylose+biosynthesis+pathway+in+Rhodothermus+marinus.">Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li><li>Song, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-glucose+4-epimerase+and+&#946;-1,4-galactosyltransferase+from+the+oyster+Magallana+gigas+as+valuable+biocatalysts+for+the+production+of+galactosylated+products.">UDP-glucose 4-epimerase and &#946;-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).</li><li>Gainey, P. A., Phelps, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uridine+diphosphate+glucuronic+acid+production+and+utilization+in+various+tissues+actively+synthesizing+glycosaminoglycans.">Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans.</a> Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).</li></ol>

Den præsenterede protokol giver mulighed for genetisk identifikation af ikke-refererede østers prøver med lignende fænotype fra regionale fiskemarkeder ved sammenligning af COX1 og ND-gener med en offentligt tilgængelig Oyster DNA-genom-database. Betydningen af denne metode ligger i dens enkelhed, da kun en enkelt PCR-reaktion er nødvendig for evalueringen af det virtuelle cDNA-bibliotek. De to bevaret mitokondrie COX1 og ND gener blev forstærket fra et cDNA-bibliotek, som blev genereret ved omvendt transskription...

Erhvervelse af levende refereret biologisk materiale kan være udfordrende på grund af lange leveringstider, iværksætter tænkning eller landespecifikke toldbestemmelser. Alternativt kan det påkrævede biologiske materiale også indsamles fra fænotypiske identiske prøver. Disse prøver kan dog variere betydeligt med hensyn til genotype, og derfor bliver sammenligninger med digitalt lagrede reference genomer af samme art ofte vanskelige eller endda forgæves på grund af uforeneligheden af det nyindkøbte materiale med eksisterende DNA-forstærknings metoder. Sequencing meget bevaret gener af individuelle prøver er et meget anvendt og kraftfuldt værktøj til at identificere arter1, såsom bevaret mitokondrie gener, der ofte anvendes som reference gener for Kvalitetsvurderingen af cDNA-biblioteker2 ,3,4,5,6. Den tilgrundliggende begrundelse for den heri præsenterede metode er, at høj bevaring af mitokondrie-gensekvenser i individuelle anonyme østers prøver sammenlignet med de tilsvarende sekvenser af reference genomet indikerer, at andre gener også kan vise en lav grad af divergens, i betragtning af den generelt hurtigere rate af mitokondrie DNA evolution i forhold til nukleare DNA7, tillader forstærkning og isolering af en bred vifte af videnskabeligt og industrielt relevante gener ved blot at bruge offentligt tilgængelige sekvensering af data som reference.
Det overordnede mål med den heri beskrevne metode er at præsentere en optimeret arbejdsgang for at generere en næsten sekvenseret Oyster cDNA bibliotek, som kan bruges som skabelon DNA til kloning af østers gener. I virtuel sekvensering omgås de Novo genom sekvensering; i stedet bruges en kendt, digitalt lagret referencesekvens direkte til at udnytte eller designe primere til produktion af cdnas, der i sidste ende vil omfatte et bibliotek (eller blive føjet til en allerede eksisterende). Målet er at skabe et konvergerende cDNA-bibliotek, hvilket betyder, at ligheder mellem de genererede cDNA-sekvenser og reference sekvensen kan rangeres fra lav til høj divergens. En vigtig fordel ved at bruge cytochrom C oxidase underenhed 1 (COX1) og NADH dehydrogenase (ND) som reference gener er, at selv meget geografisk disjunct østers prøver kan profileret på grund af den høje bevaring af disse mitokondrie gener. Efter at have bevist tilgangen med disse veletablerede markører viser vi derefter dens anvendelse på to enzym kandidater, der er involveret i sukker nukleotid biosyntese og kan være af industriel relevans8,9, 10. det bioteknologiske potentiale i stillehavsøsters er stadig uudforsket. Derfor mener vi, at denne konvergerende metode til forberedelse af et næsten sekvenserede cDNA-bibliotek også vil være hensigtsmæssig for ikke-specialiserede forskere, der ønsker at generere cDNA fra dette relevante biologiske materiale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Chemicals:</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1% Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>490-79-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose for molecular biology</td>
			<td>Biowest Chemicals</td>
			<td>111860</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicilin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Lingfeng, Shanghai</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanidinium thiocyanate-phenol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td>Nanjing Chemical Reagent</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10855021</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">NAD+</td>
			<td>Duly Biotech</td>
			<td>53-84-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenyl-methylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UDP-glucose</td>
			<td>Wuhu Nuowei Chemicals</td>
			<td>28053-08-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UDP-glucuronic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>63700-19-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tools/Instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MALDI-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Autoflex</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal block heater</td>
			<td>Long Yang Scientific Instruments</td>
			<td>Thermoshaker HB20</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermocycler</td>
			<td>Hema</td>
			<td>9600</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Enzyme and Kits:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10&#215;Ligation buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B69</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5&#215;PrimeSTAR buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9158A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alkaline phosphatase</td>
			<td>ThermoFisher FastAP</td>
			<td>EF0654</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTTGACCAAAAACATAAGACATG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cutsmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dNTP mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cleanup Kit</td>
			<td>AxyGen</td>
			<td>AP-PCR-250</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET-30a(+) vector</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>69909</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters

Adgang til biologisk materiale af reference arter, som tidligere blev anvendt i vigtige eksperimenter, såsom udvikling af nye cellelinjer eller genomsekvensering af projekter, er ofte vanskelige at give for yderligere undersøgelser eller tredjeparter på grund af af prøvernes forbruger karakter. Selv om de nu er bredt fordelt over Stillehavs kysterne i Asien, Australien og Nordamerika, er individuelle stillehavsøsters prøver genetisk meget forskellige og er derfor ikke direkte egnede som udgangsmateriale til genbiblioteker. I denne artikel viser vi brugen af ikke-refererede stillehavsøsters prøver opnået fra regionale fiskemarkeder for at generere cDNA-biblioteker. Disse biblioteker blev derefter sammenlignet med det offentligt tilgængelige østers genom, og det nærmeste relaterede bibliotek blev valgt ved hjælp af mitokondrie reference gener cytochrom C oxidase underenhed I (COX1) og NADH dehydrogenase (ND). Egnetheden af det genererede cDNA-bibliotek er også demonstreret ved kloning og ekspression af to gener, der koder enzymerne UDP-glucuronsyre dehydrogenase (UGD) og UDP-xylose syntase (UXS), som er ansvarlige for biosyntesen af UDP-xylose fra UDP-glucose.

Figur 1 viser en skematisk oversigt over den beskrevne tilberedningsmetode for det konvergerende cDNA-bibliotek afledt af stillehavsøsters individer. Figur 2 viser sekvenser af COX1 og nd-gener fra en fjernt beslægtet østers prøve med stor divergens fra referencematerialets COX1-og nd-gensekvenser. Figur 3 viser SEKVENSER af COX1 og nd-gener fra en nært beslægtet østers prøve med lav afvigelse fra referencematerialets COX1-o...

Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

Vi beskriver en strategi for, hvordan man bruger RNA-prøver fra ikke-refererede stillehavsøsters prøver, og evaluerer det genetiske materiale i forhold til offentligt tilgængelige genomdata for at generere et næsten sekvenserede cDNA-bibliotek.

En konvergerende strategi for generering af et næsten Sekvenserede cDNA-bibliotek fra ikke-refererede stillehavsøsters

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

Det centrale spørgsmål, vi ønsker at tage fat på med denne metode, er, hvordan vi kan bruge RNA-prøver fra materiale, der er købt på lokale fødevaremarkeder til kloning af bioteknologisk relevante gener? Her bruger vi stillehavsøsters som et casestudie til at demonstrere denne tilgang og potentielle yderligere anvendelse. Den største fordel ved denne teknik er, at konventionel genom eller cDNA sekventering af østersprøverne kan omgås.I stedet blev sekvenser af cytokrom c oxidase underenhed I og NADH dehydrogenase sammenlignet med offentligt tilgængelige referencesekvenser fra stillehavsøstersen for at vælge den mest nært beslægtede prøve. Den cDNA, der fremstilles ud fra denne prøve, kan anvendes direkte til kloning af bioteknologisk relevante gener, som kan vælges ved hjælp af oplysninger om offentlig sekvens. Demonstration af proceduren vil blive Yongmei Lyu og Yuquan Li, to kandidatstuderende fra Glycomics og Glycan Bioengineering Research Center på Nanjing Agricultural University.For at forberede østers vævprøve, bruge en steriliseret skalpel til at skære ud ca 100 milligram homogent blødt væv fra den omtrentlige geometriske centrum af hver østers prøve. Prøven overføres til en mørtel fyldt med 50 milliliter flydende nitrogen. Grind den flash-frosne østersvæv i et fint pulver.75 mg af hver prøves frosne væv vejes i et sterilt 1,5 millilitercentrifugerør, og der blandes med en milliliter guanidinium thiocyanat-phenolekstraktionsreageseage. Det mest kritiske trin i denne procedure er RNA-udvindingstrinnet. For at minimere RNA nedbrydning, er det vigtigt at reducere tiden mellem høst af østersvæv og RNA ekstraktion.Centrifuge prøven ved 14, 000 gange g og fire grader Celsius i 15 minutter. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 milliliter centrifugerør, tilsæt 200 mikroliter chloroform, og bland grundigt på en vortex mixer i 10 til 15 sekunder, indtil blandingen bliver mælkehvid. Dernæst centrifuge i 15 minutter som gjort tidligere.Med en pipette på 200 mikroliter overføres det øverste vandige lag forsigtigt uden at forstyrre interfasen til et nyt 1,5 milliliter centrifugerør. Der tilsættes 500 mikroliter isopropylalkohol i centrifugerøret, og inverteres forsigtigt for at blande prøverne. Lad derefter prøverne blive på is i 20 minutter.Centrifuge ved 14, 000 gange g og fire grader Celsius i otte minutter, og fjern supernatanten. Pelletsuspendrer pelletet op i en milliliter 75 % ethanol og centrifugeres ved 14, 000 gange g og fire grader Celsius i fem minutter. Fjern alle supernatant, og gentag vask i ethanol.Pillerne tørres i seks minutter ved stuetemperatur. Derefter opløses den tørrede RNA-pellet i 25 mikroliter DEPC-behandlet vand, og hold røret på is. Brug RNA-prøverne inden for 24 timer.For at generere et cDNA-bibliotek skal du først forberede en reaktionsblanding for hver RNA-prøve i et 300-mikroliter-PCR-rør ved at tilføje løsninger i henhold til manuskriptet. Der tilsættes en mikroliter af den ekstraherede RNA-prøve i røret. Inkuber blandingen i en PCR termocyr i 60 minutter ved 42 grader Celsius, og derefter øge temperaturen til 95 grader Celsius i fem minutter.Opbevar det genererede cDNA-bibliotek i op til 12 måneder ved minus 20 grader Celsius. Først tilsættes en mikroliter af det genererede cDNA-bibliotek til rør, der indeholder PCR-blandinger, der er udarbejdet i henhold til manuskriptet. Placer PCR-rørene i PCR-termokcymaneren, og udfør PCR-forstærkningen med et indledende denatureringstrin og 35 PCR-reaktionscyklusser bestående af et udglødningstrin, et forlængelsestrin og et denatureringstrin i henhold til manuskriptet.Efter cyklusser, udføre en afsluttende forlængelse trin i fem minutter. Brug fem mikroliter af PCR-produktet til at kontrollere kvaliteten ved agarosegelelektroforese. Overhold det forstærkede COX1- eller ND-gen som et enkelt bånd på henholdsvis 759 eller 748 basepar.For at rense resten af PCR-produktet tilsættes 100 mikroliter DNA-bindende buffer, der indeholder høje koncentrationer af chaotropic salte til hver prøve. Vortex kort at blande indholdet. Anbring en rensekolonne i et centrifugerør med to milliliter.Pipette reaktionsblandingen i kolonnen. Røret anbringes med den monterede søjle i en centrifuge ved 14.000 gange g i et minut ved stuetemperatur. Efter at filtratet er kasseret fra centrifugerøret med to milliliter, vaskes der to gange med 700 og 400 mikroliter vaskeopløsning W2 ved centrifugering ved 14.000 gange g.Dernæst varme en milliliter deioniseret vand til 65 grader Celsius i en metal blok varmelegeme. Overfør kolonnen til et nyt 1,5-milliliter centrifugerør, og pipette 25 mikroliter af det forvarmede deioniseret vand til midten af den hvide søjlemembran. Lad membranen suge i et minut ved stuetemperatur.Derefter centrifuge rør med kolonnen på 14, 000 gange g i et minut ved stuetemperatur. Kassér kolonnen, og opbevar det rensede PCR-produkt i op til 12 måneder ved minus 20 grader Celsius. Valgfrit, COX1 eller ND omvendt primere kan også bruges til tovejs sekvensering.Brug den relevante COX1- eller ND-fremadrettede primer til Sanger-sekvensering. Når sekvensresultaterne er hentet, sammenlignes sekvenserne med genomsekvensen af stillehavsøstersreferencestammen ved hjælp af onlineværktøjet NCBI Nucleotide BLAST. Brug respektive forreste og omvendte primere af MgUGD og MgUXS gener til at forstærke og rense ved PCR som gjort tidligere.Efter inkubation af rensede PCR-produkter med fordøjelsesbuffer klargøres den præedigestede pET-30a-vektor ved at opløse 500 nanogram pET-30a i et 1,5 milliliter centrifugerør, og der tilsættes deioniseret vand til toppen op til 16 mikroliter. Derefter tilsættes to mikroliter af 10 gange koncentreret fordøjelsesbuffer og en mikroliter hver af de 20 enheder begrænsning endonucleaser Nde1 og Xho1 i røret. Inkuber blandingen ved 37 grader Celsius i tre timer.Derefter tilsættes en mikroliter af en-enhed alkalisk fosfatase, og inkuberes ved 37 grader Celsius i en ekstra time. Derefter placere røret i en forvarmet metal blok varmelegeme ved 75 grader Celsius i 10 minutter for at inaktivere alkalisk fosfatase. Efter dyrkning E.coli BL21 celler bærer MgUGD og MgUXS gener, overføre kulturen i 400-milliliter LB medium i en to-liters rystekolbe, og læg den på en shaker ved 200 rpm ved en temperatur på 37 grader Celsius.Efter tre timer kontrolleres den optiske tæthed på et fotometer ved en bølgelængde på 600 nanometer, og sørg for, at den når en absorption på ca. 0,5. Derefter reducere shaker temperatur til 20 grader Celsius. Der tilsættes 400 mikroliter af en-molar IPTG for at fremkalde ekspressionen af de rekombinante proteiner i tre timer.Efter høst af cellerne, forstyrre cellerne ved sonikering i 20 minutter ved fire grader Celsius. Centrifuge ved 14, 000 gange g og fire grader Celsius i 20 minutter, og indsamle supernatant i et nyt rør til aktivitetstest. Efter aktivitetsanalysen skal reaktionerne slukkes ved at tilsætte 20 mikroliter methanol og 40 mikroliter chloroform til MgUXS- og MgUGD-blandingerne.Vortex prøven blandinger, og centrifuge ved 14, 000 gange g i seks minutter og fire grader Celsius. Opsaml det øverste vandige lag af hvert rør i nye rør til MALDI-TOF massespektrometri. I dette eksperiment blev sekvensjusteringen af COX1- og ND-gensekvenserne af en meget divergerende prøve sammenlignet med referencen til stillehavsøsters.De røde pile viser nukleotidforskelle mellem referencesekvensen og rækkefølgen af de opnåede cDNA-prøver. Sekvenserne af COX1- og ND-generne i en nært beslægtet østersprøve viser lav afvigelse fra referencen til stillehavsøstersstammen. MALDI-TOF massespektrometri viser en vellykket anvendelse af cDNA biblioteket til at klone de industrielt relevante gener MgUGD og MgUXS.Gelbilledet identificerer også UDP-glucuronsyre og UDP-xylose genereret af enzymatisk virkning af den successivt udtrykte og rensede MgUGD og MgUXS. Denne metode kræver ikke et perfekt match mellem referencesekvensen og de opnåede markørsekvenser og bør give forskeren tillid til at arbejde med ureferenceerede østers. I princippet kan denne metode anvendes på enhver biologisk prøve, der ikke er afspejlet, og for hvilken sekvenser fra en nært beslægtet referenceart er offentligt tilgængelige.Denne metode gør det muligt for ikke-sagkyndige forskere let at få adgang til genetisk materiale af potentiel biologisk betydning og baner vejen for, at flere forskere kan arbejde med let tilgængelige, men ufuldstændigt identificerede biologiske prøver.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Syntetisk edderkoppespind Produktionen på laboratorieskala

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Design af et Bio-responsiv Robot fra DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

En forbedret metode til forberedelse af type I kollagen fra hud

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddobbeltlaget Vesikel Generation Brug Mikrofluid højtryksspuler

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generation af en tre-dimensionel fuld tykkelse Skin Equivalent og Automated Anskydning

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Kvalitativ Karakterisering af den vandige fraktion fra Hydrotermisk fortætning af alger ved hjælp af 2D gaskromatografi med Time-of-flight massespektrometri

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

En Microcontroller drives enhed for Generation af flydende ekstrakter fra konventionelle cigaret røg og elektronisk cigaret Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalerbar generation af modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Produktion af membranfiltrerede faseskiftdecafluorobutan nanodråber fra præformede mikrobubbles

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Generering af en forenklet tredimensionel skin-on-a-chip-model i en mikromaskiner med mikrofluidisk platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...