Name: a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters
Uploaded: 2019-06-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

Dit werk werd deels gesteund door de Natural Science Foundation van China (Grant nummers 31471703, A0201300537 en 31671854 tot J.V. en ll, grantnummer 31470435 tot G.Y.) en het 100 buitenlands talenten plan (subsidie nummer JSB2014012 aan J.V.).

Opmerking: een schematisch overzicht wordt weergegeven in afbeelding 1.
1. monsterverzameling
<ol><li>Verkrijgen van oester preparaten. Houd oesters op ijs tijdens de Pluk periode, het transport en voorafgaand aan het laboratoriumgebruik en het proces binnen 4-7 dagen na aankoop. Opmerking: voor dit protocol werden oesters gekocht van Zhong Cai Wholesale Market in Nanjing (afkomstig uit Ningde, Fujian, China en Lianyungang, Jiangsu, China), Haijie Aquatic pro...

<ol>
	<li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+a+DNA+taxonomy.">The promise of a DNA taxonomy.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).</li><li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+identification+of+dried+shellfish+(oyster,+clam+and+mussel)+products+sold+on+the+Chinese+market.">Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market.</a> Food Control. 90, 199-204 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+cob+and+cox1+genes+and+editing+of+the+corresponding+mRNAs+in+Dinophysis+acuminata+from+Narragansett+Bay,+with+special+reference+to+the+phylogenetic+position+of+the+genus+Dinophysis.">Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).</li><li>Sell, J., Spirkovski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+differentiation+between+two+forms+of+trout+Salmo+letnica,+endemic+to+the+Balkan+Lake+Ohrid,+reflects+their+reproductive+isolation.">Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation.</a> Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).</li><li>Karadjian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+rearranged+mitochondrial+genome+in+Nycteria+parasites+(Haemosporidia)+from+bats.">Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).</li><li>Morga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+from+flat+oyster+Ostrea+edulis+as+suitable+housekeeping+genes+for+quantitative+real+time+PCR.">Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR.</a> Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).</li><li>Delsuc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+systematics+of+armadillos+(Xenarthra,+Dasypodidae):+contribution+of+maximum+likelihood+and+Bayesian+analyses+of+mitochondrial+and+nuclear+genes.">Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+UDP-Glucose+Dehydrogenase+from+Akkermansia+muciniphila.">Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).</li><li>Gu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+the+UDP-Xylose+Biosynthesis+Pathway+in+Sphaerobacter+thermophilus.">Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).</li><li>Duan, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+UDP-xylose+biosynthesis+pathway+in+Rhodothermus+marinus.">Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li><li>Song, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-glucose+4-epimerase+and+&#946;-1,4-galactosyltransferase+from+the+oyster+Magallana+gigas+as+valuable+biocatalysts+for+the+production+of+galactosylated+products.">UDP-glucose 4-epimerase and &#946;-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).</li><li>Gainey, P. A., Phelps, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uridine+diphosphate+glucuronic+acid+production+and+utilization+in+various+tissues+actively+synthesizing+glycosaminoglycans.">Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans.</a> Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).</li></ol>

Het gepresenteerde protocol maakt de genetische identificatie mogelijk van niet-gerefereerde oester specimens met soortgelijk fenotype van regionale vismarkten door vergelijking van de COX1-en ND-genen met een publiekelijk beschikbare oester-DNA-genoom-database. Het belang van deze methode ligt in zijn eenvoud, omdat er slechts één PCR-reactie nodig is voor de evaluatie van de virtuele cDNA-Bibliotheek. De twee geconjugeerde mitochondriale COX1 en ND-genen werden versterkt uit een cDNA-bibliotheek die werd gegenereerd ...

De overname van biologisch materiaal waarnaar wordt verwezen, kan een uitdaging zijn als gevolg van lange levertijden, ondernemende redenering of landspecifieke douanevoorschriften. Als alternatief kan het vereiste biologisch materiaal ook worden opgevangen uit fenotypisch identieke specimens. Deze monsters kunnen echter aanzienlijk variëren op het niveau van genotype, en daarom worden vergelijkingen met digitaal opgeslagen referentie-genoom van dezelfde soort vaak moeilijk of zelfs nutteloos als gevolg van onverenigbaarheid van het nieuw geproduceerde materiaal met bestaande DNA-versterkings methoden. Sequentiëren van sterk gecondengeerde genen van individuele monsters is een veelgebruikte en krachtige tool voor het identificeren van soorten1, zoals gecondengeerde mitochondriale genen die vaak worden gebruikt als referentie genen voor de kwaliteitsbeoordeling van cDNA-bibliotheken2 ,3,4,5,6. De achterliggende gedachte voor de hierin gepresenteerde methode is dat een hoog behoud van mitochondriale gensequenties in individuele anonieme oester monsters ten opzichte van de corresponderende sequenties van het referentie genoom aangeeft dat andere genen ook een lage mate van divergentie, gezien de over het algemeen snellere snelheid van mitochondriale DNA-evolutie ten opzichte van nucleair DNA7, waardoor de versterking en isolatie van een breed scala aan wetenschappelijk en industrieel relevante genen door simpelweg het gebruik van openbare beschikbare sequentiegegevens als referentie.
Het algemene doel van de hierin beschreven methode is het presenteren van een geoptimaliseerde workflow voor het genereren van een vrijwel geordend Oyster cDNA-bibliotheek die kan worden gebruikt als template-DNA voor het klonen van oester genen. In virtuele sequentiëren wordt de Novo genoome-sequencing omzeild; in plaats daarvan wordt een bekende, digitaal opgeslagen referentie sequentie direct gebruikt om primers te gebruiken of te ontwerpen voor de productie van Cdna's die uiteindelijk een bibliotheek zullen omvatten (of worden toegevoegd aan een reeds bestaande). Het doel is om een convergente cDNA-Bibliotheek te produceren, wat betekent dat overeenkomsten tussen de gegenereerde cDNA-sequenties en de referentie volgorde kunnen worden gerangschikt van laag naar hoog divergentie. Een belangrijk voordeel van het gebruik van cytochroom C oxidase subeenheid 1 (COX1) en NADH dehydrogenase (ND) als referentie-genen is dat zelfs zeer geografisch nieuwe oester specimens kunnen worden geprofileerd als gevolg van het hoge behoud van deze mitochondriale genen. Nadat we de aanpak met deze gevestigde markers hebben bewezen, tonen we vervolgens de toepassing ervan aan twee enzym kandidaten die betrokken zijn bij de biosynthese van suiker nucleotide en die van industrieel belang kunnen zijn8,9, 10. het biotechnologische potentieel van de Pacifische oester is nog niet verkend. Daarom zijn wij van mening dat deze convergerende methode voor de voorbereiding van een virtueel gesequentieerde cDNA-Bibliotheek ook geschikt zal zijn voor niet-gespecialiseerde onderzoekers die cDNA van dit relevante biologische materiaal willen genereren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Chemicals:</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1% Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>490-79-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose for molecular biology</td>
			<td>Biowest Chemicals</td>
			<td>111860</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicilin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Lingfeng, Shanghai</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanidinium thiocyanate-phenol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td>Nanjing Chemical Reagent</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10855021</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">NAD+</td>
			<td>Duly Biotech</td>
			<td>53-84-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenyl-methylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UDP-glucose</td>
			<td>Wuhu Nuowei Chemicals</td>
			<td>28053-08-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UDP-glucuronic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>63700-19-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tools/Instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MALDI-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Autoflex</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal block heater</td>
			<td>Long Yang Scientific Instruments</td>
			<td>Thermoshaker HB20</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermocycler</td>
			<td>Hema</td>
			<td>9600</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Enzyme and Kits:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10&#215;Ligation buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B69</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5&#215;PrimeSTAR buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9158A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alkaline phosphatase</td>
			<td>ThermoFisher FastAP</td>
			<td>EF0654</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTTGACCAAAAACATAAGACATG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cutsmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dNTP mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cleanup Kit</td>
			<td>AxyGen</td>
			<td>AP-PCR-250</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET-30a(+) vector</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>69909</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters

De toegang tot biologisch materiaal van referentie soorten, die voorheen werden gebruikt in belangrijke experimenten zoals bij de ontwikkeling van nieuwe cellijnen of genoom volgorde projecten, zijn vaak moeilijk te voorzien voor verdere studies of derden als gevolg van de het verbruik van de monsters. Hoewel de individuele Pacifische oester specimens nu op grote schaal over de Pacifische kusten van Azië, Australië en Noord-Amerika verdeeld zijn, zijn ze genetisch vrij divers en daarom niet direct geschikt als uitgangsmateriaal voor genbibliotheken. In dit artikel demonstreren we het gebruik van niet-gerefereerde Pacifische oester specimens verkregen van regionale vismarkten om cDNA-bibliotheken te genereren. Deze bibliotheken werden vervolgens vergeleken met het publiek beschikbare oester genoom, en de dichtstbijzijnde gerelateerde bibliotheek werd geselecteerd met behulp van de mitochondriale referentie genen cytochroom C oxidase subeenheid I (COX1) en NADH dehydrogenase (ND). De geschiktheid van de gegenereerde cDNA-Bibliotheek wordt ook aangetoond door het klonen en de expressie van twee genen die de enzymen UDP-glucuronic acid dehydrogenase (UGD) coderen en UDP-xylose synthase (UXS), die verantwoordelijk zijn voor de biosynthese van UDP-xylose van UDP-glucose.

Figuur 1 toont een schematisch overzicht van de beschreven bereidingswijze van de convergente cDNA Library, afgeleid van Pacific Oyster individuen. Figuur 2 toont de sequenties van de COX1 en ND genen van een verre verwant oester specimen met een hoge divergentie van de COX1 en ND gen sequenties van het referentiemateriaal. Figuur 3 toont de sequenties van de COX1 en ND genen van een nauw verwant oester specimen met een geringe dive...

Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

We beschrijven een strategie voor het gebruik van RNA-monsters van niet-gerefereerde Pacifische oester specimens en evalueren het genetische materiaal in vergelijking met openbaar beschikbare genoom gegevens om een virtueel gesequentieerde cDNA-Bibliotheek te genereren.

Een convergerende strategie voor het genereren van een virtueel Gesequentieerde cDNA-Bibliotheek van niet-gerefereerde Pacifische oesters

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

De belangrijkste vraag die we met deze methode willen beantwoorden, is hoe we RNA-monsters van materiaal dat op lokale voedselmarkten is gekocht, kunnen gebruiken voor het klonen van biotechnologisch relevante genen? Hier gebruiken we Pacific oesters als een case study voor het aantonen van deze aanpak en mogelijke verdere toepassing. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat conventionele genoom- of cDNA-sequencing van de oestermonsters kan worden omzeild.In plaats daarvan werden sequenties van de cytochrome c oxidase subunit I en NADH dehydrogenase vergeleken met openbaar beschikbare referentiesequenties van de Pacifische oester om het meest verwante exemplaar te selecteren. De cDNA die uit dit monster wordt bereid, kan direct worden gebruikt voor het klonen van biotechnologisch relevante genen, die kunnen worden geselecteerd aan de hand van de openbare sequentie-informatie. Het aantonen van de procedure zal Yongmei Lyu en Yuquan Li, twee afgestudeerde studenten van de Glycomics en Glycan Bioengineering Research Center aan de Nanjing Agricultural University.Om oesterweefsel monster voor te bereiden, gebruik maken van een gesteriliseerde scalpel uit te snijden ongeveer 100 milligram homogeen zacht weefsel uit de geschatte geometrische centrum van elke oester monster. Breng het monster over in een mortel gevuld met 50 milliliter vloeibare stikstof. Maal het flash-bevroren oesterweefsel tot een fijn poeder.Weeg 75 milligram bevroren weefsel van elk monster af in een steriele centrifugebuis van 1,5 milliliter en meng met één milliliter guanidinium thiocyanaat-fenol extractiereegmiddel. De meest kritieke stap van deze procedure is de RNA-extractiestap. Om RNA-afbraak te minimaliseren, is het essentieel om de tijd tussen het oogsten van het oesterweefsel en de RNA-extractie te verminderen.Centrifugeren het monster op 14, 000 keer g en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,5-milliliter centrifuge buis, voeg 200 microliter chloroform, en meng grondig op een vortex mixer gedurende 10 tot 15 seconden totdat het mengsel wordt melkachtig wit. Vervolgens centrifuge gedurende 15 minuten zoals eerder gedaan.Breng met een pipet van 200 microliter de bovenste waterige laag, zonder de interfase te verstoren, voorzichtig over in een nieuwe 1,5-milliliter centrifugebuis. Voeg 500 microliter isopropylalcohol toe aan de centrifugebuis en draai zachtjes om de monsters te mengen. Laat de monsters dan 20 minuten op ijs staan.Centrifuge op 14,000 keer g en vier graden Celsius gedurende acht minuten, en verwijder de supernatant. Resuspend de pellet in een milliliter van 75%ethanol, en centrifuge op 14,000 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder alle supernatant, en herhaal de was in ethanol.Droog de pellets zes minuten op kamertemperatuur. Los vervolgens de gedroogde RNA-pellet op in 25 microliters met DEPC-behandeld water en houd de buis op ijs. Gebruik de RNA-monsters binnen 24 uur.Om een cDNA-bibliotheek te genereren, moet u eerst een reactiemengsel voor elk RNA-monster bereiden in een PCR-buis met 300 microliter door oplossingen toe te voegen volgens het manuscript. Voeg een microliter van het geëxtraheerde RNA-monster in de buis. Incubeer het mengsel in een PCR thermocycler gedurende 60 minuten bij 42 graden Celsius, en verhoog de temperatuur vervolgens tot 95 graden Celsius gedurende vijf minuten.Bewaar de gegenereerde cDNA-bibliotheek tot 12 maanden bij min 20 graden Celsius. Voeg eerst een microliter van de gegenereerde cDNA-bibliotheek toe aan buizen met PCR-mengsels, bereid volgens het manuscript. Plaats de PCR-buizen in de PCR-thermocycler en voer de PCR-versterking uit met een eerste denaturatiestap en 35 PCR-reactiecycli bestaande uit een annealing-stap, een verlengingsstap en een denaturatiestap volgens het manuscript.Voer na de cycli een laatste rekstap uit gedurende vijf minuten. Gebruik vijf microliters van het PCR-product om de kwaliteit te controleren door agarose gel elektroforese. Observeer het versterkte COX1- of ND-gen als één band op respectievelijk 759 of 748 basisparen.Om de rest van het PCR-product te zuiveren, voegt u 100 microliter DNA-bindende buffer toe met hoge concentraties chaotropische zouten aan elk monster. Vortex kort om de inhoud te mengen. Plaats een zuiveringskolom in een twee-milliliter centrifugebuis.Pipette het reactiemengsel in de kolom. Plaats de buis met de gemonteerde kolom in een centrifuge op 14,000 keer g gedurende een minuut bij kamertemperatuur. Na het weggooien van het filtraat uit de twee-milliliter centrifuge buis, was twee keer met 700 en 400 microliter wasoplossing W2 door centrifugeren op 14.000 keer g.Verwarm vervolgens een milliliter gedeïniseerd water tot 65 graden Celsius in een metalen blokverwarming. Breng de kolom in een nieuwe 1,5-milliliter centrifugebuis en pipet 25 microliter van het voorverwarmde gedeïmiseerde water naar het midden van het witte kolommembraan. Laat het membraan een minuut weken bij kamertemperatuur.Vercentrifugeren vervolgens de buis met de kolom op 14.000 keer g gedurende een minuut bij kamertemperatuur. Gooi de kolom weg en bewaar het gezuiverde PCR-product voor maximaal 12 maanden bij min 20 graden Celsius. Optioneel kunnen de COX1- of ND-reverse primers ook worden gebruikt voor bidirectionele sequencing.Gebruik voor Sanger sequencing de relevante COX1 of ND forward primer. Na het ophalen van de sequencing resultaten, vergelijk de sequenties met de genoom sequentie van de Pacific oyster referentie stam met behulp van de NCBI Nucleotide BLAST online tool. Gebruik respectievelijke voorwaartse en omgekeerde primers van MgUGD- en MgUXS-genen om door PCR te versterken en te zuiveren zoals eerder gedaan.Na het uitbroeden van gezuiverde PCR-producten met spijsverteringsbuffer, bereid de voorverteerde pET-30a vector door het oplossen van 500 nanogram pET-30a in een 1,5-milliliter centrifuge buis, en voeg gedeïmiseerd water aan de top tot 16 microliter. Voeg vervolgens twee microliters van 10-keer geconcentreerde spijsverteringsbuffer en één microliter elk van de 20 eenheden beperking endonucleases Nde1 en Xho1 in de buis. Broed het mengsel drie uur lang uit op 37 graden Celsius.Voeg daarna een microliter van een-eenheid alkalische fosforschisede toe en incubeer een uur lang bij 37 graden Celsius. Plaats vervolgens de buis in een voorverwarmde metalen blokverwarming op 75 graden Celsius gedurende 10 minuten om de alkalische fosforfosfatase te activeren. Na het kweken van E.coli BL21 cellen met de MgUGD en MgUXS genen, breng de cultuur in 400-milliliter LB medium in een twee-liter schudden kolf, en plaats het op een shaker bij 200 rpm bij een temperatuur van 37 graden Celsius.Controleer na drie uur de optische dichtheid op een fotometer op een golflengte van 600 nanometer en zorg ervoor dat deze een absorptie van ongeveer 0,5 bereikt. Verlaag vervolgens de shakertemperatuur tot 20 graden Celsius. Voeg 400 microliter van een molaire IPTG toe om de expressie van de recombinante eiwitten gedurende drie uur te induceren.Na het oogsten van de cellen, verstoren de cellen door sonicatie gedurende 20 minuten op vier graden Celsius. Centrifuge op 14,000 keer g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten, en het verzamelen van de supernatant in een nieuwe buis voor de activiteit test. Na de activiteitstest, blus de reacties door 20 microliter methanol en 40 microliter van chloroform toe te voegen aan de MgUXS- en MgUGD-mengsels.Vortex de mengsels van het monster, en centrifugeren op 14,000 keer g gedurende zes minuten en vier graden Celsius. Verzamel de bovenste waterige laag van elke buis in nieuwe buizen voor MALDI-TOF massaspectrometrie. In dit experiment werden sequentieuitlijning van de COX1- en ND-gensequenties van een zeer uiteenlopende specimen vergeleken met de referentie-Pacifische oestersoort.De rode pijlen tonen nucleotideverschillen tussen de referentiesequentie en de volgorde van de verkregen cDNA-monsters. De sequenties van de COX1- en ND-genen van een nauw verwant oesterexemplaar vertonen een lage divergentie van de referentie-Pacifische oestersoort. MALDI-TOF massaspectrometrie toont een succesvolle toepassing van de cDNA-bibliotheek om de industrieel relevante genen MgUGD en MgUXS te klonen.Het gelbeeld identificeert ook UDP-glucuronic zuur en UDP-xylose gegenereerd door de enzymatische werking van de achtereenvolgend uitgedrukte en gezuiverde MgUGD en MgUXS. Deze methode vereist geen perfecte match tussen de referentiesequentie en de verkregen markersequenties en moet de onderzoeker het vertrouwen geven om met niet-gereferenced oesters te werken. In principe kan deze methode worden toegepast op elk niet-gerefereerd biologisch monster waarvoor sequenties van een nauw verwante referentiesoort openbaar beschikbaar zijn.Deze methode stelt niet-deskundige onderzoekers in staat om gemakkelijk toegang te krijgen tot genetisch materiaal van potentieel biologisch belang en maakt de weg vrij voor meer wetenschappers om te werken met gemakkelijk toegankelijke maar onvolledig geïdentificeerde biologische monsters.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Synthetische Spider Silk Production op laboratoriumschaal

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Het ontwerpen van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Een verbeterde werkwijze voor de bereiding van type I collageen van de huid

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Kwalitatieve Karakterisering van de waterfractie van hydrothermale liquefactie van algen gebruiken 2D gaschromatografie met Time-of-flight massaspectrometrie

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Een Microcontroller beheerd apparaat voor de generatie van vloeibare extracten van conventionele sigaret rook en elektronische sigaret Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Schaalbare generatie van volwassen cerebellar organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen en karakterisering door immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Productie van membraangefilterde faseverschuivingsdecafluorbutaan nanodruppels uit voorgevormde microbubbels

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Generatie van een vereenvoudigd driedimensionaal huid-op-een-chip-model in een microgemachineerd microfluïdisch platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...