Name: a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters
Uploaded: 2019-06-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת בחלקו של הקרן המדע הטבעי של סין (להעניק מספרים 31471703, A0201300537 ו 31671854 ל J.V. ו זמנהוף, גרנט מספר 31470435 G.Y.), ואת תוכנית כשרונות זרים 100 (מענק מספר JSB2014012 ל J.V.).

הערה: מבט סכימטי מוצג באיור 1.
1. אוסף דוגמאות
<ol><li>. השיגו דגימות צדפה שמרו צדפות על הקרח במהלך התקופה החקלאית, ההובלה ולפני השימוש במעבדה והתהליך בתוך 4-7 ימים לאחר הרכישה. הערה: עבור פרוטוקול זה, צדפות נרכשו מהשוק הסיטונאי Zhong Cai לנאנג (שמקורם בנינגנדה, פוג'יי...

<ol>
	<li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+a+DNA+taxonomy.">The promise of a DNA taxonomy.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).</li><li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+identification+of+dried+shellfish+(oyster,+clam+and+mussel)+products+sold+on+the+Chinese+market.">Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market.</a> Food Control. 90, 199-204 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+cob+and+cox1+genes+and+editing+of+the+corresponding+mRNAs+in+Dinophysis+acuminata+from+Narragansett+Bay,+with+special+reference+to+the+phylogenetic+position+of+the+genus+Dinophysis.">Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).</li><li>Sell, J., Spirkovski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+differentiation+between+two+forms+of+trout+Salmo+letnica,+endemic+to+the+Balkan+Lake+Ohrid,+reflects+their+reproductive+isolation.">Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation.</a> Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).</li><li>Karadjian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+rearranged+mitochondrial+genome+in+Nycteria+parasites+(Haemosporidia)+from+bats.">Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).</li><li>Morga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+from+flat+oyster+Ostrea+edulis+as+suitable+housekeeping+genes+for+quantitative+real+time+PCR.">Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR.</a> Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).</li><li>Delsuc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+systematics+of+armadillos+(Xenarthra,+Dasypodidae):+contribution+of+maximum+likelihood+and+Bayesian+analyses+of+mitochondrial+and+nuclear+genes.">Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+UDP-Glucose+Dehydrogenase+from+Akkermansia+muciniphila.">Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).</li><li>Gu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+the+UDP-Xylose+Biosynthesis+Pathway+in+Sphaerobacter+thermophilus.">Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).</li><li>Duan, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+UDP-xylose+biosynthesis+pathway+in+Rhodothermus+marinus.">Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li><li>Song, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-glucose+4-epimerase+and+&#946;-1,4-galactosyltransferase+from+the+oyster+Magallana+gigas+as+valuable+biocatalysts+for+the+production+of+galactosylated+products.">UDP-glucose 4-epimerase and &#946;-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).</li><li>Gainey, P. A., Phelps, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uridine+diphosphate+glucuronic+acid+production+and+utilization+in+various+tissues+actively+synthesizing+glycosaminoglycans.">Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans.</a> Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).</li></ol>

הפרוטוקול המוצג מאפשר זיהוי גנטי של דגימות צדפה ללא הפניה עם פנוטיפ דומה משוקי פירות ים אזוריים על ידי השוואה של הגנים COX1 ו-ND עם מאגר הגנום ה-DNA צדפה זמין בפומבי. המשמעות של שיטה זו טמונה בפשטותו, כמו רק תגובת PCR אחת נדרשת להערכת הספרייה cDNA וירטואלי. שני COX1 מיטוכונדריאלי שמרו וגנים ND הוהוגדל ?...

הקניית החומר הביולוגי שניתן לטפל בהן, עלולה להיות מאתגרת עקב זמני משלוחים ארוכים, הסקת מסקנות יזמות או תקנות מכס ספציפיות למדינה. כחלופה, החומר הביולוגי הנדרש ניתן גם לאיסוף מדגימות זהות בדרך כלל. עם זאת, דוגמאות אלה עשויות להשתנות באופן משמעותי ברמת ה-גנוטיפ, ולכן השוואות בעלות התייחסות דיגיטלית מאוחסנת מאותו מינים מעובדים לעתים קרובות קשות או אפילו חסרות תועלת עקב אי התאמה של החומר החדש ממקור עם שיטות הגברה קיימות של הדנ א. רצף הגנים שנשמרים במיוחד של דגימות בודדות הוא כלי נפוץ ורב עוצמה לזיהוי מינים1, כגון גנים מיטוכונדריאלי שימור המשמשים לעתים קרובות גנים התייחסות להערכת איכות של ספריות cdna2 ,3,4,5,6 הרציונל הבסיסי של שיטה זו הציגה הוא כי שימור גבוה של רצפי גנים מיטוכונדריאלי בדגימות הצדפה אנונימי בודדים לעומת רצפים המקביל של הגנום התייחסות מעיד כי גנים אחרים עשויים גם להראות רמה נמוכה של סטייה, בהינתן שיעור מהיר בדרך כלל של האבולוציה מיטוכונדריאלי ביחס ל-DNA גרעיני7, המאפשר הגברה ובידוד של מגוון רחב של גנים רלוונטיים מדעית ותעשייתית על ידי שימוש בפומבי נתוני רצף נתונים זמינים כהפניה.
המטרה הכוללת של השיטה המתוארת היא להציג זרימת עבודה ממוטבת ליצירת הצדפה כמעט רציף cDNA הספרייה אשר ניתן להשתמש בה כמו DNA תבנית עבור שיבוט של גנים צדפה. ברצף וירטואלי, רצף הגנום דה נובו הוא שפרקו; במקום זאת, משתמשים ברצף הפניה מוכר ומאוחסן באופן דיגיטלי כדי לנצל או לעצב צבעי יסוד לייצור cDNAs שבסופו של דבר מהווים ספריה (או יתווספו לקיים מראש). המטרה היא לייצר ספריית cDNA מתכנסת, כלומר דמיון בין רצפי ה-Dna שנוצרו ואת רצף ההתייחסות יכול להיות מדורגת מפני התפצלות נמוך עד גבוה. יתרון מרכזי של שימוש בציטוכרום C אוקסידאז משנה 1 (COX1) ו NADH Dehydrogenase (ND) כמו גנים התייחסות היא כי אפילו מאוד גיאוגרפית ופרד דגימות הצדפות ניתן לפרופיל בשל שימור גבוה של גנים אלה מיטוכונדריאלי. לאחר הוכיחה את הגישה עם סמנים אלה מבוססים, אנו לאחר מכן להדגים את היישום שלה לשני מועמדים אנזימים אשר מעורבים בביוסינתזה נוקלאוטיד סוכר ועשויים להיות בעלי רלוונטיות תעשייתית8,9, 10. הפוטנציאל הביוטכנולוגי של הצדפה באוקיינוס השקט עדיין לא נחקר. לפיכך, אנו מאמינים כי שיטה מתכנס זו להכנת ספריית cDNA כמעט ברצף יהיה גם מתאים לחוקרים שאינם מומחים המעוניינים ליצור cDNA מחומר זה ביולוגי רלוונטי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Chemicals:</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1% Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>490-79-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose for molecular biology</td>
			<td>Biowest Chemicals</td>
			<td>111860</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicilin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Lingfeng, Shanghai</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanidinium thiocyanate-phenol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td>Nanjing Chemical Reagent</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10855021</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">NAD+</td>
			<td>Duly Biotech</td>
			<td>53-84-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenyl-methylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UDP-glucose</td>
			<td>Wuhu Nuowei Chemicals</td>
			<td>28053-08-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UDP-glucuronic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>63700-19-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tools/Instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MALDI-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Autoflex</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal block heater</td>
			<td>Long Yang Scientific Instruments</td>
			<td>Thermoshaker HB20</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermocycler</td>
			<td>Hema</td>
			<td>9600</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Enzyme and Kits:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10&#215;Ligation buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B69</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5&#215;PrimeSTAR buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9158A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alkaline phosphatase</td>
			<td>ThermoFisher FastAP</td>
			<td>EF0654</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTTGACCAAAAACATAAGACATG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cutsmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dNTP mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cleanup Kit</td>
			<td>AxyGen</td>
			<td>AP-PCR-250</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET-30a(+) vector</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>69909</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters

הגישה לחומר ביולוגי של מינים התייחסות, אשר שימשו בעבר ניסויים מרכזיים כגון בפיתוח של קווי התא הרומן או פרויקטים ברצף הגנום, הם לעתים קרובות קשה לספק למחקרים נוספים או צדדים שלישיים בשל ה consumptive הטבע של הדגימות. למרות שעכשיו נרחב מופץ על חופי האוקיאנוס השקט של אסיה, אוסטרליה וצפון אמריקה, בודדים האוקיינוס השקט דגימות מגוונות מבחינה גנטית ולכן הם לא מתאימים ישירות כמו חומר מתחיל עבור ספריות גנים. במאמר זה, אנו מדגימים את השימוש בדגימות של צדפות האוקיינוס השקט שהתקבלו משוקי פירות ים אזוריים כדי ליצור ספריות cDNA. ספריות אלו הושוו לגנום הצדפות הזמין בציבור, והספרייה הקרובה ביותר נבחרה באמצעות התייחסות מיטוכונדריאלי גנים ציטוכרום C אוקסידאז I (COX1) ו-NADH דהידרוגנאז (ND). ההתאמה של הספרייה cdna שנוצר מומחש גם על ידי שיבוט וביטוי של שני גנים קידוד האנזימים של החומצה udp גלוקוראז (אויח) ו-udp-xylose אבד סטנדרטים (uxs), אשר אחראים על הביוסינתזה של udp-קסיפסיד מ UDP-גלוקוז.

איור 1 מציג סקירה סכמטית של שיטת ההכנה המתוארת של ספריית cdna המתכנסת הנגזרת מאנשי הצדפות באוקיינוס השקט. איור 2 מראה את רצפי הגנים COX1 ו-ND של דגימה ממרחק הקשורים הצדפה עם התפצלות גבוהה מתוך COX1 ו nd רצפי גנים של חומר הייחוס. איור 3 מראה את רצפי הגני...

Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

אנו מתארים אסטרטגיה כיצד להשתמש בדגימות RNA מתוך דגימות הצדפה הפסיפיק, ולהעריך את החומר הגנטי על ידי השוואה עם נתוני הגנום זמין בפומבי כדי ליצור ספריית cDNA כמעט רציף.

אסטרטגיה מתכנס לדור של ספריית דנ א בלתי מופנה מצדפות פסיפיק

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

שאלת המפתח שאנו רוצים להתייחס אליה בשיטה זו היא כיצד נוכל להשתמש בדגימות RNA מחומר שנרכש בשוקי מזון מקומיים לשיבוט גנים רלוונטיים ביוטכנולוגיה? כאן, אנו משתמשים צדפות האוקיינוס השקט כמקרה מבחן להדגמת גישה זו ויישום נוסף פוטנציאלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי גנום קונבנציונלי או רצף cDNA של דגימות צדפות ניתן לעקוף.במקום זאת, רצפים של ציטוכרום c אוקסידאז subunit אני NADH דהידרוגנאז הושוו עם רצפי התייחסות זמינים לציבור מן הצדפה האוקיינוס השקט כדי לבחור את הדגימה הקשורה ביותר. ה- cDNA שהוכן מדגימה זו יכול לשמש ישירות לשיבוט של גנים רלוונטיים ביוטכנולוגיה, אשר ניתן לבחור באמצעות מידע הרצף הציבורי. הדגמת ההליך יהיו יונגמיי ליו ויוקוואן לי, שני סטודנטים לתארים מתקדמים מהמרכז לחקר הגליקומיקה והביו-הנדסה הגליקנית באוניברסיטה החקלאית של נאנג'ינג.כדי להכין דגימת רקמת צדפה, השתמש אזמל מעוקר לחתוך כ 100 מיליגרם של רקמה רכה הומוגנית מהמרכז הגיאומטרי המשוער של כל דגימת צדפה. מעבירים את הדגימה למרגמה מלאה ב-50 מיליליטר של חנקן נוזלי. טוחנים את רקמת הצדפה הקפואה לאבקה דקה.שוקלים 75 מיליגרם של הרקמה הקפואה של כל דגימה לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר, ומערבבים עם מיליליטר אחד של ריאגנט מיצוי גואנידיניום תיוצ'יאנט-פנול. השלב הקריטי ביותר של הליך זה הוא שלב החילוץ RNA. על מנת למזער השפלה RNA, זה חיוני כדי להפחית את הזמן בין קצירת רקמת הצדפה ואת מיצוי RNA.צנטריפוגה המדגם ב 14, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מעבירים את העל-טבעי לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של כלורופורם ומערבבים היטב על מערבל מערבולת במשך 10 עד 15 שניות עד שהתערובת הופכת ללבנה חלבית. לאחר מכן, צנטריפוגה במשך 15 דקות כפי שנעשה בעבר.עם פיפט 200 מיקרוליטר, בזהירות להעביר את השכבה המים העליונה, מבלי להפריע interphase, לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר חדש. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של אלכוהול isopropyl לתוך צינור צנטריפוגה, ולהפוך בעדינות כדי לערבב את הדגימות. ואז להשאיר את הדגימות על קרח במשך 20 דקות.צנטריפוגה ב 14, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך שמונה דקות, ולהסיר את supernatant. תן את הכדור במיליליטר אחד של 75%אתנול, וצנטריפוגה ב 14, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את כל העל-טבעי, וחזור על הכביסה באתנול.יבש את כדורי במשך שש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ממיסים את גלולת ה-RNA המיובשת ב-25 מיקרוליטרים של מים שטופלו ב-DEPC, ומרחיקים את הצינור על הקרח. השתמש בדגימות ה-RNA תוך 24 שעות.כדי ליצור ספריית cDNA, תחילה להכין תערובת תגובה עבור כל דגימת RNA בצינור PCR 300 מיקרוליטר על ידי הוספת פתרונות על פי כתב היד. הוסף מיקרוליטר אחד של דגימת RNA שחולצו לתוך הצינור. הדגירה את התערובת בתרמוצ'ילי PCR במשך 60 דקות ב 42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להגדיל את הטמפרטורה ל 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.אחסן את ספריית cDNA שנוצרה עד 12 חודשים במינוס 20 מעלות צלזיוס. ראשית, להוסיף מיקרוליטר אחד של ספריית cDNA שנוצר צינורות המכילים תערובות PCR, מוכן על פי כתב היד. מקם את צינורות PCR לתוך התרמוצ'ילר PCR, ולבצע את הגברה PCR עם שלב denaturation הראשונית 35 מחזורי תגובה PCR המורכב שלב חישול, צעד התארכות, צעד denaturation על פי כתב היד.לאחר המחזורים, לבצע צעד אחד סיום התארכות במשך חמש דקות. השתמש בחמישה מיקרוליטרים של מוצר PCR כדי לאמת את האיכות על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose. שימו לב לגן COX1 או ND המוגבר כרצועה אחת ב-759 או 748 זוגות בסיסים, בהתאמה.כדי לטהר את שאר המוצר PCR, להוסיף 100 microliters של מאגר מחייב DNA המכיל ריכוזים גבוהים של מלחים chaotropic לכל מדגם. מערבולת בקצרה כדי לערבב את התוכן. מניחים עמוד טיהור לתוך צינור צנטריפוגה שני מיליליטר.פיפטה תערובת התגובה לתוך הטור. מניחים את הצינור עם העמוד רכוב בצנטריפוגה ב 14, 000 פעמים גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסינון מצינור הצנטריפוגה שני מיליליטר, לשטוף פעמיים עם 700 ו 400 microliters של פתרון כביסה W2 על ידי צנטריפוגה ב 14, 000 פעמים גרם.לאחר מכן, מחממים מיליליטר אחד של מים deionized ל 65 מעלות צלזיוס בתנור בלוק מתכת. העבר את העמודה לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר, ולצינור פיפטה 25 מיקרוליטר של המים שחומם מראש למרכז קרום העמוד הלבן. תן את הממברנה להשרות במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור עם העמוד ב 14, 000 פעמים גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. יש להשליך את העמודה ולאחסן את מוצר ה-PCR המטוהר למשך עד 12 חודשים במינוס 20 מעלות צלזיוס. באופן אופציונלי, ניתן להשתמש בפרימרים ההפוכים COX1 או ND גם עבור רצף דו-כיווני.עבור רצף סנגר, השתמש ב- COX1 או ב- ND קדימה הרלוונטי. לאחר אחזור תוצאות הרצף, השווה את הרצפים עם רצף הגנום של זן הייחוס של צדפות האוקיינוס השקט באמצעות הכלי המקוון NCBI Nucleotide BLAST. השתמשו בפרימרים קדמיים והפוךים בהתאמה של גנים MgUGD ו-MgUXS כדי להגביר ולטהר על ידי PCR כפי שנעשה בעבר.לאחר הדגירה מוצרי PCR מטוהרים עם חיץ עיכול, להכין את וקטור pET-30a predigested על ידי המסת 500 ננוגרם של pET-30a בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר, ולהוסיף מים deionized למעלה עד 16 microliters. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של מאגר עיכול מרוכז פי 10 ומיקרוליטר אחד לכל אחד מ-20 היחידות המצילות אנדונוקלאס Nde1 ו-Xho1 לתוך הצינור. להחגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות.לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של פוספטאז אלקליין יחידה אחת, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך שעה נוספת. לאחר מכן, מניחים את הצינור בתנור בלוק מתכת שחומם מראש ב 75 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להשבית את הפוספטזה אלקליין. לאחר טיפוח תאי E.coli BL21 הנושאים את הגנים MgUGD ו- MgUXS, מעבירים את התרבות למדיום LB של 400 מיליליטר בבקבוק רועד של שני ליטרים, ומ מניחים אותו על שייקר במהירות של 200 סל"ד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר שלוש שעות, לבדוק את הצפיפות האופטית על פוטומטר באורך גל של 600 ננומטר, ולוודא שהוא מגיע לספיגה של כ 0.5. לאחר מכן להפחית את טמפרטורת השייקר ל 20 מעלות צלזיוס. הוסף 400 microliters של IPTG טוחן אחד כדי לגרום לביטוי של חלבונים רקומביננטי במשך שלוש שעות.לאחר קצירת התאים, לשבש את התאים על ידי sonication במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 14, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, ולאסוף את supernatant בצינור חדש לבדיקת הפעילות. לאחר בדיקה פעילות, להרווה את התגובות על ידי הוספת 20 microliters של מתנול ו 40 microliters של כלורופורם לתערובות MgUXS ו MgUGD.מערבולת תערובות מדגם, וצנטריפוגה ב 14, 000 פעמים גרם במשך שש דקות וארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את השכבה הממימייה העליונה של כל צינור בצינורות חדשים עבור ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF. בניסוי זה, יישור רצף של רצפי הגנים COX1 ו- ND של דגימה מפוצלת מאוד הושוו עם זן הצדפות הפסיפי התייחסות.החצים האדומים מראים הבדלי נוקלאוטיד בין רצף ההתייחסות לבין רצף דגימות cDNA שהתקבלו. הרצפים של הגנים COX1 ו- ND של דגימת צדפות קשורה קשר הדוק מראים סטייה נמוכה מזן הצדפות הפסיפי התייחסות. ספקטרומטריית המסה MALDI-TOF מציגה יישום מוצלח של ספריית cDNA לשיבוט הגנים הרלוונטיים לתעשייה MgUGD ו- MgUXS.תמונת הג'ל מזהה גם חומצה UDP-glucuronic ו UDP-xylose שנוצר על ידי הפעולה אנזימטית של MgUGD ומטוהרים ברציפות MgUGD ו MgUXS. שיטה זו אינה דורשת התאמה מושלמת בין רצף הייחוס לבין רצפי הסמן המתקבלים ואותה לתת לחוקר ביטחון לעבוד עם צדפות לא קשורות. באופן עקרוני, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מדגם ביולוגי שלא הותר עבורו רצפים ממין ייחוס קרוב זמינים לציבור.שיטה זו מאפשרת לחוקרים שאינם מומחים לגשת בקלות לחומר גנטי בעל חשיבות ביולוגית פוטנציאלית וסוללת את הדרך עבור מדענים נוספים לעבוד עם דגימות ביולוגיות נגישות אך מזוהות באופן לא שלם.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

ייצור סינתטי קורי עכביש בקנה מידה מעבדה

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

עיצוב רובוט ביו תגובה מ-DNA אוריגמי

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

שיטה משופרת להכנת סוג I קולגן מעור

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

אפיון איכותי של השבר מימית מ הידרותרמיות עיבוי של אצות באמצעות גז כרומטוגרפיה 2D עם זמן של הטיסה ספקטרומטריית מסה

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

מיקרו-בקר המופעל התקן לדור של נוזלי תמציות קונבנציונאלי סיגריה סיגריה עשן ואלקטרוניקה תרסיס

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

ייצור של ננו-טיפות דקפלואורובוטן מסוננות פאמברנה ממיקרו-טבלים מעוצבים מראש

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...