Name: a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters
Uploaded: 2019-06-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 31471703, A0201300537 e 31671854 a J.V. e L.L., numero di sovvenzione 31470435 a G.Y.), e il 100 Foreign Talents Plan (numero di sovvenzione JSB2014012 a J.V.).

NOTA: nella Figura 1è illustrata una panoramica schematica.
1. Raccolta di campioni
<ol><li>Ottenere campioni di ostriche. Conservare le ostriche sul ghiaccio durante il periodo post-raccolta, il trasporto e prima dell'uso in laboratorio e il processo entro 4-7 giorni dall'acquisto. NOTA: Per questo protocollo, le ostriche sono state acquistate dal mercato all'ingrosso di Nanchino (originario di Ningde, Fujian, Cina e Lianyungang, Jiangsu, Cina), Haijie Aqua...

<ol>
	<li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+a+DNA+taxonomy.">The promise of a DNA taxonomy.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).</li><li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+identification+of+dried+shellfish+(oyster,+clam+and+mussel)+products+sold+on+the+Chinese+market.">Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market.</a> Food Control. 90, 199-204 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+cob+and+cox1+genes+and+editing+of+the+corresponding+mRNAs+in+Dinophysis+acuminata+from+Narragansett+Bay,+with+special+reference+to+the+phylogenetic+position+of+the+genus+Dinophysis.">Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).</li><li>Sell, J., Spirkovski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+differentiation+between+two+forms+of+trout+Salmo+letnica,+endemic+to+the+Balkan+Lake+Ohrid,+reflects+their+reproductive+isolation.">Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation.</a> Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).</li><li>Karadjian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+rearranged+mitochondrial+genome+in+Nycteria+parasites+(Haemosporidia)+from+bats.">Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).</li><li>Morga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+from+flat+oyster+Ostrea+edulis+as+suitable+housekeeping+genes+for+quantitative+real+time+PCR.">Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR.</a> Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).</li><li>Delsuc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+systematics+of+armadillos+(Xenarthra,+Dasypodidae):+contribution+of+maximum+likelihood+and+Bayesian+analyses+of+mitochondrial+and+nuclear+genes.">Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+UDP-Glucose+Dehydrogenase+from+Akkermansia+muciniphila.">Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).</li><li>Gu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+the+UDP-Xylose+Biosynthesis+Pathway+in+Sphaerobacter+thermophilus.">Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).</li><li>Duan, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+UDP-xylose+biosynthesis+pathway+in+Rhodothermus+marinus.">Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li><li>Song, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-glucose+4-epimerase+and+&#946;-1,4-galactosyltransferase+from+the+oyster+Magallana+gigas+as+valuable+biocatalysts+for+the+production+of+galactosylated+products.">UDP-glucose 4-epimerase and &#946;-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).</li><li>Gainey, P. A., Phelps, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uridine+diphosphate+glucuronic+acid+production+and+utilization+in+various+tissues+actively+synthesizing+glycosaminoglycans.">Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans.</a> Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).</li></ol>

Il protocollo presentato consente l'identificazione genetica di campioni di ostriche senza riferimenti con fenotipo simile provenienti dai mercati ittici regionali confrontando i geni COX1 e ND con un database del genoma del DNA delle ostriche disponibile al pubblico. Il significato di questo metodo sta nella sua semplicità, in quanto è necessaria una sola reazione PCR per la valutazione della libreria cDNA virtuale. I due geni coX1 e ND mitocondriali conservati sono stati amplificati da una libreria cDNA che è stata ...

L'acquisizione di materiale biologico di riferimento per la vita può essere difficile a causa dei lunghi tempi di consegna, del ragionamento imprenditoriale o delle norme doganali specifiche per paese. In alternativa, il materiale biologico richiesto può essere raccolto anche da campioni fenotipicamente identici. Tuttavia, questi campioni possono variare in modo significativo a livello del genotipo, e quindi i confronti con genomi di riferimento memorizzati digitalmente della stessa specie sono spesso resi difficili o addirittura inutili a causa dell'incompatibilità del materiale appena ricavato con metodi di amplificazione del DNA esistenti. Il sequenziamento dei geni altamente conservati di singoli campioni è uno strumento ampiamente utilizzato e potente per identificare le specie1, come i geni mitocondriali conservati che vengono spesso utilizzati come geni di riferimento per la valutazione della qualità delle librerie cDNA2 ,3,4,5,6. La logica alla base del metodo qui presentato è che l'alta conservazione delle sequenze geniche mitocondriali nei singoli campioni anonimi di ostriche rispetto alle corrispondenti sequenze del genoma di riferimento indica che altri geni possono anche basso livello di divergenza, dato il tasso generalmente più veloce di evoluzione del DNA mitocondriale rispetto al DNA nucleare7, consentendo l'amplificazione e l'isolamento di un'ampia gamma di geni scientificamente e industrialmente rilevanti semplicemente utilizzando semplicemente pubblicamente dati di sequenziamento disponibili come riferimento.
L'obiettivo generale del metodo qui descritto è quello di presentare un flusso di lavoro ottimizzato per generare una libreria cDNA di ostriche virtualmente sequenziata che può essere utilizzata come DNA modello per la clonazione dei geni delle ostriche. Nel sequenziamento virtuale, il sequenziamento del genoma de novo è elusivo; invece, una sequenza di riferimento nota, memorizzata digitalmente viene utilizzata direttamente per utilizzare o progettare primer per la produzione di cDNA che alla fine comprenderanno una libreria (o essere aggiunti a uno preesistente). L'obiettivo è quello di produrre una libreria cDNA convergente, il che significa che le somiglianze tra le sequenze cDNA generate e la sequenza di riferimento possono essere classificate da bassa ad alta divergenza. Un vantaggio chiave dell'uso della sottounità 1 (COX1) e della dehydrogenassi NADH (ND) del citocro c' come geni di riferimento è che anche gli esemplari di ostriche altamente geograficamente disgiunti possono essere profilati a causa dell'elevata conservazione di questi geni mitocondriali. Dopo aver dimostrato l'approccio con questi marcatori ben consolidati, dimostriamo quindi la sua applicazione a due candidati enzimatici che sono coinvolti nella biosintesi dei nucleotidi zuccherini e possono essere di rilevanza industriale8,9, 10. Il potenziale biotecnologico dell'ostrica del Pacifico è ancora inesplorato. Pertanto, riteniamo che questo metodo convergente per la preparazione di una libreria cDNA virtualmente in sequenza sarà appropriato anche per i ricercatori non specializzati che vogliono generare cDNA da questo materiale biologico pertinente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Chemicals:</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1% Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>490-79-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose for molecular biology</td>
			<td>Biowest Chemicals</td>
			<td>111860</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicilin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Lingfeng, Shanghai</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanidinium thiocyanate-phenol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td>Nanjing Chemical Reagent</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10855021</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">NAD+</td>
			<td>Duly Biotech</td>
			<td>53-84-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenyl-methylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UDP-glucose</td>
			<td>Wuhu Nuowei Chemicals</td>
			<td>28053-08-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UDP-glucuronic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>63700-19-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tools/Instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MALDI-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Autoflex</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal block heater</td>
			<td>Long Yang Scientific Instruments</td>
			<td>Thermoshaker HB20</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermocycler</td>
			<td>Hema</td>
			<td>9600</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Enzyme and Kits:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10&#215;Ligation buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B69</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5&#215;PrimeSTAR buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9158A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alkaline phosphatase</td>
			<td>ThermoFisher FastAP</td>
			<td>EF0654</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTTGACCAAAAACATAAGACATG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cutsmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dNTP mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cleanup Kit</td>
			<td>AxyGen</td>
			<td>AP-PCR-250</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET-30a(+) vector</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>69909</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters

L'accesso al materiale biologico delle specie di riferimento, che sono stati utilizzati in precedenza in esperimenti chiave come lo sviluppo di nuove linee cellulari o progetti di sequenziamento del genoma, sono spesso difficili da fornire per ulteriori studi o terzi a causa della natura consumiva dei campioni. Anche se ora ampiamente distribuiti sulle coste del Pacifico in Asia, Australia e Nord America, i singoli esemplari di ostriche del Pacifico sono geneticamente molto diversi e quindi non sono direttamente adatti come materiale di partenza per le librerie genetiche. In questo articolo, dimostriamo l'uso di campioni di ostriche del Pacifico senza riferimenti ottenuti dai mercati ittici regionali per generare librerie di cDNA. Queste librerie sono state poi confrontate con il genoma delle ostriche pubblicamente disponibili, e la libreria correlata più vicina è stata selezionata utilizzando i geni di riferimento mitocondriali Cytochrome C Oxidase I (COX1) e NADH Dehydrogenase (ND). L'idoneità della libreria cDNA generata è dimostrata anche dalla clonazione e dall'espressione di due geni che codificano gli enzimi UDP-glucuronic acid dehydrogenase (UGD) e UDP-xylose synthase (UXS), che sono responsabili della biosintesi di UDP-xylose da UDP-glucosio.

La figura 1 mostra una panoramica schematica del metodo di preparazione descritto della libreria cDNA convergente derivata da individui di ostriche del Pacifico. La figura 2 mostra le sequenze dei geni COX1 e ND di un campione di ostriche distante correlato con elevata divergenza dalle sequenze geniche COX1 e ND del materiale di riferimento. La figura 3 mostra le sequenze dei geni COX1 e ND di un campione di ostrica strettamente cor...

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A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

Descriviamo una strategia su come usare campioni di RNA da campioni di ostriche del Pacifico senza riferimenti e valutiamo il materiale genetico confrontandosi con i dati del genoma pubblicamente disponibili per generare una libreria cDNA virtualmente sequenziata.

Una strategia convergente per la generazione di una libreria cDNA virtualmente in sequenza da ostriche del Pacifico senza riferimenti

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

La domanda chiave che vogliamo affrontare con questo metodo è come possiamo utilizzare campioni di RNA di materiale acquistato nei mercati alimentari locali per la clonazione di geni biotecnologicamente rilevanti? Qui, usiamo le ostriche del Pacifico come caso di studio per dimostrare questo approccio e potenziale ulteriore applicazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il sequenziamento convenzionale del genoma o del cDNA dei campioni di ostriche può essere aggirato.Invece, le sequenze della subunità citocroma c ossidasi I e NADH deidrogenasi sono state confrontate con sequenze di riferimento pubblicamente disponibili dall'ostrica del Pacifico per selezionare l'esemplare più strettamente correlato. Il cDNA preparato da questo campione può essere utilizzato direttamente per la clonazione di geni biotecnologicamente rilevanti, che possono essere selezionati utilizzando le informazioni sulla sequenza pubblica. A dimostrare la procedura saranno Yongmei Lyu e Yuquan Li, due studenti laureati del Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center dell'Università Agraria di Nanchino.Per preparare il campione di tessuto ostriche, utilizzare un bisturi sterilizzato per tagliare circa 100 milligrammi di tessuto molle omogeneo dal centro geometrico approssimativo di ogni esemplare di ostrica. Trasferire il campione in una malta riempita con 50 millilitri di azoto liquido. Macinare il tessuto di ostriche congelato in una polvere fine.Pesare 75 milligrammi del tessuto congelato di ogni campione in un tubo di centrifuga sterile da 1,5 millilitri e mescolare con un millilitro di reagente di estrazione del tiocianato-fenolo di guanidinio. Il passaggio più critico di questa procedura è la fase di estrazione dell'RNA. Al fine di ridurre al minimo la degradazione dell'RNA, è essenziale ridurre il tempo tra la raccolta del tessuto ostriche e l'estrazione dell'RNA.Centrifugare il campione a 14.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri, aggiungere 200 microlitri di cloroformio e mescolare accuratamente su un miscelatore a vortice per 10-15 secondi fino a quando la miscela diventa bianco latteo. Quindi, centrifuga per 15 minuti come fatto in precedenza.Con una pipetta da 200 microlitri, trasferire con cura lo strato acquoso superiore, senza disturbare l'interfase, in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di alcol isopropile nel tubo di centrifuga e invertire delicatamente per mescolare i campioni. Quindi lasciare i campioni sul ghiaccio per 20 minuti.Centrifugare a 14.000 volte g e quattro gradi Celsius per otto minuti, e rimuovere il supernatante. Resostigliere il pellet in un millilitro di 75% di etanolo e centrifugare a 14.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere tutto il supernatante e ripetere il lavaggio in etanolo.Asciugare i pellet per sei minuti a temperatura ambiente. Quindi, sciogliere il pellet di RNA essiccato in 25 microlitri di acqua trattata con DEPC e tenere il tubo sul ghiaccio. Utilizzare i campioni di RNA entro 24 ore.Per generare una libreria cDNA, preparare prima una miscela di reazione per ogni campione di RNA in un tubo PCR da 300 microliter aggiungendo soluzioni secondo il manoscritto. Aggiungere un microlitro del campione di RNA estratto nel tubo. Incubare la miscela in un termociclometro PCR per 60 minuti a 42 gradi Celsius, quindi aumentare la temperatura a 95 gradi Celsius per cinque minuti.Archiviare la libreria cDNA generata per un massimo di 12 mesi a meno 20 gradi Celsius. In primo luogo, aggiungere un microliter della libreria cDNA generata ai tubi contenenti miscele PCR, preparati secondo il manoscritto. Posizionare i tubi PCR nel termociclometro PCR ed eseguire l'amplificazione PCR con una fase di denaturazione iniziale e 35 cicli di reazione PCR costituiti da un passo di ricottura, una fase di allungamento e una fase di denaturazione secondo il manoscritto.Dopo i cicli, eseguire una fase di allungamento finalizzante per cinque minuti. Utilizzare cinque microlitri del prodotto PCR per verificare la qualità mediante elettroforesi a gel di agarosio. Osservate il gene AMPLIFICAto COX1 o ND come una singola banda rispettivamente a 759 o 748 coppie di basi.Per purificare il resto del prodotto PCR, aggiungere 100 microlitri di tampone legante il DNA contenenti alte concentrazioni di sali chaotropici a ciascun campione. Vortice brevemente per mescolare il contenuto. Posizionare una colonna di purificazione in un tubo di centrifuga a due millilitri.Pipettare la miscela di reazione nella colonna. Posizionare il tubo con la colonna montata in una centrifuga a 14.000 volte g per un minuto a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il filtrato dal tubo di centrifuga a due millilitri, lavare due volte con 700 e 400 microlitri di soluzione di lavaggio W2 centrifugando a 14.000 volte g.Quindi, riscaldare un millilitro di acqua deionizzata a 65 gradi Celsius in un riscaldatore a blocchi metallici. Trasferire la colonna in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e pipettare 25 microlitri dell'acqua deionizzata preriscaldata al centro della membrana della colonna bianca. Lasciare immergere la membrana per un minuto a temperatura ambiente.Quindi, centrifugare il tubo con la colonna a 14.000 volte g per un minuto a temperatura ambiente. Scartare la colonna e conservare il prodotto PCR purificato per un massimo di 12 mesi a meno 20 gradi Celsius. Opzionalmente, i primer inversi COX1 o ND possono essere utilizzati anche per il sequenziamento bidirezionale.Per il sequenziamento Sanger, utilizzare il relativo primer in avanti COX1 o ND. Dopo aver recuperato i risultati del sequenziamento, confrontare le sequenze con la sequenza genomica del ceppo di riferimento delle ostriche del Pacifico utilizzando lo strumento online NCBI Nucleotide BLAST. Utilizzare i rispettivi primer avanti e indietro dei geni MgUGD e MgUXS per amplificare e purificare dalla PCR come fatto in precedenza.Dopo aver incubato prodotti PCR purificati con tampone di digestione, preparare il vettore pET-30a predigerito sciogliendo 500 nanogrammi di pET-30a in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere acqua deionizzata per ricaricare fino a 16 microlitri. Quindi, aggiungere due microlitri di tampone di digestione 10 volte concentrato e un microliter ciascuno delle 20 unità di restrizione endonucleasi Nde1 e Xho1 nel tubo. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per tre ore.Successivamente, aggiungere un microlitro di fosfatasi alcalina di un'unità e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora aggiuntiva. Quindi, posizionare il tubo in un riscaldatore a blocchi metallici preriscaldato a 75 gradi Celsius per 10 minuti per inattivare la fosfatasi alcalina. Dopo aver coltivato cellule E.coli BL21 con i geni MgUGD e MgUXS, trasferire la coltura in mezzo LB da 400 millilitri in un pallone tremante da due litri e posizionarla su uno shaker a 200 giri/min a una temperatura di 37 gradi Celsius.Dopo tre ore, controllare la densità ottica su un fotometro ad una lunghezza d'onda di 600 nanometri e assicurarsi che raggiunga un assorbimento di circa 0,5. Quindi ridurre la temperatura dello shaker a 20 gradi Celsius. Aggiungere 400 microlitri di IPTG un molare per indurre l'espressione delle proteine ricombinanti per tre ore.Dopo aver raccolto le cellule, interrompere le cellule per sonicazione per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Centrifugare a 14.000 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti e raccogliere il supernatante in un nuovo tubo per il test di attività. Dopo il test di attività, dissetare le reazioni aggiungendo 20 microlitri di metanolo e 40 microlitri di cloroformio alle miscele MgUXS e MgUGD.Vortice le miscele campione, e centrifuga a 14.000 volte g per sei minuti e quattro gradi Celsius. Raccogliere lo strato acquoso superiore di ogni tubo in nuovi tubi per la spettrometria di massa MALDI-TOF. In questo esperimento, l'allineamento delle sequenze geniche COX1 e ND di un campione altamente divergente è stato confrontato con il ceppo di ostriche del Pacifico di riferimento.Le frecce rosse mostrano differenze nucleotidiche tra la sequenza di riferimento e la sequenza dei campioni di cDNA ottenuti. Le sequenze dei geni COX1 e ND di un campione di ostriche strettamente correlato mostrano una bassa divergenza rispetto al ceppo di ostriche del Pacifico di riferimento. La spettrometria di massa MALDI-TOF mostra un'applicazione riuscita della libreria cDNA per clonare i geni rilevanti dal punto di vista industriale MgUGD e MgUXS.L'immagine gel identifica anche l'acido UDP-glucuronico e l'UDP-xilosio generati dall'azione enzimatica dell'MgUGD e mgUXS successivamente espressi e purificati. Questo metodo non richiede una corrispondenza perfetta tra la sequenza di riferimento e le sequenze di marcatori ottenute e dovrebbe dare al ricercatore fiducia nel lavorare con ostriche senza riferimenti. In linea di principio, questo metodo può essere applicato a qualsiasi campione biologico senza riferimenti per il quale sono pubblicamente disponibili sequenze di una specie di riferimento strettamente correlata.Questo metodo consente ai ricercatori non esperti di accedere facilmente a materiale genetico di potenziale importanza biologica e apre la strada a un maggior numero di scienziati per lavorare con campioni biologici facilmente accessibili ma identificati in modo incompleto.

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