Name: a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters
Uploaded: 2019-06-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet delvis av Natural Science Foundation i Kina (gi tall 31471703, A0201300537 og 31671854 til J.V. og ll, gi nummer 31470435 til G.Y.), og den 100 Foreign talenter plan (Grant nummer JSB2014012 til J.V.).

Merk: en skjematisk oversikt er vist i figur 1.
1. samling av eksempler
<ol><li>Skaff østers prøver. Hold østers på isen i kombinasjonen perioden, transport og før laboratoriebruk og prosess innen 4-7 dager etter kjøpet. Merk: for denne protokollen, ble østers kjøpt fra Zhong Cai Wholesale Market i Nanjing (stammer fra Ningde, Fujian, Kina og Lianyungang, Jiangsu, Kina), Haijie Aquatic Product Company i Qingdao (kommer fra Qingdao, Shandong, Kina), Ju...

<ol>
	<li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+a+DNA+taxonomy.">The promise of a DNA taxonomy.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).</li><li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+identification+of+dried+shellfish+(oyster,+clam+and+mussel)+products+sold+on+the+Chinese+market.">Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market.</a> Food Control. 90, 199-204 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+cob+and+cox1+genes+and+editing+of+the+corresponding+mRNAs+in+Dinophysis+acuminata+from+Narragansett+Bay,+with+special+reference+to+the+phylogenetic+position+of+the+genus+Dinophysis.">Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).</li><li>Sell, J., Spirkovski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+differentiation+between+two+forms+of+trout+Salmo+letnica,+endemic+to+the+Balkan+Lake+Ohrid,+reflects+their+reproductive+isolation.">Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation.</a> Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).</li><li>Karadjian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+rearranged+mitochondrial+genome+in+Nycteria+parasites+(Haemosporidia)+from+bats.">Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).</li><li>Morga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+from+flat+oyster+Ostrea+edulis+as+suitable+housekeeping+genes+for+quantitative+real+time+PCR.">Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR.</a> Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).</li><li>Delsuc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+systematics+of+armadillos+(Xenarthra,+Dasypodidae):+contribution+of+maximum+likelihood+and+Bayesian+analyses+of+mitochondrial+and+nuclear+genes.">Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+UDP-Glucose+Dehydrogenase+from+Akkermansia+muciniphila.">Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).</li><li>Gu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+the+UDP-Xylose+Biosynthesis+Pathway+in+Sphaerobacter+thermophilus.">Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).</li><li>Duan, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+UDP-xylose+biosynthesis+pathway+in+Rhodothermus+marinus.">Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li><li>Song, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-glucose+4-epimerase+and+&#946;-1,4-galactosyltransferase+from+the+oyster+Magallana+gigas+as+valuable+biocatalysts+for+the+production+of+galactosylated+products.">UDP-glucose 4-epimerase and &#946;-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).</li><li>Gainey, P. A., Phelps, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uridine+diphosphate+glucuronic+acid+production+and+utilization+in+various+tissues+actively+synthesizing+glycosaminoglycans.">Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans.</a> Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).</li></ol>

Det forevist protokollen innrømmer det genetisk legitimasjonen av ubrukte østers prøver med lignende fenotype fra område Seafood marked av sammenligningen av det COX1 og ND gener med en offentlig anvendelig østers DNA Genova data bank. Betydningen av denne metoden ligger i sin enkelhet, som bare en enkelt PCR reaksjon er nødvendig for evalueringen av den virtuelle cDNA biblioteket. De to bevarte mitokondrie COX1 og ND gener ble forsterket fra en cDNA bibliotek som ble generert av omvendt transkripsjon av RNA ekstra...

Oppkjøpet av levende refererte biologisk materiale kan være utfordrende på grunn av lange leveringstider, entreprenør resonnement, eller landsspesifikke tollregler. Som et alternativ kan det nødvendige biologiske materialet også samles inn fra phenotypically identiske prøver. Imidlertid kan disse prøvene variere betydelig på nivået av genotype, og derfor sammenligninger med digitalt lagrede referanse genomer av samme art er ofte gjengitt vanskelig eller fåfengt på grunn av inkompatibilitet av den nylig Hentet materiale med eksisterende metoder for DNA-forsterkning. Sekvensering svært bevarte gener av individuelle prøver er en mye brukt og kraftig verktøy for å identifisere arter1, for eksempel bevarte mitokondrie gener som ofte brukes som referanse gener for kvalitetsvurdering av cDNA biblioteker2 ,3,4,5,6. Den underliggende begrunnelsen for heri presentert metoden er at høy bevaring av mitokondrie gen sekvenser i enkelte anonyme østers prøver i forhold til tilsvarende sekvenser av referansen Genova indikerer at andre gener kan også vise en lavt nivå av avvik, gitt den generelt raskere rate av mitokondrie DNA evolusjon i forhold til kjernefysisk DNA7, slik at forsterkning og isolering av et bredt spekter av vitenskapelig og industrielt relevante gener ved å bruke offentlig tilgjengelige sekvensering-data som en referanse.
Det overordnede målet for det her er beskrevet metoden er å presentere en optimalisert arbeidsflyt for å generere en tilnærmet sekvensert østers cDNA bibliotek som kan brukes som mal DNA for kloning av østers gener. I virtuelle sekvensering, de Novo Genova sekvensering er omgås; stedet, en kjent, digitalt lagret referanse sekvens brukes direkte til å utnytte eller design primere for produksjon av cDNAs som til slutt vil utgjøre et bibliotek (eller legges til en eksisterende en). Målet er å produsere et konvergent cDNA-bibliotek, som betyr at likheter mellom de genererte cDNA-sekvensene og referanse sekvensen kan rangeres fra lav til høy avvik. En viktig fordel ved å bruke Cytokrom C oksidase delenhet 1 (COX1) og NADH dehydrogenase (ND) som referanse gener er at selv svært geografisk endemisk østers prøver kan bli profilert på grunn av den høye bevaring av disse mitokondrie gener. Etter å ha bevist tilnærming med disse veletablerte markører, vi da demonstrere sin søknad til to enzym kandidater som er involvert i sukker nukleotid biosyntesen og kan være av industriell relevans8,9, 10. The bioteknologisk potensialet i Stillehavet østers er fortsatt uutforsket. Derfor tror vi at dette sammenfallende metode for å utarbeide et tilnærmet sekvensielt cDNA biblioteket vil også være hensiktsmessig for ikke-spesialiserte forskere som ønsker å generere cDNA fra denne relevante biologiske materialet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Chemicals:</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1% Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>490-79-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose for molecular biology</td>
			<td>Biowest Chemicals</td>
			<td>111860</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicilin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Lingfeng, Shanghai</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanidinium thiocyanate-phenol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td>Nanjing Chemical Reagent</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10855021</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">NAD+</td>
			<td>Duly Biotech</td>
			<td>53-84-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenyl-methylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UDP-glucose</td>
			<td>Wuhu Nuowei Chemicals</td>
			<td>28053-08-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UDP-glucuronic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>63700-19-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tools/Instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MALDI-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Autoflex</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal block heater</td>
			<td>Long Yang Scientific Instruments</td>
			<td>Thermoshaker HB20</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermocycler</td>
			<td>Hema</td>
			<td>9600</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Enzyme and Kits:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10&#215;Ligation buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B69</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5&#215;PrimeSTAR buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9158A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alkaline phosphatase</td>
			<td>ThermoFisher FastAP</td>
			<td>EF0654</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTTGACCAAAAACATAAGACATG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cutsmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dNTP mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cleanup Kit</td>
			<td>AxyGen</td>
			<td>AP-PCR-250</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET-30a(+) vector</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>69909</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters

Tilgangen til biologisk materiale av referanse arter, som ble brukt tidligere i viktige eksperimenter som i utviklingen av romanen cellelinjer eller Genova sekvensering prosjekter, er ofte vanskelig å sørge for videre studier eller tredjeparter på grunn av consumptive natur. Selv nå vidt distribuert over Stillehavet kysten av Asia, Australia og Nord-Amerika, individuelle Stillehavet østers prøver er genetisk ganske mangfoldig, og er derfor ikke direkte egnet som utgangspunkt materiale for gen biblioteker. I denne artikkelen viser vi bruken av ubrukte Pacific østers prøver Hentet fra regionale sjømatmarkeder å generere cDNA biblioteker. Disse bibliotekene ble deretter sammenlignet med offentlig tilgjengelige østers Genova, og den nærmeste relaterte biblioteket ble valgt ved hjelp av mitokondrie referanse gener Cytokrom C oksidase delenhet I (COX1) og NADH dehydrogenase (ND). Egnetheten av den genererte cDNA biblioteket er også demonstrert ved kloning og uttrykk for to gener koding av enzymer UDP-glucuronic acid dehydrogenase (UGD) og UDP-xylose syntase (UXS), som er ansvarlig for biosyntesen av UDP-xylose fra UDP-glukose.

Figur 1 viser en skjematisk oversikt over de beskrevne forberedelse metoden for konvergent cDNA biblioteket avledet fra Stillehavet østers individer. Figur 2 viser SEKVENSER av COX1 og nd gener av en fjernt relatert østers prøve med høy avvik fra COX1 og nd gen sekvenser av referansematerialet. Figur 3 viser SEKVENSER av COX1 og nd gener av et nært beslektet østers prøve med lav avvik fra COX1 og nd gen sekvenser av referanse...

Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

Vi beskriver en strategi for hvordan du bruker RNA prøver fra ubrukte Pacific østers prøver, og evaluere genetisk materiale ved sammenligning med offentlig tilgjengelige Genova data for å generere et tilnærmet sekvensielt cDNA bibliotek.

En sammenfallende strategi for generering av en nesten sekvensielt cDNA bibliotek fra ubrukte Pacific østers

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

Det sentrale spørsmålet vi ønsker å ta opp med denne metoden er hvordan kan vi bruke RNA-prøver fra materiale kjøpt på lokale matmarkeder for kloning av bioteknologisk relevante gener? Her bruker vi Stillehavsøsters som en case-studie for å demonstrere denne tilnærmingen og potensiell videre anvendelse. Den største fordelen med denne teknikken er at konvensjonell genom eller cDNA sekvensering av østersprøvene kan omgås.I stedet ble sekvenser av cytokrom c oksidaseunderenhet I og NADH dehydrogenase sammenlignet med offentlig tilgjengelige referansesekvenser fra Stillehavsøstersen for å velge den mest nært beslektede prøven. CDNA utarbeidet fra denne prøven kan brukes direkte til kloning av bioteknologisk relevante gener, som kan velges ved hjelp av offentlig sekvensinformasjon. Demonstrere prosedyren vil være Yongmei Lyu og Yuquan Li, to graduate studenter fra Glycomics og Glycan Bioengineering Research Center ved Nanjing Agricultural University.For å forberede østers vev prøve, bruk en sterilisert skalpell for å kutte ut ca 100 milligram homogent bløtvev fra omtrentlig geometrisk sentrum av hver østers prøve. Overfør prøven til en mørtel fylt med 50 milliliter flytende nitrogen. Grind det flashfrosne østersvevet til et fint pulver.Vei ut 75 milligram av hver prøves frosne vev i et sterilt 1,5-milliliter sentrifugerør, og bland med en milliliter guanidinium tiocyanat-fenol ekstraksjon reagens. Det mest kritiske trinnet i denne prosedyren er RNA-ekstraksjonstrinnet. For å minimere RNA-nedbrytning er det viktig å redusere tiden mellom høsting av østersvevet og RNA-ekstraksjonen.Sentrifuger prøven på 14 000 ganger g og fire grader Celsius i 15 minutter. Overfør supernatanten til et nytt 1,5-milliliter sentrifugerør, tilsett 200 mikroliter kloroform, og bland godt på en vortex mikser i 10 til 15 sekunder til blandingen blir melkehvit. Deretter sentrifuge i 15 minutter som gjort tidligere.Med en 200-mikroliter pipette, overfør forsiktig det øvre vandige laget, uten å forstyrre interfasen, til et nytt 1,5-milliliter sentrifugerør. Tilsett 500 mikroliter isopropylalkohol i sentrifugerøret, og inverter forsiktig for å blande prøvene. La deretter prøvene stå på is i 20 minutter.Sentrifuge på 14, 000 ganger g og fire grader Celsius i åtte minutter, og fjern supernatant. Resuspend pellet i en milliliter på 75% etanol, og sentrifuge på 14, 000 ganger g og fire grader Celsius i fem minutter. Fjern alle de overnaturlige, og gjenta vasken i etanol.Tørk pellets i seks minutter ved romtemperatur. Oppløs deretter den tørkede RNA pellet i 25 mikroliter dePC-behandlet vann, og hold røret på is. Bruk RNA-prøvene innen 24 timer.For å generere et cDNA-bibliotek, må du først lage en reaksjonsblanding for hver RNA-prøve i et 300 mikroliter PCR-rør ved å legge til løsninger i henhold til manuskriptet. Tilsett en mikroliter av den ekstraherte RNA-prøven i røret. Inkuber blandingen i en PCR termocycler i 60 minutter ved 42 grader Celsius, og øk deretter temperaturen til 95 grader Celsius i fem minutter.Lagre det genererte cDNA-biblioteket i opptil 12 måneder ved minus 20 grader Celsius. Først legger du til en mikroliter av det genererte cDNA-biblioteket til rør som inneholder PCR-blandinger, tilberedt i henhold til manuskriptet. Plasser PCR-rørene i PCR termocycler, og utfør PCR-forsterkningen med et innledende denaturation trinn og 35 PCR reaksjonssykluser bestående av et glødende trinn, et forlengelsestrinn og et denmetningstrinn i henhold til manuskriptet.Etter syklusene utfører du ett sluttførende forlengelsestrinn i fem minutter. Bruk fem mikroliter av PCR-produktet for å verifisere kvaliteten ved agarose gel elektroforese. Vær oppmerksom på det forsterkede COX1- eller ND-genet som et enkelt bånd på henholdsvis 759 eller 748 basispar.For å rense resten av PCR-produktet, tilsett 100 mikroliter DNA-bindende buffer som inneholder høye konsentrasjoner av chaotropiske salter til hver prøve. Vortex kort for å blande innholdet. Plasser en rensekolonne i et to milliliter sentrifugerør.Pipette reaksjonsblandingen inn i kolonnen. Plasser røret med den monterte søylen i en sentrifuge ved 14 000 ganger g i ett minutt ved romtemperatur. Etter å ha kastet filtratet fra det to milliliter sentrifugerøret, vask to ganger med 700 og 400 mikroliter vaskeoppløsning W2 ved sentrifugering ved 14.000 ganger g.Deretter varme en milliliter av deionisert vann til 65 grader Celsius i en metallblokk varmeapparat. Overfør kolonnen til et nytt 1,5-milliliter sentrifugerør, og pipette 25 mikroliter av det forvarmede deioniserte vannet til midten av den hvite kolonnemembranen. La membranen suge i ett minutt ved romtemperatur.Deretter sentrifuger røret med kolonnen på 14 000 ganger g i ett minutt ved romtemperatur. Kast kolonnen, og lagre det rensede PCR-produktet i opptil 12 måneder ved minus 20 grader Celsius. Eventuelt kan COX1 eller ND omvendt primere også brukes til toveis sekvensering.For Sanger sekvensering, bruk den aktuelle COX1 eller ND fremover primer. Etter å ha hentet sekvenseringsresultatene, sammenligner du sekvensene med genomsekvensen av Pacific oyster referansestamme ved hjelp av NCBI Nucleotide BLAST online-verktøyet. Bruk henholdsvis fremre og motsatte primere av MgUGD- og MgUXS-gener for å forsterke og rense med PCR som gjort tidligere.Etter inkubering renset PCR produkter med fordøyelsen buffer, forberede predigested pET-30a vektor ved å oppløse 500 nanogram pET-30a i en 1,5-milliliter sentrifuge rør, og tilsett deionisert vann for å fylle opp til 16 mikroliter. Deretter legger du til to mikroliter med 10 ganger konsentrert fordøyelsesbuffer og en mikroliter hver av de 20 enhetene begrensning endonucleases Nde1 og Xho1 inn i røret. Inkuber blandingen ved 37 grader Celsius i tre timer.Deretter legger du til en mikroliter av en-enhet alkalisk fosfatase, og inkuber ved 37 grader Celsius i en ekstra time. Deretter plasserer du røret i en forvarmet metallblokkvarmer ved 75 grader Celsius i 10 minutter for å inaktivere alkalisk fosfatase. Etter å ha dyrket E.coli BL21-celler som bærer MgUGD- og MgUXS-genene, overfører du kulturen til 400 ml LB-medium i en to-liters ristekolbe, og plasserer den på en shaker ved 200 o/min ved en temperatur på 37 grader Celsius.Etter tre timer kontrollerer du den optiske tettheten på et fotometer ved en bølgelengde på 600 nanometer, og kontroller at den når en absorpsjon på ca. 0,5. Reduser deretter ristetemperaturen til 20 grader Celsius. Tilsett 400 mikroliter av en-molar IPTG for å indusere uttrykket av rekombinante proteiner i tre timer.Etter høsting av cellene, forstyrre cellene ved sonikering i 20 minutter ved fire grader Celsius. Sentrifuge på 14, 000 ganger g og fire grader Celsius i 20 minutter, og samle supernatant i et nytt rør for aktivitetstesten. Etter aktivitetsanalysen slukker du reaksjonene ved å tilsette 20 mikroliter metanol og 40 mikroliter kloroform til MgUXS- og MgUGD-blandingene.Vortex prøveblandingene, og sentrifuge på 14 000 ganger g i seks minutter og fire grader Celsius. Samle det øvre vandige laget av hvert rør i nye rør for MALDI-TOF massespektrometri. I dette eksperimentet ble sekvensjustering av COX1- og ND-gensekvensene til en svært divergerende prøve sammenlignet med referansen Pacific oyster stamme.De røde pilene viser nukleotidforskjeller mellom referansesekvensen og sekvensen av de oppnådde cDNA-prøvene. Sekvensene av COX1 og ND gener av en nært beslektet østers prøve viser lav divergens fra referansen Pacific østers belastning. MALDI-TOF massespektrometri viser vellykket anvendelse av cDNA-biblioteket for å klone de industrielt relevante genene MgUGD og MgUXS.Gelbildet identifiserer også UDP-glukuronsyre og UDP-xylose generert av den enzymatiske virkningen av den suksessivt uttrykte og rensede MgUGD og MgUXS. Denne metoden krever ikke en perfekt match mellom referansesekvensen og de oppnådde markørsekvensene, og bør gi forskeren tillit til å jobbe med ureferanserte østers. I prinsippet kan denne metoden brukes på ethvert ureferansert biologisk utvalg som sekvenser fra en nært beslektet referanseart er offentlig tilgjengelige.Denne metoden tillater ikke-ekspert forskere å enkelt få tilgang til genetisk materiale av potensiell biologisk betydning og baner vei for flere forskere å arbeide med lett tilgjengelige, men ufullstendig identifiserte biologiske prøver.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Syntetisk Spider Silk Produksjonen på en laboratorieskala

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Utforme en Bio-responsive Robot fra DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

En forbedret fremgangsmåte for fremstillingen av type I kollagen fra hud

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidbllag Vesikkel Generation Bruke Microfluidic Spyling

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av en Tredimensjonal Full Tykkelse hudekvivalent og Automated såret

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Kvalitativ Karakterisering av den vandige fraksjon fra Hydrothermal kondensering av Alger Bruke 2D gasskromatografi med Time-of-flight massespektrometri

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

En Microcontroller drives enhet for generering av flytende ekstrakter fra konvensjonelle sigarett røyk og elektronisk sigarett Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalerbar generasjon av modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Produksjon av membranfiltrert faseforskyvning Decafluorobutane Nanodroplets fra preformede mikrobobler

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Generering av en forenklet tredimensjonal hud-på-en-chip-modell i en mikromaskin mikrofluidisk plattform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...