Name: a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters
Uploaded: 2019-06-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана Фондом естественных наук Китая (грант ы 31471703, A0201300537 и 31671854 до J.V. и L.L., грант номер 31470435 для G.Y.), и 100 иностранных талантов плана (грант номер JSB2014012 до J.V.).

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематический обзор показан на рисунке 1.
1. Коллекция образцов
<ol><li>Получить образцы устриц. Держите устриц на льду в послеуборочной период, транспортировки и до лабораторного использования и обработки в течение 4-7 дней после покупки. ПРИМЕ?...

<ol>
	<li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+a+DNA+taxonomy.">The promise of a DNA taxonomy.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).</li><li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+identification+of+dried+shellfish+(oyster,+clam+and+mussel)+products+sold+on+the+Chinese+market.">Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market.</a> Food Control. 90, 199-204 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+cob+and+cox1+genes+and+editing+of+the+corresponding+mRNAs+in+Dinophysis+acuminata+from+Narragansett+Bay,+with+special+reference+to+the+phylogenetic+position+of+the+genus+Dinophysis.">Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).</li><li>Sell, J., Spirkovski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+differentiation+between+two+forms+of+trout+Salmo+letnica,+endemic+to+the+Balkan+Lake+Ohrid,+reflects+their+reproductive+isolation.">Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation.</a> Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).</li><li>Karadjian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+rearranged+mitochondrial+genome+in+Nycteria+parasites+(Haemosporidia)+from+bats.">Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).</li><li>Morga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+from+flat+oyster+Ostrea+edulis+as+suitable+housekeeping+genes+for+quantitative+real+time+PCR.">Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR.</a> Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).</li><li>Delsuc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+systematics+of+armadillos+(Xenarthra,+Dasypodidae):+contribution+of+maximum+likelihood+and+Bayesian+analyses+of+mitochondrial+and+nuclear+genes.">Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+UDP-Glucose+Dehydrogenase+from+Akkermansia+muciniphila.">Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).</li><li>Gu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+the+UDP-Xylose+Biosynthesis+Pathway+in+Sphaerobacter+thermophilus.">Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).</li><li>Duan, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+UDP-xylose+biosynthesis+pathway+in+Rhodothermus+marinus.">Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li><li>Song, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-glucose+4-epimerase+and+&#946;-1,4-galactosyltransferase+from+the+oyster+Magallana+gigas+as+valuable+biocatalysts+for+the+production+of+galactosylated+products.">UDP-glucose 4-epimerase and &#946;-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).</li><li>Gainey, P. A., Phelps, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uridine+diphosphate+glucuronic+acid+production+and+utilization+in+various+tissues+actively+synthesizing+glycosaminoglycans.">Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans.</a> Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).</li></ol>

Представленный протокол позволяет генетическую идентификацию неупомянутых образцов устриц с аналогичным фенотипом региональных рынков морепродуктов путем сравнения генов COX1 и ND с общедоступной базой данных генома ДНК устриц. Значение этого метода заключается в его простоте, так ка?...

Приобретение живого эталонного биологического материала может быть сложным из-за длительного срока поставки, предпринимательских рассуждений или таможенных правил, касающихся конкретных стран. В качестве альтернативы необходимый биологический материал может быть также собран из фенотипически идентичных образцов. Однако эти образцы могут значительно различаться на уровне генотипа, и поэтому сравнения с цифровыми эталонными геномами одного и того же вида часто оказываются трудными или даже бесполезными из-за несовместимости вновь полученного материала с существующих методов усиления ДНК. Секвенирование высоко сохранимых генов отдельных образцов являетсяшироко используемым и мощным инструментом для идентификации видов 1, таких как сохраненные митохондриальные гены, которые часто используются в качестве эталонных генов для оценки качества библиотек кДНК2 ,3,4,5,6. Основное обоснование представленного метода заключается в том, что высокая сохранность последовательностей митохондриальных генов в отдельных анонимных образцах устриц по сравнению с соответствующими последовательностями эталонного генома указывает на то, что другие гены могут также показывать низкий уровень дивергенции, учитывая в целом более высокуюскорость эволюции митохондриальной ДНК по отношению к ядерной ДНК 7, что позволяет усиление и изоляцию широкого спектра научно и промышленно значимых генов, просто используя публично доступные данные последовательности в качестве эталона.
Общая цель описанного в настоящем методе состоит в том, чтобы представить оптимизированный рабочий процесс для создания практически секвенированной библиотеки кДНК устрицы, которая может быть использована в качестве шаблона ДНК для клонирования генов устриц. При виртуальном секвенировании секвенирования генома de novo обходится; вместо этого, известная, цифрово-сохраненная справочная последовательность используется непосредственно для использования или разработки праймеров для производства cDNA, которые в конечном итоге будут состоять из библиотеки (или будут добавлены к уже существующей последовательной). Цель состоит в том, чтобы создать конвергентную библиотеку кДНК, что означает, что сходство между сгенерированными последовательностями кДНК и эталонной последовательностью может ранжироваться от низкого к высокому расхождению. Ключевым преимуществом использования Cytochrome C Oxidase subunit 1 (COX1) и NADH Dehydrogenase (ND) в качестве эталонных генов является то, что даже высоко географически разъединяющие образцы устриц могут быть профилированы из-за высокой консервации этих митохондриальных генов. Доказав подход с этими устоявшимися маркерами, мы затем демонстрируем его применение к двум ферментнымкандидатам, которые участвуют в биосинтезе нуклеотида сахара и могут иметь промышленное значение 8,9, 10. Биотехнологический потенциал тихоокеанской устрицы до сих пор не изучен. Таким образом, мы считаем, что этот сходящийся метод для подготовки практически секвенированных библиотеки кДНК также будет подходящим для неспециалистов исследователей, которые хотят генерировать кДНК из этого соответствующего биологического материала.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Chemicals:</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1% Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>490-79-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose for molecular biology</td>
			<td>Biowest Chemicals</td>
			<td>111860</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicilin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Lingfeng, Shanghai</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanidinium thiocyanate-phenol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td>Nanjing Chemical Reagent</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10855021</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">NAD+</td>
			<td>Duly Biotech</td>
			<td>53-84-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenyl-methylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UDP-glucose</td>
			<td>Wuhu Nuowei Chemicals</td>
			<td>28053-08-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UDP-glucuronic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>63700-19-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tools/Instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MALDI-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Autoflex</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal block heater</td>
			<td>Long Yang Scientific Instruments</td>
			<td>Thermoshaker HB20</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermocycler</td>
			<td>Hema</td>
			<td>9600</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Enzyme and Kits:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10&#215;Ligation buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B69</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5&#215;PrimeSTAR buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9158A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alkaline phosphatase</td>
			<td>ThermoFisher FastAP</td>
			<td>EF0654</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTTGACCAAAAACATAAGACATG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cutsmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dNTP mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cleanup Kit</td>
			<td>AxyGen</td>
			<td>AP-PCR-250</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET-30a(+) vector</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>69909</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters

Доступ к биологическому материалу эталонных видов, которые ранее использовались в ключевых экспериментах, таких как разработка новых клеточных линий или проектов секвенирования генома, часто трудно предусмотреть для дальнейших исследований или третьих сторон из-за расходный характер образцов. Хотя в настоящее время широко распространены на тихоокеанском побережье Азии, Австралии и Северной Америки, отдельные образцы тихоокеанских устриц генетически довольно разнообразны и поэтому не подходят непосредственно в качестве исходного материала для библиотек генов. В этой статье мы демонстрируем использование неупомянутых тихоокеанских устриц, полученных на региональных рынках морепродуктов для создания библиотек кДНК. Затем эти библиотеки были сравнены с общедоступным геномом устриц, и ближайшая соответствующая библиотека была выбрана с использованием митохондриальных эталонных генов Cytochrome C Oxidase subunit I (COX1) и NADH Dehydrogenase (ND). Пригодность генерируемой библиотеки кДНК также демонстрируется путем клонирования и экспрессии двух генов, кодирующих ферменты UDP-глюкуроновая кислота дегидрогеназы (UGD) и udP-xylose synthase (UXS), которые отвечают за биосинтез UDP-xylose от УДП-глюкоза.

На рисунке 1 показан ажематический обзор описанного метода подготовки конвергентной библиотеки кДНК, полученной от тихоокеанских устриц. На рисунке 2 показаны последовательности генов COX1 и ND удаленного образца устриц ы с высоким расхождением с генными ...

Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

Мы описываем стратегию использования образцов РНК из неупомянутых образцов тихоокеанских устриц и оцениваем генетический материал по сравнению с общедоступными данными генома для создания практически секвенируемой библиотеки кДНК.

Конвергентная стратегия для поколения практически секвенированных cDNA библиотека от неупомянутых тихоокеанских устриц

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

Ключевой вопрос, который мы хотим решить с помощью этого метода, заключается в том, как мы можем использовать образцы РНК из материала, приобретенного на местных продовольственных рынках для клонирования биотехнологических соответствующих генов? Здесь мы используем тихоокеанских устриц в качестве примера для демонстрации этого подхода и потенциального дальнейшего применения. Основным преимуществом этого метода является то, что обычное секвенирование генома или кДНК образцов устриц можно обойти.Вместо этого, последовательности цитохрома c oxidase подразделения I и NADH дегидрогеназы были сопоставлены с общедоступными эталонными последовательностями из тихоокеанских устриц, чтобы выбрать наиболее тесно связанный образец. КДНК, подготовленная из этого образца, может быть непосредственно использована для клонирования биотехнологических релевантных генов, которые могут быть отобраны с использованием общедоступной информации о последовательности. Демонстрация процедуры будет Yongmei Lyu и Yuquan Ли, два аспиранта из гликомики и Гликан биоинженерии научно-исследовательский центр в Нанкинском сельскохозяйственном университете.Чтобы подготовить образец ткани устрицы, используйте стерилизованный скальпель, чтобы вырезать около 100 миллиграммов однородной мягкой ткани из приблизительного геометрического центра каждого образца устрицы. Перенесите образец в раствор, наполненный 50 миллилитров жидкого азота. Измельчить флэш-замороженной ткани устрицы в мелкий порошок.Взвесить 75 миллиграммов замороженной ткани каждого образца в стерильную 1,5-миллилитровую центрифугу и смешать с одним миллилитром реагента гуанидина тиоцианат-фенола. Наиболее важным шагом этой процедуры является этап извлечения РНК. Для того, чтобы свести к минимуму деградацию РНК, необходимо сократить время между сбором ткани устрицы и экстракции РНК.Центрифуга образца на 14000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 15 минут. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую центрифугу, добавьте 200 микролитров хлороформа и тщательно перемешайте на вихревом миксере в течение 10-15 секунд, пока смесь не станет молочно-белой. Далее центрифуга в течение 15 минут, как это было сделано ранее.С помощью 200-микролитровой пипетки тщательно перенесите верхний аковый слой, не нарушая межфазы, в новую 1,5-миллилитровую центрифугу. Добавьте 500 микролитров изопропилового спирта в центрифугу и аккуратно переверните для смешивания образцов. Затем оставьте образцы на льду на 20 минут.Центрифуга при 14 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение восьми минут, и удалить супернатант. Повторное потребление гранул в один миллилитр 75% этанола, и центрифуга на 14000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Удалите все супернатанты, и повторить мыть в этаноле.Высушите гранулы в течение шести минут при комнатной температуре. Затем растворите высушенные гранулы РНК в 25 микролитров воды, обработанной DEPC, и держите трубку на льду. Используйте образцы РНК в течение 24 часов.Для создания библиотеки cDNA сначала подготовьте реакционной смеси для каждого образца РНК в 300-микролитровой трубке ПЦР, добавив решения в соответствии с рукописью. Добавьте в трубку один микролитер извлеченного образца РНК. Инкубировать смесь в ПЦР термоциклер в течение 60 минут при температуре 42 градусов по Цельсию, а затем увеличить температуру до 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут.Храните сгенерированную библиотеку cDNA до 12 месяцев при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Во-первых, добавьте один микролитр генерируемой библиотеки cDNA в трубки, содержащие смеси ПЦР, подготовленные в соответствии с рукописью. Поместите трубки ПЦР в термоциклер ПЦР и выполните усиление ПЦР с первоначальным шагом денатурации и 35 циклами реакции ПЦР, состоящими из шага анны, шага удлинения и шага денатурации в соответствии с рукописью.После циклов выполните один заключительный шаг удлиниации в течение пяти минут. Используйте пять микролитров продукта ПЦР для проверки качества электрофорезом агарозного геля. Наблюдайте усиленный ген COX1 или ND в качестве одной полосы на уровне 759 или 748 базовых пар, соответственно.Чтобы очистить остальную часть продукта ПЦР, добавьте в каждый образец 100 микролитров ДНК-связывающего буфера, содержащего высокие концентрации чаотропных солей. Vortex кратко смешать содержимое. Поместите столбец очистки в двухми миллилитровую центрифугу.Пипетт реакционной смеси в колонку. Поместите трубку с установленной колонкой в центрифугу при температуре 14 000 раз г в течение одной минуты при комнатной температуре. После отбрасывания фильтрата из двухмилилитровой центрифуги трубки, мыть два раза с 700 и 400 микролитров стирального раствора W2 путем центрифугирования при 14000 раз г.Затем нагрейте один миллилитр деионизированной воды до 65 градусов по Цельсию в металлическом блоке нагревателя. Перенесите колонку в новую 1,5-миллилитровую центрифугу и пипетку 25 микролитров разогретой деионизированной воды в центр мембраны белой колонны. Пусть мембрана замочить в течение одной минуты при комнатной температуре.Затем центрифуга трубки с колонкой в 14 000 раз г в течение одной минуты при комнатной температуре. Откажитесь от столбца и храните очищенный продукт ПЦР до 12 месяцев при температуре минус 20 градусов по Цельсию. По желанию, COX1 или ND обратные грунтовки также могут быть использованы для двунаправленного последовательности.Для последовательности Sanger используйте соответствующую форвардную грунтову COX1 или ND. После получения результатов секвенирования сравните последовательности с последовательностью генома тихоокеанского штамма ссылки устриц с помощью онлайн-инструмента NCBI Nucleotide BLAST. Используйте соответствующие форвардные и обратные грунтовки генов MgUGD и MgUXS для усиления и очистки ПЦР, как это было сделано ранее.После инкубации очищенных продуктов ПЦР с буфером пищеварения, подготовить предварительно вываренный вектор pET-30a путем растворения 500 нанограммов pET-30a в 1,5-миллилитровой центрифуге трубки, и добавить деионизированной воды для пополнить до 16 микролитров. Затем добавьте в трубку два микролитера 10-времени концентрированного буфера пищеварения и по одному микролитеру, каждый из 20 единиц ограничения эндонуклейсов Nde1 и Xho1. Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение трех часов.После этого добавьте один микролитер из одноточьей щелочной фосфатазы и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение дополнительного часа. Затем поместите трубку в разогретый металлический блок нагреватель при 75 градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы инактивировать щелочной фосфатазы. После культивирования клеток E.coli BL21 с генами MgUGD и MgUXS, перенесите культуру в 400-миллилитровую LB-среду в двухлитровой колбе и поместите ее на шейкер при температуре 200 об/мин при температуре 37 градусов по Цельсию.Через три часа проверьте оптическую плотность на фотометре на длине волны 600 нанометров и убедитесь, что она достигает поглощения примерно 0,5. Затем уменьшите температуру шейкера до 20 градусов по Цельсию. Добавьте 400 микролитров одномядерного IPTG, чтобы вызвать экспрессию рекомбинантных белков в течение трех часов.После сбора клеток, нарушить клетки sonication в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию. Центрифуга при 14 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 20 минут, и собирать супернатант в новую трубку для теста активности. После анализа активности, утолить реакции, добавив 20 микролитров метанола и 40 микролитров хлороформа в смеси MgUXS и MgUGD.Вихрь образцовых смесей и центрифуг при 14 000 раз г в течение шести минут и четырех градусов по Цельсию. Соберите верхний aqueous слой каждой пробки в новых пробках для масс-спектрометрии MALDI-TOF. В этом эксперименте последовательное выравнивание последовательности последовательностей генов COX1 и ND сильно расходящихся образцов сравнивались со эталонным тихоокеанским штаммом устриц.Красные стрелки показывают нуклеотидные различия между эталонной последовательностью и последовательностью полученных образцов кДНК. Последовательности генов COX1 и ND близко родственного образца устрицы показывают низкое расхождение со эталоном тихоокеанского штамма устриц. Масс-спектрометрия MALDI-TOF показывает успешное применение библиотеки cDNA для клонирования промышленно релевантных генов MgUGD и MgUXS.Гель изображение также определяет UDP-глюкуроновой кислоты и UDP-ксилоза, порожденных энзиматический действие последовательно выраженных и очищенных MgUGD и MgUXS. Этот метод не требует идеального матча между эталонной последовательностью и полученными последовательностями маркеров и должен дать исследователю уверенность в работе с неучтенными устрицами. В принципе, этот метод может быть применен к любому неучтенного биологического образца, для которого в доступе находятся последовательности из тесно связанных справочных видов.Этот метод позволяет неэкспертным исследователям легко получить доступ к генетическому материалу потенциального биологического значения и открывает путь для большего времени ученых для работы с легкодоступными, но неполно идентифицированными биологическими образцами.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Искусственный шелк паука производство в лабораторных масштабах

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Проектирование Bio-отзывчивый робота из ДНК-оригами

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Улучшенный способ по подготовке I типа коллагена из кожи

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Липидов Bilayer везикул поколения Использование микрофлюидных струйное

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Генерация трехмерной всю толщину кожи Эквивалент техники и автоматизированных Ранение

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Качественная характеристика Фракции водного из гидротермальных сжижение водорослей Использование 2D газовой хроматографии с течением времени пролета масс-спектрометрии

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Микроконтроллер работает устройство для генерации жидких экстрактов из обычных сигарет курить и электронных сигарет аэрозоля

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Масштабируемое поколение зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика иммуностимулированием

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Производство мембранно-фильтрованных фазовых декафторбутановых нанокафторбутановых из предварительно сформированных микропузырьков

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Создание упрощенной трехмерной модели «кожа на чипе» на микрообрабатываемой микрофлюидной платформе

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...