Name: a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters
Uploaded: 2019-06-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av Natural Science Foundation i Kina (Grant nummer 31471703, A0201300537 och 31671854 till J.V. och ll, Grant nummer 31470435 till G.Y.), och 100 utländska talanger plan (bidrags nummer JSB2014012 till J.V.).

Anm.: en schematisk översikt visas i figur 1.
1. provtagning
<ol><li>Få ostron prov. Håll ostron på is under Postharvest perioden, transporten och före laboratorieanvändning och process inom 4-7 dagar efter köpet. Anmärkning: för detta protokoll köptes ostron från Zhong Cai grossistmarknad i Nanjing (med ursprung från Ningde, Fujian, Kina och Lianyungang, Jiangsu, Kina), Haijie akvatiska produkt företag i Qingdao (kommer från Qingdao, Shandong, ...

<ol>
	<li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+a+DNA+taxonomy.">The promise of a DNA taxonomy.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).</li><li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+identification+of+dried+shellfish+(oyster,+clam+and+mussel)+products+sold+on+the+Chinese+market.">Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market.</a> Food Control. 90, 199-204 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+cob+and+cox1+genes+and+editing+of+the+corresponding+mRNAs+in+Dinophysis+acuminata+from+Narragansett+Bay,+with+special+reference+to+the+phylogenetic+position+of+the+genus+Dinophysis.">Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).</li><li>Sell, J., Spirkovski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+differentiation+between+two+forms+of+trout+Salmo+letnica,+endemic+to+the+Balkan+Lake+Ohrid,+reflects+their+reproductive+isolation.">Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation.</a> Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).</li><li>Karadjian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+rearranged+mitochondrial+genome+in+Nycteria+parasites+(Haemosporidia)+from+bats.">Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).</li><li>Morga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+from+flat+oyster+Ostrea+edulis+as+suitable+housekeeping+genes+for+quantitative+real+time+PCR.">Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR.</a> Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).</li><li>Delsuc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+systematics+of+armadillos+(Xenarthra,+Dasypodidae):+contribution+of+maximum+likelihood+and+Bayesian+analyses+of+mitochondrial+and+nuclear+genes.">Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+UDP-Glucose+Dehydrogenase+from+Akkermansia+muciniphila.">Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).</li><li>Gu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+the+UDP-Xylose+Biosynthesis+Pathway+in+Sphaerobacter+thermophilus.">Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).</li><li>Duan, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+UDP-xylose+biosynthesis+pathway+in+Rhodothermus+marinus.">Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li><li>Song, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-glucose+4-epimerase+and+&#946;-1,4-galactosyltransferase+from+the+oyster+Magallana+gigas+as+valuable+biocatalysts+for+the+production+of+galactosylated+products.">UDP-glucose 4-epimerase and &#946;-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).</li><li>Gainey, P. A., Phelps, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uridine+diphosphate+glucuronic+acid+production+and+utilization+in+various+tissues+actively+synthesizing+glycosaminoglycans.">Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans.</a> Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).</li></ol>

Det presenterade protokollet tillåter genetisk identifiering av orefererade ostron exemplar med liknande fenotyp från regionala skaldjursmarknader genom jämförelse av COX1 och ND gener med en allmänt tillgänglig Oyster DNA Genome databas. Betydelsen av denna metod ligger i dess enkelhet, eftersom endast en enda PCR-reaktion behövs för utvärderingen av det virtuella cDNA-biblioteket. De två bevarade mitokondrierna COX1 och ND gener förstärkallades från ett cDNA bibliotek som genererades av omvänd Transkripti...

Förvärvet av levande refererade biologiskt material kan vara utmanande på grund av långa leveranstider, företagande resonemang, eller landsspecifika tullbestämmelser. Som ett alternativ kan det erforderliga biologiska materialet också samlas in från fenotypiskt identiska prover. Dessa prover kan dock variera betydligt på genotyp nivå, och därför är jämförelser med digitalt lagrade referens genom av samma art ofta förorsakade svåra eller till och med meningslösa på grund av inkompatibilitet hos det nyligen inköpta materialet med befintliga DNA-amplifieringsmetoder. Sekvensering av mycket bevarade gener av enskilda prover är ett allmänt använt och kraftfullt verktyg för att identifiera arter1, såsom bevarade mitokondriella gener som ofta används som referengener för kvalitetsbedömningen av cDNA-bibliotek2 ,3,4,5,6. Den bakomliggande grunden för den här presenterade metoden är att högt bevarande av mitokondriella gensekvenser i enskilda anonyma ostron prov jämfört med motsvarande sekvenser av referensgenomet indikerar att andra gener också kan visa en låg nivå av avvikelser, med tanke på den allmänt snabbare graden av mitokondriell DNA-evolution i förhållande till nukleärt DNA7, vilket möjliggör förstärkning och isolering av ett brett spektrum av vetenskapligt och industriellt relevanta gener genom att helt enkelt använda offentligt tillgängliga sekvenserings data som referens.
Det övergripande målet för häri beskrivna metoden är att presentera ett optimerat arbetsflöde för att generera ett praktiskt taget sekvenserade Oyster cDNA bibliotek som kan användas som mall DNA för kloning av ostron gener. Vid virtuell sekvensering kringgås de Novo genomsekvenseringen. i stället används en känd, digitalt lagrad referenssekvens direkt för att använda eller designa primers för produktion av cDNAs som så småningom kommer att bestå av ett bibliotek (eller läggas till i en befintlig). Målet är att skapa ett konvergent cDNA-bibliotek, vilket innebär att likheter mellan de genererade cDNA-sekvenserna och referenssekvens kan rangordnas från låg till hög avvikelse. En viktig fördel med att använda cytokrom C oxidas subenhet 1 (COX1) och NADH dehydrogenas (nd) som referengener är att även mycket geografiskt det ostron exemplar kan profileras på grund av den höga bevarandet av dessa mitokondriella gener. Efter att ha bevisat tillvägagångssättet med dessa väletablerade markörer, visar vi sedan dess tillämpning på två enzym kandidater som är involverade i socker nukleotidbiosyntes och kan vara av industriell relevans8,9, 10. den biotekniska potentialen i stilla ostron är fortfarande outforskad. Därför anser vi att denna konvergerande metod för att förbereda ett virtuellt sekvenserat cDNA-bibliotek också kommer att vara lämplig för icke-specialiserade forskare som vill generera cDNA från detta relevanta biologiska material.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Chemicals:</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1% Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>490-79-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose for molecular biology</td>
			<td>Biowest Chemicals</td>
			<td>111860</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicilin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Lingfeng, Shanghai</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanidinium thiocyanate-phenol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td>Nanjing Chemical Reagent</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10855021</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">NAD+</td>
			<td>Duly Biotech</td>
			<td>53-84-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenyl-methylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UDP-glucose</td>
			<td>Wuhu Nuowei Chemicals</td>
			<td>28053-08-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UDP-glucuronic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>63700-19-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tools/Instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MALDI-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Autoflex</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal block heater</td>
			<td>Long Yang Scientific Instruments</td>
			<td>Thermoshaker HB20</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermocycler</td>
			<td>Hema</td>
			<td>9600</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Enzyme and Kits:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10&#215;Ligation buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B69</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5&#215;PrimeSTAR buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9158A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alkaline phosphatase</td>
			<td>ThermoFisher FastAP</td>
			<td>EF0654</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTTGACCAAAAACATAAGACATG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cutsmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dNTP mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cleanup Kit</td>
			<td>AxyGen</td>
			<td>AP-PCR-250</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET-30a(+) vector</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>69909</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters

Tillgången till biologiskt material av referens arter, som tidigare använts i viktiga experiment, till exempel vid utveckling av nya cellinjer eller sekvenserings projekt, är ofta svåra att tillhandahålla för ytterligare studier eller tredje parter på grund av provtagens fullänkande karaktär. Även om det nu är vida spridda över Stillahavskusten i Asien, Australien och Nordamerika, är enskilda Pacific ostron exemplar genetiskt ganska varierande och är därför inte direkt lämpade som utgångsmaterial för gen bibliotek. I den här artikeln visar vi användningen av orefererade Pacific Oyster-prover som erhållits från regionala skaldjursmarknader för att generera cDNA-bibliotek. Dessa bibliotek jämfördes sedan med det allmänt tillgängliga ostron genomet, och det närmast relaterade biblioteket valdes med hjälp av mitokondriella referengener cytokrom C oxidas subenhet I (COX1) och NADH dehydrogenas (nd). Det genererade cDNA-bibliotekets lämplighet demonstreras också genom kloning och uttryck av två gener som kodar för enzymerna UDP-glukuronsyra-dehydrogenas (UGD) och UDP-Xylose syntas (UXS), som är ansvariga för biosyntesen av UDP-Xylose från UDP-glukos.

Figur 1 visar en schematisk översikt över den beskrivna berednings metoden för det konvergent cDNA-biblioteket som kommer från Pacific Oyster-individer. Figur 2 visar SEKVENSER av COX1 och nd gener av ett avlägset besläktat ostron prov med hög avvikelse från COX1 och nd gen sekvenser av referensmaterialet. Figur 3 visar SEKVENSER av COX1 och nd gener av ett närbesläktat ostron prov med låg avvikelse från COX1 och nd gen ...

Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

Vi beskriver en strategi för hur man använder RNA-prover från orefererade Pacific Oyster-prover, och utvärderar det genetiska materialet i jämförelse med allmänt tillgängliga genomdata för att generera ett virtuellt sekvenserat cDNA-bibliotek.

En konvergerande strategi för generering av ett virtuellt sekvenserat cDNA-bibliotek från orefererade Pacific Oysters

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

Den centrala fråga vi vill ta upp med denna metod är hur vi ska kunna använda RNA-prover från material som köpts på lokala livsmedelsmarknader för kloning av bioteknologiskt relevanta gener? Här använder vi Stilla ostron som en fallstudie för att visa detta tillvägagångssätt och potentiella ytterligare tillämpning. Den största fördelen med denna teknik är att konventionell genom eller cDNA-sekvensering av ostronproverna kan kringgås.Istället jämfördes sekvenser av cytokrom c oxidas underenhet I och NADH dehydrogenas med allmänt tillgängliga referenssekvenser från Stilla havet ostron att välja den mest närliggande exemplar. Det cDNA som utarbetats av detta exemplar kan direkt användas för kloning av biotekniskt relevanta gener, som kan väljas med hjälp av den offentliga sekvensinformationen. Demonstrera förfarandet kommer att Yongmei Lyu och Yuquan Li, två doktorander från Glycomics och Glycan Bioengineering Research Center vid Nanjing Agricultural University.För att förbereda ostronvävnad prov, använd en steriliserad skalpell för att skära ut cirka 100 milligram homogen mjukvävnad från den ungefärliga geometriska centrum av varje ostron exemplar. Överför provet till en murbruk fylld med 50 milliliter flytande kväve. Mal den flashfrusna ostronvävnaden till ett fint pulver.Väg ut 75 milligram av varje exemplars frysta vävnad i en steril 1,5-milliliter centrifugrör, och blanda med en milliliter guanidiniumtiocyanat-fenol extraktion reagens. Det mest kritiska steget i detta förfarande är RNA-extraktionssteget. För att minimera RNA-nedbrytningen är det väsentligt att minska tiden mellan skörden av ostronvävnaden och RNA-extraktionen.Centrifugera provet vid 14, 000 gånger g och fyra grader Celsius i 15 minuter. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 milliliter centrifugeringsrör, tillsätt 200 mikroliter kloroform och blanda noggrant på en virvelblandare i 10 till 15 sekunder tills blandningen blir mjölkvit. Därefter centrifug i 15 minuter som gjort tidigare.Med en 200-mikroliterpipett överför du försiktigt det övre vattenskiktet, utan att störa interfasen, till ett nytt centrifugeringsrör på 1,5 milliliter. Tillsätt 500 mikroliter isopropylalkohol i centrifugröret, och invertera försiktigt för att blanda proverna. Lämna sedan proverna på is i 20 minuter.Centrifugera vid 14, 000 gånger g och fyra grader Celsius i åtta minuter, och ta bort supernatanten. Resuspend pelleten i en milliliter av 75%etanol, och centrifug vid 14, 000 gånger g och fyra grader Celsius i fem minuter. Ta bort alla supernatant, och upprepa tvätt i etanol.Torka pelletsen i sex minuter i rumstemperatur. Lös sedan upp den torkade RNA-pelleten i 25 mikroliter AV DEPC-behandlat vatten och håll röret på is. Använd RNA-proverna inom 24 timmar.För att generera ett cDNA-bibliotek, först förbereda en reaktion blandning för varje RNA-prov i en 300-microliter PCR-röret genom att lägga till lösningar enligt manuskriptet. Tillsätt en mikroliter av det extraherade RNA-provet i röret. Inkubera blandningen i en PCR termocyklare i 60 minuter vid 42 grader Celsius, och sedan öka temperaturen till 95 grader Celsius i fem minuter.Förvara det genererade cDNA-biblioteket i upp till 12 månader vid minus 20 grader Celsius. Lägg först till en mikroliter av det genererade cDNA-biblioteket till rör som innehåller PCR-blandningar, beredda enligt manuskriptet. Placera PCR-rören i PCR-termocyklaren, och utför PCR-förstärkningen med ett inledande denatureringssteg och 35 PCR-reaktionscykler bestående av ett glödgningssteg, ett töjningssteg och ett denatureringssteg enligt manuskriptet.Efter cyklerna, utför en slutföra töjning steg i fem minuter. Använd fem mikroliter av PCR-produkten för att verifiera kvaliteten genom agarosgelelektrofores. Observera den förstärkta COX1- eller ND-genen som ett enda band vid antingen 759 respektive 748 baspar.För att rena resten av PCR-produkten, tillsätt 100 mikroliter av DNA-bindande buffert som innehåller höga koncentrationer av chaotropa salter till varje prov. Vortex kort för att blanda innehållet. Placera en reningskolonn i ett centrifugeringsrör med två milliliter.Pipettera reaktionsblandningen i kolonnen. Placera röret med den monterade kolonnen i en centrifug på 14, 000 gånger g i en minut vid rumstemperatur. Efter att filtratet kasserats från två-millilitercentrifugeröret, tvätta två gånger med 700 och 400 mikroliter av tvättlösning W2 genom centrifugering vid 14, 000 gånger g.Därefter värmer du en milliliter av avjoniserat vatten till 65 grader Celsius i en metallblockvärmare. Överför kolonnen till ett nytt 1,5-milliliter centrifugeringsrör, och pipetter 25 mikroliter av det förvärmda avjoniserade vattnet till mitten av det vita kolonnmembranet. Låt membranet dra i en minut i rumstemperatur.Sedan centrifugera röret med kolonnen vid 14, 000 gånger g i en minut vid rumstemperatur. Kassera kolonnen och förvara den renade PCR-produkten i upp till 12 månader vid minus 20 grader Celsius. Eventuellt kan COX1 eller ND omvänd primers också användas för dubbelriktad sekvensering.För Sanger-sekvensering, använd den relevanta COX1- eller ND-framåt primern. När du har hämtat sekvenseringsresultaten jämför du sekvenserna med genomsekvensen av Stillahavsosos referensstammen med hjälp av onlineverktyget NCBI Nucleotide BLAST. Använd respektive framåt- och bakåtreprimrar av MgUGD- och MgUXS-gener för att förstärka och rena av PCR som tidigare gjorts.Efter inkubering av renade PCR-produkter med digestionsbuffert, förbered den predigested pET-30a-vektorn genom att lösa upp 500 nanogram pET-30a i ett 1,5 milliliter centrifugerör och tillsätt avjoniserat vatten för att fylla på upp till 16 mikroliter. Lägg sedan till två mikroliter av 10-gånger-koncentrerad matsmältningsbuffert och en microliter vardera av de 20 enheter begränsning endonucleases Nde1 och Xho1 i röret. Inkubera blandningen vid 37 grader Celsius i tre timmar.Därefter lägger du till en mikroliter av en enhet alkalisk fosfatas, och inkubera vid 37 grader Celsius i ytterligare en timme. Placera sedan röret i en förvärmd metallblockvärmare vid 75 grader Celsius i 10 minuter för att inaktivera den alkaliska fosfatasen. Efter att ha odlat E.coli BL21-celler med MgUGD- och MgUXS-generna överför du kulturen till 400 milliliter LB-medium i en tvåliters skakningskolv och placerar den på en shaker vid 200 varv/min vid en temperatur på 37 grader Celsius.Efter tre timmar, kontrollera den optiska densiteten på en fotometer vid en våglängd på 600 nanometer, och se till att den når en absorption av cirka 0,5. Sänk sedan skaktemperaturen till 20 grader Celsius. Tillsätt 400 mikroliter av en-molar IPTG för att inducera uttrycket av de rekombinanta proteinerna i tre timmar.Efter skörden av cellerna, störa cellerna genom ultraljudsbehandling i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Centrifugera vid 14, 000 gånger g och fyra grader Celsius i 20 minuter, och samla supernatanten i ett nytt rör för aktivitetstestet. Efter aktivitetsanalysen, släck reaktionerna genom att tillsätta 20 mikroliter metanol och 40 mikroliter kloroform till MgUXS- och MgUGD-blandningarna.Vortexa provblandningarna, och centrifug vid 14, 000 gånger g i sex minuter och fyra grader Celsius. Samla upp det övre vattenskiktet av varje rör i nya rör för MALDI-TOF masspektrometri. I detta experiment jämfördes sekvens anpassning av COX1 och ND gensekvenser av en mycket divergerande exemplar med referens Pacific ostron stam.De röda pilarna visar nukleotidskillnader mellan referenssekvensen och sekvensen för de erhållna cDNA-proverna. Sekvenserna av COX1- och ND-generna hos ett närbesläktat ostronexemplar uppvisar låga avvikelser från referensostronstammen i Stilla havet. MALDI-TOF masspektrometri visar framgångsrik tillämpning av cDNA biblioteket för att klona de industriellt relevanta generna MgUGD och MgUXS.Gelbilden identifierar också UDP-glukuronsyra och UDP-xylose som genereras av den enzymatiska verkan av den successivt uttryckta och renade MgUGD och MgUXS. Denna metod kräver inte en perfekt matchning mellan referenssekvensen och de erhållna markörsekvenserna och bör ge forskaren förtroende att arbeta med orefererade ostron. I princip kan denna metod tillämpas på alla icke-påförstådd biologiska prov för vilka sekvenser från en närliggande referensart är allmänt tillgängliga.Denna metod gör det möjligt för icke-sakkunniga forskare att enkelt få tillgång till genetiskt material av potentiell biologisk betydelse och banar väg för fler forskare att arbeta med lättillgängliga men ofullständigt identifierade biologiska prover.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Syntetisk Spider Silk Production i laboratorieskala

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Designa en Bio-lyhörd robot från DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

En förbättrad metod för framställning av typ I kollagen från huden

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddubbelskiktet Blås Generation Använda Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av ett tredimensionellt Full Tjocklek hudekvivalent och automatiserade sårar

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Kvalitativ karakterisering av den vattenhaltiga fraktionen från Hydrothermal Förvätskning av Alger Använda 2D gaskromatografi med Time-of-flight-masspektrometri

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

En mikrokontroller drivs enhet för generering av flytande extrakt från konventionella cigarett rök och elektronisk cigarett Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalbar Generation av Mogna Cerebellar Organoids från Mänskliga Pluripotenta stamceller och karakterisering av Immunfärgning

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Produktion av membranfiltrerade fasförskjutningsdekafluorbutannanodroppar från förformade mikrobubblor

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Generering av en förenklad tredimensionell hud-på-ett-chip-modell i en mikromaskin mikrofluidisk plattform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...