Name: a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters
Uploaded: 2019-06-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

Bu çalışma kısmen Çin doğal Bilim Vakfı (Grant numaraları 31471703, A0201300537 ve 31671854 için L.L., Grant numarası 31470435 G.Y.) ve 100 yabancı yetenekler planı (Grant numarası JSB2014012 için) tarafından desteklenmektedir.

Not: Şekil 1' de şematik bir genel bakış gösterilir.
1. örnek toplama
<ol><li>İstiridye numuneleri alın. İstiridyeler sırasında buz üzerinde istiridye tutun, taşıma ve laboratuar kullanımı ve işlem öncesinde 4-7 gün içinde satın aldıktan sonra. Not: Bu protokol Için, istiridye, Nanjing (Ningde, Fujian, Çin ve Lianyungang, Jiangsu, Çin), Haijie Aquatic ürün şirketi Qingdao (Qingdao, Shandong, Çin kökenli), Jucheng kaynaklanan Zhon...

<ol>
	<li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+a+DNA+taxonomy.">The promise of a DNA taxonomy.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).</li><li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+identification+of+dried+shellfish+(oyster,+clam+and+mussel)+products+sold+on+the+Chinese+market.">Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market.</a> Food Control. 90, 199-204 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+cob+and+cox1+genes+and+editing+of+the+corresponding+mRNAs+in+Dinophysis+acuminata+from+Narragansett+Bay,+with+special+reference+to+the+phylogenetic+position+of+the+genus+Dinophysis.">Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).</li><li>Sell, J., Spirkovski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+differentiation+between+two+forms+of+trout+Salmo+letnica,+endemic+to+the+Balkan+Lake+Ohrid,+reflects+their+reproductive+isolation.">Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation.</a> Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).</li><li>Karadjian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+rearranged+mitochondrial+genome+in+Nycteria+parasites+(Haemosporidia)+from+bats.">Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).</li><li>Morga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+from+flat+oyster+Ostrea+edulis+as+suitable+housekeeping+genes+for+quantitative+real+time+PCR.">Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR.</a> Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).</li><li>Delsuc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+systematics+of+armadillos+(Xenarthra,+Dasypodidae):+contribution+of+maximum+likelihood+and+Bayesian+analyses+of+mitochondrial+and+nuclear+genes.">Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+UDP-Glucose+Dehydrogenase+from+Akkermansia+muciniphila.">Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).</li><li>Gu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+the+UDP-Xylose+Biosynthesis+Pathway+in+Sphaerobacter+thermophilus.">Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus.</a> Protein &amp; Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).</li><li>Duan, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+UDP-xylose+biosynthesis+pathway+in+Rhodothermus+marinus.">Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li><li>Song, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-glucose+4-epimerase+and+&#946;-1,4-galactosyltransferase+from+the+oyster+Magallana+gigas+as+valuable+biocatalysts+for+the+production+of+galactosylated+products.">UDP-glucose 4-epimerase and &#946;-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).</li><li>Gainey, P. A., Phelps, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uridine+diphosphate+glucuronic+acid+production+and+utilization+in+various+tissues+actively+synthesizing+glycosaminoglycans.">Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans.</a> Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).</li></ol>

Sunulan protokol, COX1 ve ND genlerinin genel olarak kullanılabilen bir istiridye DNA genomu veritabanı ile karşılaştırılması yoluyla bölgesel deniz ürünleri piyasalarının benzer fenotipi ile başvurulmayan istiridye örneklerinin genetik tanımlaması sağlar. Bu yöntemin önemi, sadece tek bir PCR reaksiyonu sanal cDNA kütüphanesinin değerlendirilmesi için gerekli olduğu için basitliği içinde yatıyor. İki adet üretilen mitokondriyal COX1 ve ND genleri, her bir istiridye tarafından RNA ekstrele...

Yaşam referanslı biyolojik materyalin satın alınması, uzun teslimat süreleri, girişimci mantık veya ülkeye özgü gümrük yönetmeliklerine bağlı olarak zor olabilir. Alternatif olarak, gerekli biyolojik malzeme de fenotipik olarak özdeş örneklerden toplanan olabilir. Ancak, bu örnekler genotip düzeyinde önemli ölçüde değişebilir, ve bu nedenle aynı türlerin dijital olarak saklanan referans genomlar ile karşılaştırmalar genellikle zor veya hatta boşuna yeni kaynaklı malzemenin uyumsuzluğu nedeniyle işlenir Mevcut DNA amplifikasyon yöntemleri. Bireysel numunelerin son derece sağlam genleri sıralaması, cDNA kütüphanelerinin kalite değerlendirmesi için sıkça referans genleri olarak kullanılan, kayıtlı mitokondriyal genler gibi türler1' i tanımlamak için yaygın olarak kullanılan ve güçlü bir araçtır2 ,3,4,5,6. Burada sunulan yöntemin temel gerekçesi, atıf genomunun karşılık gelen dizilerine kıyasla bireysel anonim istiridye örneklerinde mitokondrial gen sıralarının yüksek korunmasında diğer genlerin de bir nükleer DNA7' ye göre mitokondriyal DNA evriminin genel olarak daha hızlı oranı verildiğinde, bilimsel ve endüstriyel olarak ilgili genlerin geniş bir yelpazede amplifikasyon ve yalıtımına izin vererek, sadece kamuya açık bir şekilde kullanarak başvuru olarak kullanılabilir sıralama verileri.
Burada açıklanan yöntemin genel amacı, istiridye genlerinin klonlanması için şablon DNA 'Sı olarak kullanılabilecek neredeyse sıralı bir istiridye cDNA Kütüphanesi oluşturmak için optimize edilmiş bir iş akışı sunabilmenizi sağlamaktır. Sanal sıralamanın içinde, de Novo genom sıralamasının kaçınması; Bunun yerine, bilinen, dijital olarak saklanan referans sırası, sonunda bir kitaplık (veya önceden var olan bir tane eklenir) oluşturan cDNAs üretimi için astar kullanmak veya tasarlamak için doğrudan kullanılır. Amaç, bir yakınsak cDNA Kütüphanesi üretmektir, yani oluşturulan cDNA dizileri ve referans sırası arasındaki benzerlikler düşük yüksek divergence sıralanmış olabilir. Referans genler olarak sitokrom C oksidaz altbirim 1 (COX1) ve NADH dehidrogenaz (ND) kullanmanın önemli bir avantajı, bu mitokondriyal genlerin yüksek korunması nedeniyle coğrafi olarak çok sayıda istiridye numunelerinin profillenmiş olabileceği anlamına gelmiştir. Bu iyi kurulan işaretçileri ile yaklaşımı kanıtlanmış olan, daha sonra şeker nüklerotid biyosentezi katılan iki enzim adayları için uygulama göstermek ve endüstriyel alaka olabilir,8,9, 10. Pasifik istiridye biyoteknolojik potansiyeli hala keşfedilmemiş. Böylece, neredeyse sıralı cDNA Kütüphanesi hazırlamak için bu yakınma yöntemi de bu ilgili biyolojik malzeme cDNA oluşturmak isteyen uzman olmayan araştırmacılar için uygun olacağına inanıyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Chemicals:</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1% Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>490-79-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose for molecular biology</td>
			<td>Biowest Chemicals</td>
			<td>111860</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicilin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Lingfeng, Shanghai</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guanidinium thiocyanate-phenol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>TRIzol reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Energy Chemical</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td>Nanjing Chemical Reagent</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10855021</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Jinhuada, Guangzhou</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Xilong Huagong</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">NAD+</td>
			<td>Duly Biotech</td>
			<td>53-84-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenyl-methylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UDP-glucose</td>
			<td>Wuhu Nuowei Chemicals</td>
			<td>28053-08-9</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UDP-glucuronic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>63700-19-6</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tools/Instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MALDI-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Autoflex</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal block heater</td>
			<td>Long Yang Scientific Instruments</td>
			<td>Thermoshaker HB20</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermocycler</td>
			<td>Hema</td>
			<td>9600</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Enzyme and Kits:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10&#215;Ligation buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B69</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5&#215;PrimeSTAR buffer</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9158A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alkaline phosphatase</td>
			<td>ThermoFisher FastAP</td>
			<td>EF0654</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">COX reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTTGACCAAAAACATAAGACATG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cutsmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dNTP mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUGD reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MgUXS reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND forward primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ND reverse primer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cleanup Kit</td>
			<td>AxyGen</td>
			<td>AP-PCR-250</td>
			<td>*Alternative distributors possible</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET-30a(+) vector</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>69909</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a converging strategy for the generation of a virtually sequenced cdna library from unreferenced pacific oysters

Yeni hücre hatları veya genom sıralama projelerinin geliştirilmesi gibi önemli deneylerde daha önce kullanılan referans türlerinin biyolojik malzemesine erişim, genellikle daha fazla çalışmalar veya üçüncü şahıslar için sağlamak zordur numunelerin tüketici doğası. Şimdi yaygın Asya, Avustralya ve Kuzey Amerika 'nın Pasifik kıyılarında dağıtılan rağmen, bireysel Pasifik Oyster örnekleri genetik olarak oldukça çeşitlidir ve bu nedenle doğrudan gen kütüphaneler için başlangıç malzemesi olarak uygun değildir. Bu yazıda, cDNA kitaplıkları oluşturmak için bölgesel deniz ürünleri pazarlarından elde edilen başvurulmayan Pasifik Oyster örneklerinin kullanımını gösteriyoruz. Bu kütüphaneler daha sonra halka açık istiridye genomu ile karşılaştırıldığında ve en yakın ilgili Kütüphane mitokondriyal referans genler sitokrom C oksidaz altbirim ı (COX1) ve NADH dehydrogenase (ND) kullanılarak seçildi. Oluşturulan cDNA kütüphanesinin uygunluğu Ayrıca, UDP-Xylose ' in biyosentezi için sorumlu olan, UDP-glukuronik asit dehidrojenaz (UGD) ve UDP-Xylose sentaz (uxs) enzimlerini kodlayan iki genin klonlanması ve ifadesiyle gösterilmiştir. UDP-glikoz.

Şekil 1 , Pasifik Oyster bireylerinden türetilen yakınsak cDNA kütüphanesinin açıklanan hazırlık yönteminin şematik bir özetini gösterir. Şekil 2 , referans malzemenin COX1 ve ND gen dizilerinden yüksek sapma sahip, uzaktan ilgili bir istiridye örneğinin COX1 ve ND genlerinin sıralarını gösterir. Şekil 3 , referans materyalinin COX1 ve ND gen dizilerinden düşük sapma sahip, yakından ilgili bir istiridye ör...

Watch this Scientific Journal Video about A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters at JoVE.com

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

Başvurulmayan Pasifik Oyster örneklerinden RNA örneklerinin nasıl kullanılacağı ve neredeyse sıralı bir cDNA Kütüphanesi oluşturmak için kamuya açık genom verileriyle karşılaştırıldığında genetik malzemeyi değerlendirmek için bir strateji tarif ediyoruz.

Referansta bulunmadığı Pasifik Istiridyeleri neredeyse sıralı cDNA Kütüphanesi üretimi için bir converging stratejisi

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

Bu yöntemle ele almak istediğimiz temel soru, biyoteknolojik olarak ilgili genlerin klonlanması için yerel gıda pazarlarından satın alınan malzemelerden alınan RNA örneklerini nasıl kullanabileceğimizdir? Burada, pasifik istiridyelerini bu yaklaşımı ve potansiyel daha fazla uygulamayı göstermek için bir vaka çalışması olarak kullanıyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı, istiridye örneklerinin geleneksel genom veya cDNA diziliminin atlatılabildiğidir.Bunun yerine, sitokrom c oksidaz alt birimi I ve NADH dehidrogenaz dizileri en yakından ilgili örneği seçmek için Pasifik istiridye halka açık referans dizileri ile karşılaştırıldı. Bu örnekten hazırlanan cDNA, biyoteknolojik olarak ilgili genlerin klonlanmasında doğrudan kullanılabilir ve bu genler genel dizi bilgileri kullanılarak seçilebilir. Prosedürü gösteren Yongmei Lyu ve Yuquan Li, Glycomics ve Glikan Biyomühendislik Araştırma Merkezi Nanjing Tarım Üniversitesi'nden iki lisansüstü öğrencileri olacaktır.İstiridye dokusu örneği hazırlamak için, her istiridye numunesinin yaklaşık geometrik merkezinden yaklaşık 100 miligram homojen yumuşak dokuyu kesmek için sterilize edilmiş bir neşter kullanın. Numuneyi 50 mililitre sıvı nitrojenle dolu bir harç içine aktarın. Flaş dondurulmuş istiridye dokusunu ince bir toz haline getirin.Steril 1.5 mililitrelik santrifüj tüpüiçine her numunenin dondurulmuş doku 75 miligram tartmak ve guanidinium tiyokyanat-fenol ekstraksiyon reaktif bir mililitre ile karıştırın. Bu yordamın en kritik adımı RNA çıkarma adımıdır. RNA bozulmasını en aza indirmek için, istiridye dokusu ve RNA çıkarma hasat arasındaki süreyi azaltmak esastır.Numuneyi 14, 000 kez g ve 4 santigrat derece 15 dakika santrifüj edin. Yeni bir 1.5 mililitrelik santrifüj tüp supernatant aktarın, kloroform 200 mikrolitre ekleyin ve karışım süt beyaz dönene kadar 10 ila 15 saniye boyunca bir girdap karıştırıcı üzerinde iyice karıştırın. Sonra, santrifüj daha önce olduğu gibi 15 dakika.200 mikrolitrelik pipetle, üst sulu tabakayı, interfazı bozmadan, 1,5 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpe dikkatlice aktarın. Santrifüj tüpüne 500 mikrolitre izopropil alkol ekleyin ve numuneleri karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Daha sonra örnekleri 20 dakika buzda bırakın.Santrifüj 14, 000 kez g ve sekiz dakika boyunca dört derece santigrat, ve supernatant çıkarın. Peleti bir mililitrede %75 etanolle yeniden askıya alın ve 14, 000 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj. Tüm supernatant çıkarın ve etanol yıkama tekrarlayın.Peletleri oda sıcaklığında altı dakika kurulayın. Daha sonra, kurutulmuş RNA peletini DEPC ile işlenmiş suyun 25 mikrolitresinde eritin ve tüpü buzda tutun. RNA örneklerini 24 saat içinde kullanın.Bir cDNA kitaplığı oluşturmak için, önce el yazmasına göre çözeltiler ekleyerek 300 mikrolitrelik bir PCR tüpteki her RNA numunesi için bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Tüp içine çıkarılan RNA örneğinin bir mikrolitresini ekleyin. Karışımı bir PCR termocycler'da 60 dakika 42 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve sıcaklığı 5 dakika boyunca 95 dereceye yükseltin.Oluşturulan cDNA kitaplığını eksi 20 santigrat derecede 12 aya kadar saklayın. İlk olarak, el yazmasına göre hazırlanan PCR karışımları içeren tüplere oluşturulan cDNA kitaplığından bir mikrolitre ekleyin. PCR tüplerini PCR termocycler'a yerleştirin ve pcr amplifikasyonu ilk denatürasyon adımı ve bir uzama adımı, bir uzama adımı ve el yazmasına göre bir denatürasyon adımından oluşan 35 PCR reaksiyon döngüsüyle gerçekleştirin.Döngülerden sonra, beş dakika boyunca bir sonlandırma adımını gerçekleştirin. Agarose jel elektroforezinin kalitesini doğrulamak için PCR ürününün beş mikrolitresini kullanın. Güçlendirilmiş COX1 veya ND genini sırasıyla 759 veya 748 baz çiftlerinde tek bir bant olarak gözlemleyin.PCR ürünün geri kalanını arındırmak için, her numuneye yüksek oranda chaotropic tuz içeren 100 mikrolitre DNA bağlayıcı tampon ekleyin. Girdap kısaca içeriğini karıştırmak için. Bir arınma sütunu iki mililitrelik bir santrifüj tüpü içine yerleştirin.Pipet kolon içine reaksiyon karışımı. Oda sıcaklığında bir dakika için 14,000 kez g bir santrifüj monte sütun ile tüp yerleştirin. İki mililitrelik santrifüj tüpten filtrasyon attıktan sonra, 14,000 kez g santrifüj ederek 700 ve 400 mikrolitre yıkama çözeltisi W2 ile iki kez yıkayın.Sonra, bir mililitre deiyonize suyu 65 santigrat dereceye ısıtın. Sütunu yeni bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne ve önceden ısıtılmış deiyonize suyun 25 mikrolitrepipeti beyaz kolon zarının ortasına aktarın. Membran oda sıcaklığında bir dakika bekletin.Daha sonra, oda sıcaklığında bir dakika için 14, 000 kez g sütun ile tüp santrifüj. Sütunu atın ve saflaştırılmış PCR ürünlerini eksi 20 santigrat derecede 12 aya kadar saklayın. İsteğe bağlı olarak, COX1 veya ND ters astarlar da çift yönlü sıralama için kullanılabilir.Sanger sıralama için, ilgili COX1 veya ND ileri astar kullanın. Sıralama sonuçlarını aldıktan sonra, NCBI Nucleottide BLAST çevrimiçi aracını kullanarak dizileri Pasifik istiridye referans suşunun genom dizisi ile karşılaştırın. MgUGD ve MgUXS genlerinin daha önce yapıldığı gibi PCR ile güçlendirmek ve arındırmak için ilgili ileri ve ters astarları kullanın.Sindirim tamponu ile saflaştırılmış PCR ürünleri incubating sonra, 1.5 mililitrelik santrifüj tüp içinde pET-30a 500 nanogram eriterek önceden sindirilmiş pET-30a vektör hazırlamak ve 16 mikrolitre kadar kontüzyonlu su ekleyin. Daha sonra, tüp içine 10 kez konsantre sindirim tampon ve 20 birim kısıtlama enonukleases Nde1 ve Xho1 her biri bir mikrolitre iki mikrolitre ekleyin. Karışımı 37 derecede üç saat kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, bir birim alkali fosfataz bir mikrolitre ekleyin ve ek bir saat için 37 derece santigrat de kuluçka. Daha sonra, alkali fosfataz inaktive etmek için 10 dakika boyunca 75 santigrat derece önceden ısıtılmış metal blok ısıtıcı tüp yerleştirin. MgUGD ve MgUXS genleri taşıyan E.coli BL21 hücreleri yetiştirdikten sonra, iki litrelik sallayarak şişe 400 mililitrelik LB orta içine kültür aktarmak, ve 37 santigrat derece sıcaklıkta 200 rpm bir shaker üzerine yerleştirin.Üç saat sonra, 600 nanometre dalga boyunda bir fotometre üzerinde optik yoğunluğu kontrol edin ve yaklaşık 0,5 bir emilime ulaştığından emin olun. Sonra shaker sıcaklığını 20 santigrat dereceye düşürün. Üç saat boyunca rekombinant proteinlerin ekspresyonunu indüklemek için tek molar IPTG 400 mikrolitre ekleyin.Hücreleri hasat sonra, dört santigrat derece 20 dakika sonication tarafından hücreleri bozabilir. Santrifüj 14, 000 kez g ve 20 dakika için dört derece santigrat, ve aktivite testi için yeni bir tüp içinde supernatant toplamak. Aktivite tadına varmadıktan sonra, MgUXS ve MgUGD karışımlarına 20 mikrolitre metanol ve 40 mikrolitre kloroform ekleyerek reaksiyonları söndürün.Girdap örnek karışımları ve santrifüj 14, 000 kez g altı dakika ve dört derece santigrat için. MALDI-TOF kütle spektrometresi için yeni tüpler her tüpün üst sulu tabakasıtoplayın. Bu deneyde, son derece farklı bir numunenin COX1 ve ND gen dizilerinin dizi hizalaması Pasifik istiridye suşu referansı ile karşılaştırıldı.Kırmızı oklar referans sırası ile elde edilen cDNA örneklerinin sırası arasındaki nükleotit farklılıklarını gösterir. Yakından ilişkili bir istiridye örneğinin COX1 ve ND genlerinin dizileri, Pasifik istiridye suşreferansından düşük sapma göstermektedir. MALDI-TOF kütle spektrometresi, endüstriyel olarak ilgili mgugd ve MgUXS genlerini klonlamak için cDNA kütüphanesinin başarılı bir şekilde uygulanmasını göstermektedir.Jel görüntü de udp-glukuronik asit ve UDP-ksyoz art arda ifade ve saflaştırılmış MgUGD ve MgUXS enzimatik eylem tarafından oluşturulan tanımlar. Bu yöntem, referans sırası ve elde edilen işaretleyici dizileri arasında mükemmel bir eşleşme gerektirmez ve araştırmacıya referanssız istiridyelerle çalışması için güven vermelidir. Prensip olarak, bu yöntem, yakından ilişkili bir referans türünden dizilerin kamuya açık olduğu referanssız biyolojik numunelere uygulanabilir.Bu yöntem, uzman olmayan araştırmacıların potansiyel biyolojik öneme sahip genetik materyallere kolayca erişmelerine izin verir ve daha fazla bilim adamının kolayca erişilebilen ancak tam olarak tanımlanmış biyolojik örneklerle çalışmasının önünü açmaktadır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Bir Laboratuvar Ölçekli Sentetik Örümcek İpek Üretimi

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

DNA Origami bir Bio-duyarlı Robot Tasarımı

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Cilt Tip I Kolajen hazırlanması için geliştirilmiş bir yöntem

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Zaman-of-flight Kütle Spektrometre ile 2D Gaz Kromatografisi Kullanarak Alg Hidrotermal Sıvılaşma gelen Sulu Kesir Nitel Karakterizasyonu

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Sıvı özleri geleneksel sigara duman ve elektronik sigara Aerosol gelen nesil için aygıt mikroişlemci işletilen

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Önceden Biçimlendirilmiş Mikrobubbles'tan Membran Filtreli Faz KaydırmaLı Decafluorobutane Nanodroplets Üretimi

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Mikromakine Mikroakışkan Platformda Basitleştirilmiş Üç Boyutlu Çip Üzerinde Cilt Modeli Üretimi

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...