Name: in vivo direct reprogramming of resident glial cells into interneurons by intracerebral injection of viral vectors
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors at JoVE.com

<p class="jove_content">تم تمويل مارسيلا بيرتلي من قبل برنامج أفق الاتحاد الأوروبي 2020 (H2020-MSCA-ITN-2015) في إطار شبكات التدريب المبتكرة ماري سكلودوسكا كوري واتفاق المنح رقم 676408. تم تمويل دانييلا رايلاندر أوتوسون من قبل مجلس البحوث السويدي (2017-01234).</p>

<ol>
	<li>Barker, R. A., Parmar, M., Studer, L., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Trials+of+Stem+Cell-Derived+Dopamine+Neurons+for+Parkinson&#39;s+Disease:+Dawn+of+a+New+Era.">Human Trials of Stem Cell-Derived Dopamine Neurons for Parkinson&#39;s Disease: Dawn of a New Era.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Stem Cell</em>. <b>21</b> (5), 569-573 (2017).</li><li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy.">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> <em style='font-style: italic'>Science</em>. <b>344</b> (6180), 1240622 (2014).</li><li>Parmar, M., Torper, O., Drouin-Ouellet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+therapy+for+Parkinson&#39;s+disease:+A+journey+through+decades+toward+the+light+side+of+the+Force.">Cell-based therapy for Parkinson&#39;s disease: A journey through decades toward the light side of the Force.</a> <em style='font-style: italic'>European Journal of Neuroscience</em>. , (2018).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Reports</em>. <b>12</b> (3), 474-481 (2015).</li><li>Su, Z., Niu, W., Liu, M. L., Zou, Y., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+conversion+of+astrocytes+to+neurons+in+the+injured+adult+spinal+cord.">In vivo conversion of astrocytes to neurons in the injured adult spinal cord.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Communication</em>. <b>5</b>, 3338 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascl1+Converts+Dorsal+Midbrain+Astrocytes+into+Functional+Neurons+In+Vivo.">Ascl1 Converts Dorsal Midbrain Astrocytes into Functional Neurons In Vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neuroscience</em>. <b>35</b> (25), 9336-9355 (2015).</li><li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+Alzheimer&#39;s+disease+model.">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer&#39;s disease model.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Stem Cell</em>. <b>14</b> (2), 188-202 (2014).</li><li>Grande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+impact+on+direct+neuronal+reprogramming+in+vivo+in+the+adult+brain.">Environmental impact on direct neuronal reprogramming in vivo in the adult brain.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Communication</em>. <b>4</b>, 2373 (2013).</li><li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+astrocytes+to+neuroblasts+in+the+adult+brain.">In vivo reprogramming of astrocytes to neuroblasts in the adult brain.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Cell Biology</em>. <b>15</b> (10), 1164-1175 (2013).</li><li>Weinberg, M. S., Criswell, H. E., Powell, S. K., Bhatt, A. P., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vector+Reprogramming+of+Adult+Resident+Striatal+Oligodendrocytes+into+Functional+Neurons.">Viral Vector Reprogramming of Adult Resident Striatal Oligodendrocytes into Functional Neurons.</a> <em style='font-style: italic'>Molecular Therapy</em>. <b>25</b> (4), 928-934 (2017).</li><li>Pereira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Resident+NG2+Glia+into+Neurons+with+Properties+of+Fast-Spiking+Parvalbumin-Containing+Interneurons.">Direct Reprogramming of Resident NG2 Glia into Neurons with Properties of Fast-Spiking Parvalbumin-Containing Interneurons.</a> <em style='font-style: italic'>Stem Cell Reports</em>. <b>9</b> (3), 742-751 (2017).</li><li>Rivetti di Val Cervo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+functional+dopamine+neurons+from+human+astrocytes+in+vitro+and+mouse+astrocytes+in+a+Parkinson&#39;s+disease+model.">Induction of functional dopamine neurons from human astrocytes in vitro and mouse astrocytes in a Parkinson&#39;s disease model.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Biotechnology</em>. <b>35</b> (5), 444-452 (2017).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation.">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> <em style='font-style: italic'>Molecular Therapy Methods &#38; Clinial Development</em>. <b>10</b>, 1-7 (2018).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+neurons+via+direct+conversion+in+vivo.">Generation of induced neurons via direct conversion in vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America</em>. <b>110</b> (17), 7038-7043 (2013).</li><li>Kawaguchi, Y., Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+physiological+subgroupings+of+nonpyramidal+cells+with+parvalbumin-+and+calbindinD28k-immunoreactive+neurons+in+layer+V+of+rat+frontal+cortex.">Correlation of physiological subgroupings of nonpyramidal cells with parvalbumin- and calbindinD28k-immunoreactive neurons in layer V of rat frontal cortex.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neurophysiology</em>. <b>70</b> (1), 387-396 (1993).</li><li>Grealish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A9+dopamine+neuron+component+in+grafts+of+ventral+mesencephalon+is+an+important+determinant+for+recovery+of+motor+function+in+a+rat+model+of+Parkinson&#39;s+disease.">The A9 dopamine neuron component in grafts of ventral mesencephalon is an important determinant for recovery of motor function in a rat model of Parkinson&#39;s disease.</a> <em style='font-style: italic'>Brain</em>. <b>133</b> (Pt 2), 482-495 (2010).</li><li>Thompson, L., Barraud, P., Andersson, E., Kirik, D., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dopaminergic+neurons+of+nigral+and+ventral+tegmental+area+subtypes+in+grafts+of+fetal+ventral+mesencephalon+based+on+cell+morphology,+protein+expression,+and+efferent+projections.">Identification of dopaminergic neurons of nigral and ventral tegmental area subtypes in grafts of fetal ventral mesencephalon based on cell morphology, protein expression, and efferent projections.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neuroscience</em>. <b>25</b> (27), 6467-6477 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content">وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.</p>

<p class="jove_content">في الجسم الحي إعادة البرمجة المباشرة يمكن أن يتحقق باستخدام ناقلات AAV FLEX في سلالات الماوس التعبير عن Cre. من المهم ملاحظة أنه قد لوحظت اختلافات بين سلالات الماوس فيما يتعلق بفعالية إعادة البرمجة. لفي إعادة برمجة الجسم الحي في striatum، وقد ثبت خط الماوس NG2-Cre لتكون أكثر كفاءة بالمقارنة مع سلالات أخرى. قبل البدء في استخدام سلالة حيوانية جديدة، من المهم التحقق من المبادئ التوجيهية لموفر الماوس فيما يتعلق بالتعبير عن Cre مع مرور الوقت، حيث أن عمر الحيوانات غالباً ما يؤثر على خصوصية هذا التعبير البروتيني. في دراساتنا، لم تستخدم الحيوانات التي يزيد عمرها عن 12 أسبوعاً في إعادة برمجة الجسم الحي حيث كان هناك خطر على التعبير عن الكري في خلايا أخرى غير NG2 glia. وينصح الوجود المستمر ورصد الحيوانات التحكم حقن فقط مع شنابسين-فليكس-GFP البناء. وهذا يسمح برصد الحيوانات للخلايا الإيجابية GFP التي لا ينبغي أن تكون موجودة إذا لم يتم استخدام أي الجينات إعادة برمجة (ALN).</p>
<p class="jove_content">لتحديد الخلايا العصبية المعاد برمجتها حديثا، طريقة تحديد الخلايا العصبية الخاصة مثل تلك الموصوفة في هذا البروتوكول هي ذات أهمية قصوى. وهذا يسمح لتحديد وتمييز السليم من الخلايا العصبية المعاد برمجتها من الخلايا المحيطة الذاتية التي لها أهمية خاصة عند إعادة البرمجة في منطقة متجانسة.</p>
<p class="jove_content">من المهم أيضا استهداف الهيكل الصحيح للحقن الفيروسي. ولذلك، فإن جراحة مجسمة للحقن الفيروسي مهمة وتحتاج إلى التعامل معها بدقة، وخاصة عند استهداف هياكل أصغر من الدماغ.</p>
<p class="jove_content">لقد أظهرنا في السابق<sup class="xref">11</sup> أنه لا يمكن الاعتماد على التنبؤ بنتائج إعادة البرمجة في الجسم الحي على أساس تجارب إعادة البرمجة في المختبر باستخدام نفس عوامل إعادة البرمجة. وبالتالي فإن جميع عوامل الاهتمام تحتاج إلى اختبار في الجسم الحي. في أيدينا, العديد من تركيبات عوامل مختلفة تعطي نفس النوع الفرعي من الخلايا العصبية (أي, بين الخلايا العصبية<sup class="xref">11</sup> في الجسم الحي) على الرغم من حقيقة أن هذه الجينات قد تورطت في تطوير الخلايا العصبية الأخرى.</p>
<p class="jove_content">مشبك التصحيح كامل الخلية للخلايا العصبية المعاد برمجتها هو تقنية حساسة ومعالجة الأنسجة أمر مهم للحصول على نتيجة جيدة. التسريب مع حل كريبس الجليد الباردة يحسن نوعية الأنسجة. أيضا، الخلايا العصبية مصححة تحتاج إلى أن تعامل بعناية. حتى لو كان النضج والهوية الفينوتية من الخلايا العصبية المعاد برمجتها يمكن تقييمها إلى حد ما باستخدام المشبك التصحيح الخلية الكاملة, هذه الخلايا ليست قابلة للمقارنة تماما لنظرائهم الذاتية. وينبغي استخدام أنواع إضافية من التحليل، مثل تسلسل الجينوم (مثل تسلسل الحمض النووي الريبي) لزيادة تأكيد هوية الخلايا المعاد برمجتها.</p>
<p class="jove_content">ويمكن النظر في التقنية الموصوفة هنا لتطوير العلاجات المستقبلية حيث هناك حاجة إلى استبدال الخلايا العصبية في الدماغ. على الرغم من أن إعادة البرمجة في الجسم الحي لا تزال في مراحلها المبكرة وترجمتها إلى البشر لم تكن متوقعة بعد، فإن هذه التقنية يمكن أن توفر طريقة لتقييم وظيفة الجينات الخارجية في الدماغ ودراسة نضج الخلايا في الجسم الحي.</p>

<p class="jove_content">الهدف العام لهذه الطريقة هو تحويل بكفاءة glia المقيم الدماغ في الجسم الحي إلى الخلايا العصبية وظيفية وsubtype محددة مثل parvalbumin التعبير عن الخلايا العصبية. وهذا يوفر خطوة إلى الأمام نحو تطوير بديل بديل للخلايا استبدال العلاج لأمراض الدماغ دون الحاجة إلى مصدر خلية خارجية. كما أنه يخلق أداة لدراسة مفاتيح مصير الخلية في الموقع.</p>
<p class="jove_content">الدماغ لديه قدرة محدودة فقط لتوليد الخلايا العصبية الجديدة. لذلك ، في الأمراض العصبية ، هناك حاجة إلى مصادر الخلايا الخارجية لإصلاح الدماغ. لهذا، تعرضت مصادر مختلفة من الخلايا لأبحاث مكثفة على مر السنين، بما في ذلك الخلايا<sup class="xref"></sup>من الأنسجة الأولية، والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية والخلايا المعاد برمجتها 1،<sup></sup><sup class="xref">2،</sup><sup></sup><sup class="xref">3</sup>. إعادة برمجة مباشرة من خلايا الدماغ المقيمة في الخلايا العصبية هو النهج الأخير الذي يمكن أن توفر طريقة جذابة لإصلاح الدماغ كما أنه يستخدم خلايا المريض الخاصة لتوليد الخلايا العصبية الجديدة داخل الدماغ. حتى الآن، وقد أظهرت عدة تقارير في إعادة برمجة الجسم الحي من خلال تسليم ناقلات الفيروسية في الدماغ<sup class="xref">4</sup><sup>،</sup><sup class="xref">5</sup><sup>،</sup><sup class="xref">6</sup><sup>،</sup><sup class="xref">7</sup><sup class="xref">8</sup><sup>،</sup><sup class="xref">9</sup> في مناطق الدماغ المختلفة مثل القشرة، الحبل الشوكي، السترياتوم ومنتصف الدماغ<sup class="xref">5،</sup><sup></sup><sup class="xref">10،</sup><sup></sup><sup class="xref">11،</sup>وكذلك في الدماغ سليمة وآفة<sup class="xref">5،</sup><sup></sup><sup class="xref"></sup><sup>8،</sup><sup class="xref">11،</sup><sup></sup><sup class="xref">12.</sup> وقد تم الحصول على كل من الخلايا العصبية المثبطة والمحفزة<sup class="xref">4</sup><sup>,</sup><sup class="xref">8</sup>, ولكن النمط الظاهري الدقيق أو وظيفة هذه الخلايا لم يتم تحليلها بعد بالتفصيل.</p>
<p class="jove_content">في هذا البروتوكول، ونحن نصف إعادة برمجة أكثر كفاءة وتحديد خلية محددة من الخلايا العصبية في الجسم الحي إعادة برمجتها. نحن نقدم بروتوكول اعادة التقييم الوظيفي للنضج العصبي وتوصيف النمط الظاهري على أساس الوظائف والصفات المناعية الكيميائية.</p>
<p class="jove_content">استخدمنا ناقل AAV Cre-inducible ومراسل GFP لتحديد الخلايا العصبية في الجسم الحي إعادة برمجتها. هذا الاختيار من ناقلات الفيروسية لديه ميزة إصابة كل من الخلايا القسمة وغير المقسمة في الدماغ، وزيادة عدد الخلايا المستهدفة، كبديل لاستخدام الفيروس الرجعي<sup class="xref">7</sup><sup>،</sup><sup class="xref">8</sup>. وقد مكّننا مراسل FLEX الذي يحركه المشبك العصبي (GFP) من الكشف عن الخلايا العصبية التي تم إنشاؤها حديثًا على وجه التحديد. وقد استخدمت الدراسات السابقة المروجين نوع فرعي محدد لفي إعادة برمجة الجسم الحي<sup class="xref">7</sup><sup>،</sup><sup class="xref">9</sup>، التي تسمح أيضا التعبير عن إعادة برمجة الجينات والصحفيين في أنواع محددة من الخلايا. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة تتطلب المزيد من تحديد الخلايا العصبية المعاد برمجتها عن طريق تحليل ما بعد الوفاة للتعبير المشترك للمراسل وعلامات الخلايا العصبية. استخدام مراسل الخلايا العصبية الخاصة، مثل واحد الموصوفهنا، يسمح لتحديد الهوية المباشرة. وهذا يوفر دليلا مباشرا على نجاح التحويل ويسمح لتحديد الخلية الحية المطلوبة للفيزيولوجيا الكهربائية التصحيح المشبك.</p>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CA-FLEX</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>38042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>67291</td>
			<td>NM_008553.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lmx1a</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>33013</td>
			<td>NM_0033652.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nurr1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>35000</td>
			<td>NM_013613.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-syn</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>30456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoxP (FLEX) sequence 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac<br/>gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc<br/>accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg<br/>acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa<br/>gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga<br/>agaggctctaga</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoxP (FLEX) sequences 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tactagtataacttcgtataggatactttatac<br/>gaagttatcattgggattcttcctattttgatc<br/>caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct<br/>caccatcgacccataacttcgtatagcatacat<br/>tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa<br/>ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDP5</td>
			<td>Plasmid Factory</td>
			<td>PF435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDP6</td>
			<td>Plasmid Factory</td>
			<td>PF436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)+ Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85120602-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>10078780</td>
			<td>175 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris H-CL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td>
			<div>
			<div>For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>EDTA: Invitrogen</td>
			<td>EDTA: AM9260G</td>
			<td>
			<div>
			<div>For TE buffer use 1 mM EDTA</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>see Ultrapure water system</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>2.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>
			<div>
			<div>FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>
			<div>
			<div>For lysis Buffer: 1 mM</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge sealing tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Quick-Seal&#174;&#160;Polypropylene Tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep&#8482;&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-mL syringe-18G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>?</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anion exchange filter</td>
			<td>PALL laboratory</td>
			<td>MSTG25Q6</td>
			<td>
			<div>
			<div>Acrodisc unit with Mustang Q membrane</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z740210-24EA</td>
			<td>
			<div>
			<div>Amicon Ultra-4 device</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A33073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Novatech</td>
			<td>30209-1232</td>
			<td>
			<div>
			<div>CGGCCTCAGFGAGCGA</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#180;FAM / 3&#180;BHQ1 probe</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millex-GV filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -20 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge +4 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV viral room</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Water system</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Milli-Q&#174; IQ 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>2540 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase Chain Reaction (PCR)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative PCR (qPCR)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler&#174; 480 System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>ANIMAL MODEL</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2-Cre mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>NG2-CrexB6129, Stock #008533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolfurane</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>Dilute to 1% solution with warm water.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Viroderm</td>
			<td>7511&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td>P0500000</td>
			<td>
			<div>
			<div>i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blu</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrobeads</td>
			<td>Lumafluor</td>
			<td>R170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>From RSG Solingen.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-1552</td>
			<td>From Biochem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>232-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>232-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RSGA106.621</td>
			<td>Number 20.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RSGA106.200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting Europe</td>
			<td>51500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ear bars</td>
			<td>Stoelting Europe</td>
			<td>51648</td>
			<td>5 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with Removable needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>65</td>
			<td>
			<div>
			<div>0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capilaries</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary puller</td>
			<td>Sutter company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>1464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>GT420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Chamber and pump</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>8323101</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z118400-30EA</td>
			<td>25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z192414&#160;Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Braintree scientific, inc</td>
			<td>53800M</td>
			<td>
			<div>
			<div>From Covidien 2187.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton gauze</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Elfa Distrelec</td>
			<td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-366-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>-H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl<sub>2</sub>-6 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl<sub>2</sub>-6 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO<sub>3</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>
			<div>
			<div>see Ultrapure Water system</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1 or 2M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-D-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#8217;-2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1675&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C239&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass pipette</td>
			<td>Sutter Company</td>
			<td>B150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary puller</td>
			<td>Sutter company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WaterBath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>Use at a concentration of 4%.&#160;CAUTION:&#160;PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td>
			<div>
			<div>Use at a concentration of 0.1%.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10254640</td>
			<td>
			<div>
			<div>Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td>
			<div>
			<div>Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20&#176;C,&#160;light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>
			<div>
			<div>1: 600 in KPBS-T.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin- Cy3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434315</td>
			<td>1:5000, rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD65/67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
			<td>1:2000, mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:200, goat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chat</td>
			<td>Merk</td>
			<td>AB143</td>
			<td>1:5000, rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NPY</td>
			<td>Immunostar</td>
			<td>22940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NIST200B</td>
			<td>1:1000, chicken.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10981</td>
			<td>
			<div>
			<div>Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO&#174;, antifading</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-freeze solution</td>
			<td>Tissue Pro Technology</td>
			<td>AFS05-1000N, 1000 mL/ea.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8 laser scanning confocal microscope.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo direct reprogramming of resident glial cells into interneurons by intracerebral injection of viral vectors

<p class="jove_content">تحويل glia المقيم في الدماغ إلى الخلايا العصبية الوظيفية وsubtype محددة في الجسم الحي يوفر خطوة إلى الأمام نحو تطوير العلاجات البديلة استبدال الخلايا في حين أيضا خلق أدوات لدراسة مصير الخلية في الموقع. حتى الآن، كان من الممكن الحصول على الخلايا العصبية عن طريق إعادة برمجة في الجسم الحي، ولكن النمط الظاهري الدقيق لهذه الخلايا العصبية أو كيف تنضج لم يتم تحليلها بالتفصيل. في هذا البروتوكول، ونحن نصف تحويل أكثر كفاءة وتحديد خلية محددة من الخلايا العصبية في الجسم الحي إعادة برمجتها، وذلك باستخدام نظام ناقلات الفيروسية المستندة إلى AAV. كما نقدم بروتوكولاً للتقييم الوظيفي للنضج العصبي للخلايا المعاد برمجتها. عن طريق حقن ناقلات استئصال الوجه (FLEX)، التي تحتوي على إعادة برمجة والجينات مراسل يحركها المشبك إلى أنواع محددة من الخلايا في الدماغ التي تعمل كهدف لإعادة برمجة الخلايا. تسمح هذه التقنية بتحديد الخلايا العصبية المعاد برمجتها حديثًا بسهولة. تظهر النتائج أن الخلايا العصبية المعاد برمجتها التي تم الحصول عليها ناضجة وظيفيا مع مرور الوقت، وتلقي الاتصالات متشابك وتظهر الخصائص الكهرولوجية لأنواع مختلفة من الخلايا العصبية البينية. باستخدام عوامل النسخ Ascl1، Lmx1a وNurr1، فإن غالبية الخلايا المعاد برمجتها لها خصائص الخلايا العصبية البينية التي تحتوي على البارافيلوبينات بسرعة.</p>

<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">يتم استخدام حقن ناقلات AAV لإعادة برمجة بنجاح الخلايا NG2 glia المقيمة في الخلايا العصبية في striatum الماوس NG2-Cre (الشكل<strong class="xfig">1A).</strong> لاستهداف NG2 glia على وجه التحديد، يتم إدراج ناقلات FLEX مع الجينات إعادة البرمجة / مراسل، في اتجاه مضاد للتحسس وتحيط بها اثنين من أزواج من مواقع loxP المضادة للاوازيال ، غير المتجانسة (<strong class="xfig">الشكل 1B</strong>). يتم وضع كل من الجينات الثلاثة إعادة برمجة (Ascl1, Lmx1a وNurr1) تحت سيطرة المروج CBA في كل مكان على ناقلات الفردية. من أجل التأكد من أن التعبير GFP يقتصر على الخلايا العصبية المعاد برمجتها الناشئة من خلية التعبير عن Cre، يتم وضع GFP تحت سيطرة المروج متشابك الخلايا العصبية محددة، (أيضا في ناقلات FLEX).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">استخدام مزيج من إعادة برمجة وبنيات مراسل يسمح لتوليد الخلايا العصبية إيجابية GFP في striatum الماوس (الشكل<strong class="xfig">1C،</strong><strong>C').</strong> استخدام بناء مراسل دون وجود الجينات إعادة برمجة لا تسفر عن الخلايا العصبية إيجابية GFP (الشكل<strong class="xfig">1D).</strong></p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">الخلايا العصبية المعاد برمجتها التي تمتلئ بالبيوتاتين مرئية بعد الوفاة تلطيخ المناعة (الشكل<strong class="xfig">2A).</strong> إذا كان التحويل ناجحا، يجب أن يكون هناك مورفولوجيا الخلايا العصبية واسعة النطاق. التسجيلات الكهرولوجية للخلايا العصبية المعاد برمجتها تظهر وجود اتصالات وظيفية postsynaptic مع تدابير النشاط التلقائي (الشكل<strong class="xfig">2B،</strong><strong></strong>C). هذا يمكن أن تكون مسدودة إما مع غباجيكا أو مانع الجلوتاماتيك (Picrotoxin أو CNQX), مما يشير إلى كل من المدخلات المحفزة والمثبطة متشابك إلى الخلايا العصبية المعاد برمجتها. يزيد حدوث النشاط العفوي مع الحقن الفيروسي بعد الوقت (الشكل<strong class="xfig">2D)،</strong>مما يشير إلى النضج التدريجي.</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">إمكانات العمل الحالية الموجودة في الخلايا العصبية الوظيفية. زيادة إمكانات الإجراء في العدد مع مرور الوقت بعد التحويل (الشكل<strong class="xfig">2E).</strong> وهذا يشير كذلك إلى النضج في وظيفة الخلايا العصبية. في الخلايا العصبية غير ناضجة، والحالية سوف تحفز إما لا شيء أو عدد قليل جدا من إمكانات العمل (الشكل<strong class="xfig">2F).</strong></p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">أنماط إطلاق الخلايا العصبية هي نوع الخلية محددة لأنها تعتمد على عوامل مثل مورفولوجيا الخلايا وقناة التعبير<sup class="xref">15</sup>. يمكن تمييز الأنماط المسجلة في الخلايا العصبية المعاد برمجتها في الجسم الحي في مجموعات ومقارنتها بالأنواع الفرعية للخلايا العصبية الذاتية، على سبيل المثال الخلايا العصبية البينية السريعة (نوع الخلية B، <strong class="xfig">الشكل 3B)</strong>أو أنواع الخلايا الأخرى (الشكل<strong class="xfig">3A،</strong><strong>C، D </strong>). ويمكن تأكيد الاختلافات الكهرولوجية الملاحظة من خلال وجود علامات محددة من النوع الفرعي والتعبير المشترك مع GFP (الشكل<strong class="xfig">3E</strong><strong>-H).</strong> تماما، تشير هذه البيانات إلى أن الخلايا العصبية المعاد برمجتها الموجودة في striatum لها خصائص أنواع مختلفة من الخلايا العصبية البينية، مثل Parvalbumin-، ChAt- و NPY- التعبير عن الخلايا العصبية البينية، فضلا عن هوية الخلايا العصبية المتوسطة striatal (DARPP32 +) ( <strong class="xfig">الشكل 3 هاء</strong> <strong>-H).</strong></p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"><br><strong>الشكل 1: في إعادة برمجة الجسم الحي من NG2 glia المقيم في الخلايا العصبية.</strong> (أ) التمثيل التخطيطي لفيروس AAV بوساطة في إعادة برمجة الجسم الحي من الغليا NG2 striatal.<strong></strong> (B) التمثيل التخطيطي للبنيات AAV5 FLEX المستخدمة في إعادة برمجة الجسم الحي، والتي يتم فيها تنظيم التعبير الجيني من خلال التعبير Cre في الخلايا المستهدفة.<strong></strong> <strong>(C</strong> و <strong>C'</strong>) في الخلايا العصبية في الجسم الحي إعادة برمجتها، الناتجة عن سين-GFP + ALN حقن في Striatum. (D) عدم وجود الخلايا العصبية المعاد برمجتها عندما يتم إضافة أي عوامل إعادة برمجة في الكوكتيل الفيروسي، ويتم حقن بناء مراسل فقط في الجسم الحي.<strong></strong> قضبان المقياس = 100 مم (C)، 25 مم (C)،25 مم (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a></p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"><br><strong>الشكل 2: في الجسم الحي الخلايا العصبية المعاد برمجتها وظيفية وتظهر النضج مع مرور الوقت.</strong> (أ) الخلايا العصبية المعاد برمجتها مليئة بالبيوتين، يظهر مورفولوجيا الخلايا العصبية الناضجة، بما في ذلك العمود الفقري الددري.<strong></strong> آثار يظهر (<strong>B</strong>) النشاط المثبط (GABAergic) التي يتم حظرها مع picrotoxin, مضاد مستقبلات GABA<sub>A</sub> و (<strong>C)</strong>النشاط المحفز الذي يتم حظره مع CNQX, خصم مستقبلات AMPA. (د) يزيد عدد الخلايا العصبية ذات النشاط المصطفي مع مرور الوقت.<strong></strong> (E) الخلايا العصبية مصححة تظهر اطلاق النار المتكررة بالفعل في 5 أسابيع بعد الحقن (w.p.i.) والاستمرار في إظهار أنه في 8 و 12 w.p.i. (F) إمكانات العمل الناجمة حاليا والنشاط postynaptic من الخلايا العصبية غير ناضجة، وتظهر القليل متشابك<strong></strong><strong></strong> الأحداث وإمكانات العمل قليلة بالمقارنة مع B و D. مقياس شريط = 25 مم <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a></p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"><br><strong>الشكل 3: في الجسم الحي الخلايا العصبية المعاد برمجتها تظهر الخصائص المناعية الكيميائية والفسيولوجية للخلايا العصبية التخلالية.</strong> <strong>(A-D)</strong> أنماط إطلاق في الخلايا العصبية إعادة برمجة في<strong></strong>الجسم الحي يمكن أن تكون من أنواع متميزة: (أ) النوع A يشبه الخلايا العصبية الذاتية المتوسطة سبيني (DARPP32 +); (B) على غرار سريع التجسس (PV +) بين الخلايا العصبية.<strong></strong> (C) على غرار الخلايا العصبية تجسس عتبة منخفضة مع الترهل بارزة (NPY +);<strong></strong> (D) الخلايا العصبية اطلاق النار مع كبير بعد فرط الاستقطاب (دردشة +).<strong></strong> <strong>(هـ-هـ)</strong> الصور البؤرية التي تظهر التعريب المشترك لGFP وعلامات الخلايا العصبية البينية PV (<strong>E</strong>) ، ChAT (<strong>F</strong>) ، NPY (<strong>G</strong>) ، وعلامات الخلايا العصبية الإسقاط DARPP32 (<strong>H</strong>). جميع القضبان مقياس = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank"></a> 50 ملم.</p>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors at JoVE.com

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

في فيفو إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الغلية المقيمة في الخلايا العصبية المشتركة عن طريق الحقن داخل الدماغ من ناقلات الفيروسية

<p class="jove_content">يهدف هذا البروتوكول إلى توليد الخلايا العصبية البينية المعاد برمجتها مباشرة في الجسم الحي، وذلك باستخدام نظام فيروسي قائم على AAV في الدماغ ومراسل GFP يعمل على إزالة المشبك المرن، والذي يسمح بتحديد الخلايا والمزيد من التحليل في الجسم الحي.</p>

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

<p>هذا البروتوكول يدل على أنه من الممكن لتوليد الخلايا العصبية الجديدة مباشرة في الدماغ من غليا المقيمين وأن هذه الخلايا إعادة برمجتها تنضج في الخلايا العصبية الفرعية الخاصة. الميزة الرئيسية هي فيروس AAV المعتمد على العقيدة الذي يتيح استهدافًا محددًا لـ NG2-glia ومراسل GFP الذي يصنف الخلايا العصبية التي تمت إعادة برمجتها للتحليل. قد يؤدي توليد الخلايا العصبية الجديدة في الدماغ إلى التطور المستقبلي لعلاجات استبدال الخلايا في الدماغ.</p><p>في بروتوكولنا نولد التورين الإيجابي البارفالومين التي لها آثار على الاضطرابات النفسية. في الجسم الحي يمكن تطبيقها على المناطق الأخرى في الدماغ والدوائر اعتمادا على ما النمط الظاهري العصبي والحالة العصبية التي تريد استهدافها. سوف يكون إثبات الإجراء جيني جوهانسون:فني، ماريا بيريرا: طالبة دكتوراه سابقة، ومارسيلا بيرتيل: طالبة دكتوراه في مختبرنا.</p><p>لإنتاج AAV5 ناقلات الفيروسية، بذور خلايا HEK293T مع ثقافة متوسطة القياسية في خمس قارورة T175. عندما تصل الخلايا إلى 50 إلى 70٪ التقاء، وإعداد مزيج التالية لtransvection. في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر، إضافة كميات متساوية من الزهو المولي من بلازميد ناقلات، وpDG سلسلة المساعد plasmid.</p><p>أضف مخزن تريس-EDTA المؤقت إلى حجم نهائي يبلغ 144 ميكرولترات ثم أضف الماء فائق الpure لينتج عنه حجم إجمالي قدره 1296 ميكرولترات ومزيج. بعد ذلك، أضف 144 ميكرولترات من كلوريد الكالسيوم المولر 2.5 ومزيج. بعد ذلك، أضف 1.92 ملليلتر من HBS إلى محلول الحمض النووي ودوة الدوامة على الفور.</p><p>احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 ثانية بالضبط. في وقت لاحق، نقل الحل إلى 28 ملليلتر من ثقافة الخلية الطازجة المتوسطة ومزيج. استبدل الوسيطة في القارورة بالوسيط الذي يحتوي على مزيج ترانسفيككشن.</p><p>انتظر لمدة ثلاثة أيام، ونقل وسائل الإعلام إلى النفايات. إضافة خمسة ملليلتر من مخزن الحصاد المؤقت لكل قارورة، ثم إضافة أربعة ملليلترات أخرى من DPBS إلى كل قارورة لشطف الخلايا المتبقية وتجمع مع حل الخلية. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المحصودة في 1،000 س ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.</p><p>بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الماذرة وحل الكريه في 15 ملليلتر من عازلة التحلل. تجميد أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر على الجليد الجاف لمدة 15 دقيقة وتخزينها في ثلاجة ناقص 20 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، ذوبان الخلية المقطوعة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.</p><p>في هذا الإجراء، قم بإجراء تنقية AAV بواسطة iodixanol التدرج فائق الrifugation واستخدام أنابيب السقف فائقة النقاء مع الطرد المركزي في 350، 000 x ز لمدة ساعة واحدة و 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لاستخراج AAV التي تحتوي على المرحلة، أدخل حقنة 10 ملليلتر مع إبرة قياس 18 في حوالي مليمترين تحت الحد 40 إلى 60٪ مرحلة مع شطبة تواجه صعودا والانسحاب. تأكد من التوقف قبل الوصول إلى نطاق البروتين بعد استخراج خمسة إلى ستة ملليلترات من المتجه الفيروسي.</p><p>ثم، تنقية وتركيز التدرج الاوديكسول المخفف من خلال مرشح تبادل أنيون، عن طريق دفعها من خلال بمعدل لا أسرع من قطرة واحدة في الثانية الواحدة. في وقت لاحق، دفع ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت IE ببطء من خلال عامل التصفية لغسله. المقبل، elute الخليط في وحدة تصفية الطرد المركزي مع ملليلتر واحد إلى اثنين من عازلة elution.</p><p>إضافة DPBS إلى الجهاز إلى وحدة تخزين نهائية من أربعة ملليلتر. يتم ترك جهاز طرد مركزي في 2, 000 x ز في درجة حرارة الغرفة حتى أقل من 0.5 ملليلتر من DPBS في المرشح. بعد ذلك، إزالة السائل من الجزء السفلي من الأنبوب، إعادة ملء مع أربعة ملليلتر من DPBS، والطرد المركزي مرة أخرى.</p><p>كرر هذه الخطوة مرتين أكثر، تأكد من أن حجم ناقلات مركزة على مرشح حوالي 200 ميكرولترات بعد الطرد المركزي الماضي. إزالة 200 microliter ناقلات المركزة باستخدام ماصة، ودفعه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لتعقيم. بعد ذلك ، aliquot 200 microliters في قارورة زجاجية مع إدراج متشابكة.</p><p>لحقن عوامل إعادة البرمجة، ضع ماوس مخدر في إطار مجسم. إدارة مسكن مناسب في بداية الجراحة ، ثم جلب غيض من الشعرية الزجاجية من إبرة الحقن فقط فوق بريما. تأكد من أن طرف الشعرية مستقيم تماما في كل من طائرات A-P و M-L.</p><p>إعادة تعيين قيم M-L و A-P إلى 0.0 على العداد الإحداثيات الرقمية. للتأكد من رأس الحيوان في وضع مسطح تماما، استخدم مضادة الإحداثيات الرقمية لقياس قيمة تنسيق D-V عندما يكون ذراع A-P عند زائد 2.0 و -2.0 وكذلك عندما يكون الذراع M-L عند زائد 2.0 و -2.0. ضبط ارتفاع شريط الأسنان وأشرطة الأذن وفقا لذلك.</p><p>بعد ذلك، رفع حقنة قليلا وحفر حفرة باستخدام حفر الأسنان في إحداثيات الحقن. ابدأ في الحفر في الموقع ، والعمل بطريقة دائرية ولطيفة. ثم، ضع قطعة من الشاش القطني على شق مفتوح ونظف الحقنة بمحلول ملحي.</p><p>بعد التنظيف، ورسم فقاعة الهواء ثم ميكرولتر واحد من الحل الذي يحتوي على ناقلات الفيروسية. تأكد من أن الحل الفيروسي يمكن تصورها بسهولة تحت فقاعة الهواء. بعد ذلك، قم بخفض الحقنة، وتتقدم ببطء إلى العمق المطلوب، وتأكد من أن المسار واضح من شظايا العظام.</p><p>وفي وقت لاحق، حقن ميكرولتر واحد من الحل الفيروسي بمعدل 0.4 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة. عندما يتم الحقن، والسماح لمدة دقيقتين للنشر قبل انسحاب حقنة. بعد الانتشار ، اسحب الحقنة ببطء حتى يتم سحب طرف الشعيرات الدموية تمامًا من الدماغ ، ثم خياطة الشق بعناية وإزالة الحيوان من الإطار المجسم.</p><p>راقب الحيوان في محطة ما بعد الجراحة حتى يستعيد الوعي. يتم الاحتفاظ بالحيوانات لمدة تصل إلى 12 أسبوعًا بعد حقن الفيروس للسماح للجليا المقيم بإعادة برمجتها إلى الخلايا العصبية الناضجة. لإعداد شرائح الدماغ للفيزياء الكهربائية باستخدام هزاز، قسم الدماغ من الجزء الأكثر التراسترالية وصولا الى مستوى الستراتتال بسرعة عالية.</p><p>ثم قسم في 275 ميكرومتر في 0.1 ملليمتر في الثانية. بعد كل قسم، وإزالة بعناية الجانب غير حقن striatal ونقل الجانب حقن في قارورة مع صافي أسفل والأكسجين شريحة الإحساس CREB في حمام الماء في درجة حرارة الغرفة. الحفاظ على القارورة في درجة حرارة الغرفة حتى يتم قطع جميع المقاطع.</p><p>بعد ذلك، ببطء زيادة درجة حرارة الحمام المائي إلى 37 درجة مئوية وتركها لمدة 30 دقيقة، ثم إيقاف سخان والسماح لها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. بعد نقل قسم واحد من الأنسجة إلى غرفة تسجيل للفيزياء الكهربائية، قم بتركيب الماصات الزجاجية على قطب التسجيل وخفضه في المحلل. تحقق من مقاومة القطب.</p><p>ثم، ببطء الاقتراب من الخلية التي أعيد برمجتها مع ماصة، والحفاظ على ضغط إيجابي طفيف في القطب لتجنب توصيل طرف، والتحقق من أن الخلية هي GFP إيجابية قبل الترقيع. عندما يتم تصحيح الخلية، والحفاظ على الخلية في المشبك الحالي من ناقص 60 إلى ناقص 70 ملليفولت، وحقن 500 التيارات ميلي ثانية من ناقص 20 إلى زائد 90 picoamperes مع 10 الزيادات picoampere للحث على إمكانات العمل. وهذا يدل على نضوج الخلايا العصبية وإعادة برمجة ناجحة.</p><p>في وقت لاحق، والتحول إلى المشبك الجهد وقياس الصوديوم الداخلي وتأخر تصحيح التيارات البوتاسيوم في الخطوات النازل من 10 millivolts. هنا هو آخر المسجلة biocytin شغل الخلايا العصبية التي تظهر مورفولوجيا الخلايا العصبية ناضجة والعمود الفقري التشعب. هنا، التسجيلات الكهربائية الفيزيولوجية للخلايا العصبية التي أعيد برمجتها تظهر وجود اتصالات وظيفية ما بعد المينابتيكية مع تدابير النشاط العفوية.</p><p>تظهر الآثار النشاط المثبط الذي يتم حظره مع picrotoxin ، خصم مستقبلات GABAA والنشاط المثير الذي يتم حظره مع CNQX ، خصم مستقبلات AMPA. تظهر الخلايا العصبية المصححة بالفعل نشاط ما بعد الحقن في خمسة أسابيع بعد الحقن ، وتستمر في ثمانية أسابيع و 12 أسبوعًا بعد الحقن. عدد الخلايا العصبية مع إمكانات العمل الحالية المستحثة يزيد أيضا مع مرور الوقت.</p><p>وكشف تحليل أكثر تفصيلا العديد من أنماط اطلاق النار متميزة حيث تظهر غالبية الخلايا سريع ارتفاع النشاط مماثلة لparvalbumin interneurons. أظهر التحليل المناعي الكيميائي في 12 أسبوعًا المزيد من التعبير المشارك للمراسل GFP وparvalbumin. بعد هذا الإجراء يمكنك فحص التعبير الجيني مع التصحيح البحث عن تقنية أو تقييم الاتصال متشابك ثلاثي الأبعاد مع تتبع monosynaptic و iDISCO.</p><p>الآن أنه من الممكن إعادة برمجة غليا المقيم في parvalbumin التعبير عن interneurons، بدأنا التحقيق في ما إذا كانت هذه هي أصيلة ويمكن استخدامها كأداة علاجية. تذكر أن تتبع البروتوكولات والمبادئ التوجيهية المعمول بها عند التعامل مع الحيوانات واستخدام فيروس AAV.</p>

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

داخل القحف حقن الغدة المرتبطة ناقلات فيروسية

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

حقن الدم ذاتي النزيف الدماغي الداخلي النموذجي لالعفوي في الفئران

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by <em>in vivo</em> Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة<em> في الجسم الحي</em> Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by <em>In Utero</em> Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل<em&gt; في الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

النسب-إعادة برمجة الخلايا المشتقة من خلية حوطية الدماغ البشري الكبار في الخلايا العصبية المستحثة

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

الحوفي-النهج تحت الشبكية حقن الفيروسية المتجهات للعلاج الجيني في الفئران الشبكية الظهارة الصبغية

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Intracerebroventricular وداخل الأوعية الدموية حقن الفيروسية الجسيمات ونيون ميكروبيدات في الدماغ حديثي الولادة

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

غرس القنية إلى ماجنا تشيستيرنا من القوارض

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

نموذج الفئران من إزالة المزيل القشرية الدماغية على نطاق واسع الناجمة عن الحقن داخل الدماغ من السيتوكينات الموالية للالتهابات

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...