Name: in vivo direct reprogramming of resident glial cells into interneurons by intracerebral injection of viral vectors
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors at JoVE.com

<p class="jove_content">Marcella Birtele er blevet finansieret af den Europæiske Unions Horisont 2020 program (Horisont 2020-MSCA-ITN-2015) under Marie Skłodowska-Curie innovative uddannelsesnet og tilskudsaftale nr. 676408. Daniella Rylander Ottosson er blevet finansieret af det svenske Forskningsråd (2017-01234).</p>

<ol>
	<li>Barker, R. A., Parmar, M., Studer, L., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Trials+of+Stem+Cell-Derived+Dopamine+Neurons+for+Parkinson&#39;s+Disease:+Dawn+of+a+New+Era.">Human Trials of Stem Cell-Derived Dopamine Neurons for Parkinson&#39;s Disease: Dawn of a New Era.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Stem Cell</em>. <b>21</b> (5), 569-573 (2017).</li><li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy.">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> <em style='font-style: italic'>Science</em>. <b>344</b> (6180), 1240622 (2014).</li><li>Parmar, M., Torper, O., Drouin-Ouellet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+therapy+for+Parkinson&#39;s+disease:+A+journey+through+decades+toward+the+light+side+of+the+Force.">Cell-based therapy for Parkinson&#39;s disease: A journey through decades toward the light side of the Force.</a> <em style='font-style: italic'>European Journal of Neuroscience</em>. , (2018).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Reports</em>. <b>12</b> (3), 474-481 (2015).</li><li>Su, Z., Niu, W., Liu, M. L., Zou, Y., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+conversion+of+astrocytes+to+neurons+in+the+injured+adult+spinal+cord.">In vivo conversion of astrocytes to neurons in the injured adult spinal cord.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Communication</em>. <b>5</b>, 3338 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascl1+Converts+Dorsal+Midbrain+Astrocytes+into+Functional+Neurons+In+Vivo.">Ascl1 Converts Dorsal Midbrain Astrocytes into Functional Neurons In Vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neuroscience</em>. <b>35</b> (25), 9336-9355 (2015).</li><li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+Alzheimer&#39;s+disease+model.">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer&#39;s disease model.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Stem Cell</em>. <b>14</b> (2), 188-202 (2014).</li><li>Grande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+impact+on+direct+neuronal+reprogramming+in+vivo+in+the+adult+brain.">Environmental impact on direct neuronal reprogramming in vivo in the adult brain.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Communication</em>. <b>4</b>, 2373 (2013).</li><li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+astrocytes+to+neuroblasts+in+the+adult+brain.">In vivo reprogramming of astrocytes to neuroblasts in the adult brain.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Cell Biology</em>. <b>15</b> (10), 1164-1175 (2013).</li><li>Weinberg, M. S., Criswell, H. E., Powell, S. K., Bhatt, A. P., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vector+Reprogramming+of+Adult+Resident+Striatal+Oligodendrocytes+into+Functional+Neurons.">Viral Vector Reprogramming of Adult Resident Striatal Oligodendrocytes into Functional Neurons.</a> <em style='font-style: italic'>Molecular Therapy</em>. <b>25</b> (4), 928-934 (2017).</li><li>Pereira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Resident+NG2+Glia+into+Neurons+with+Properties+of+Fast-Spiking+Parvalbumin-Containing+Interneurons.">Direct Reprogramming of Resident NG2 Glia into Neurons with Properties of Fast-Spiking Parvalbumin-Containing Interneurons.</a> <em style='font-style: italic'>Stem Cell Reports</em>. <b>9</b> (3), 742-751 (2017).</li><li>Rivetti di Val Cervo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+functional+dopamine+neurons+from+human+astrocytes+in+vitro+and+mouse+astrocytes+in+a+Parkinson&#39;s+disease+model.">Induction of functional dopamine neurons from human astrocytes in vitro and mouse astrocytes in a Parkinson&#39;s disease model.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Biotechnology</em>. <b>35</b> (5), 444-452 (2017).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation.">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> <em style='font-style: italic'>Molecular Therapy Methods &#38; Clinial Development</em>. <b>10</b>, 1-7 (2018).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+neurons+via+direct+conversion+in+vivo.">Generation of induced neurons via direct conversion in vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America</em>. <b>110</b> (17), 7038-7043 (2013).</li><li>Kawaguchi, Y., Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+physiological+subgroupings+of+nonpyramidal+cells+with+parvalbumin-+and+calbindinD28k-immunoreactive+neurons+in+layer+V+of+rat+frontal+cortex.">Correlation of physiological subgroupings of nonpyramidal cells with parvalbumin- and calbindinD28k-immunoreactive neurons in layer V of rat frontal cortex.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neurophysiology</em>. <b>70</b> (1), 387-396 (1993).</li><li>Grealish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A9+dopamine+neuron+component+in+grafts+of+ventral+mesencephalon+is+an+important+determinant+for+recovery+of+motor+function+in+a+rat+model+of+Parkinson&#39;s+disease.">The A9 dopamine neuron component in grafts of ventral mesencephalon is an important determinant for recovery of motor function in a rat model of Parkinson&#39;s disease.</a> <em style='font-style: italic'>Brain</em>. <b>133</b> (Pt 2), 482-495 (2010).</li><li>Thompson, L., Barraud, P., Andersson, E., Kirik, D., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dopaminergic+neurons+of+nigral+and+ventral+tegmental+area+subtypes+in+grafts+of+fetal+ventral+mesencephalon+based+on+cell+morphology,+protein+expression,+and+efferent+projections.">Identification of dopaminergic neurons of nigral and ventral tegmental area subtypes in grafts of fetal ventral mesencephalon based on cell morphology, protein expression, and efferent projections.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neuroscience</em>. <b>25</b> (27), 6467-6477 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content">Forfatterne har intet at afsløre.</p>

<p class="jove_content">In vivo direkte omprogrammering kan opnås ved hjælp af AAV FLEX vektorer i CRE-udtrykke muse stammer. Det er vigtigt at bemærke, at forskelle mellem muse stammer med hensyn til omprogrammering effekt er blevet observeret. For in vivo omprogrammering i striatum har NG2-CRE-muse linjen vist sig at være mere effektiv sammenlignet med andre stammer. Før du begynder at bruge en ny dyrestamme, er det vigtigt at kontrollere musen udbyder retningslinjer vedrørende CRE udtryk over tid, da dyrenes alder ofte påvirker specificiteten af dette protein udtryk. I vores studier blev dyr over 12 uger ikke anvendt til in vivo-omprogrammering, da der var en risiko for CRE-ekspression i andre celler end NG2 glia. Den konstante tilstedeværelse og overvågning af kontroldyr injiceres kun med Synapsin-FLEX-GFP konstruktion tilrådes. Dette gør det muligt at overvåge dyrene for GFP-positive celler, der ikke bør være til stede, hvis der ikke anvendes genprogrammerings gener (ALN).</p>
<p class="jove_content">For at identificere de nyligt omprogrammerede neuroner er en neuron-specifik identifikationsmetode som den, der er beskrevet i denne protokol, af allerstørste vigtighed. Dette giver mulighed for en korrekt identifikation og skelnen af de omprogrammerede neuroner fra de endogene omgivende celler, der er af særlig relevans, når omprogrammering i en homotopic region.</p>
<p class="jove_content">Det er også vigtigt at målrette den korrekte struktur for viral injektion. Derfor er den stereotaxiske kirurgi for viral injektion vigtig og skal gribes an med nøjagtighed, især når de er rettet mod mindre strukturer i hjernen.</p>
<p class="jove_content">Vi har tidligere vist<sup class="xref">11</sup> , at det ikke er pålideligt at forudsige resultatet af in vivo omprogrammering baseret på in vitro omprogrammering eksperimenter ved hjælp af de samme omprogrammering faktorer. Alle interesse faktorer skal derfor testes in vivo. I vores hænder giver mange forskellige faktor kombinationer den samme subtype af neuroner (dvs. interneuroner<sup class="xref">11</sup> in vivo) på trods af, at disse gener har været impliceret i udviklingen af andre neuroner.</p>
<p class="jove_content">Helcelle patch klemme til omprogrammerede neuroner er en delikat teknik og vævs behandling er vigtig for et godt resultat. Perfusion med Ice-Cold Krebs løsning forbedrer vævs kvaliteten. Også, lappet neuroner skal behandles omhyggeligt. Selv om modning og fænotypisk identitet af omprogrammerede neuroner kan vurderes noget ved hjælp af hele cellen patch clamp, disse celler er ikke fuldt ud sammenlignelige med deres endogene modparter. Yderligere analysetyper, såsom genom-sekvensering (f. eks. RNA-sekvensering), bør anvendes til yderligere at bekræfte omprogrammeret celle identitet.</p>
<p class="jove_content">Den teknik, der er beskrevet heri, kan overvejes til udvikling af fremtidige terapier, hvor neuronal udskiftning er nødvendig i hjernen. Selv om in vivo omprogrammering er stadig på sit tidlige stadier, og oversættelsen til mennesker er endnu ikke forudset, denne teknik kan give en metode til at vurdere eksogene gen funktion i hjernen og studere celle modning in vivo.</p>

<p class="jove_content">Det overordnede mål med denne metode er effektivt at omdanne hjernen Resident glia in vivo til funktionelle og subtype-specifikke neuroner såsom parvalbumin-udtrykker interneuroner. Dette giver et skridt fremad mod udviklingen af en alternativ celle substitutionsterapi for hjernesygdomme uden behov for en eksogene celle kilde. Det skaber også et værktøj til at studere celle skæbne afbrydere in situ.</p>
<p class="jove_content">Hjernen har kun en begrænset kapacitet til at generere nye neuroner. Derfor, i neurologiske sygdomme, der er behov for eksogene celle kilder til hjernen reparation. Til dette har forskellige kilder til celler været udsat for intens forskning gennem årene, herunder celler fra primær væv, stamcelle-afledte celler og omprogrammerede celler<sup class="xref">1</sup><sup>,</sup><sup class="xref">2</sup><sup>,</sup><sup class="xref">3</sup>. Direkte omprogrammering af residente hjerneceller til neuroner er en nylig tilgang, der kunne give en attraktiv metode til hjerne reparation, da det bruger patientens egne celler til at generere nye neuroner inde i hjernen. Til dato, flere rapporter har vist in vivo omprogrammering gennem viral vektor levering i hjernen<sup class="xref">4</sup><sup>,</sup><sup class="xref">5</sup><sup>,</sup><sup class="xref">6</sup><sup>,</sup><sup class="xref">7</sup><sup class="xref">8</sup><sup>,</sup><sup class="xref">9</sup> i forskellige hjerneområder såsom cortex, rygmarv, striatum og hjernen<sup class="xref">5</sup><sup>,</sup><sup class="xref">10</sup><sup>,</sup><sup class="xref">11</sup>, samt i intakt og læsioneret hjerne<sup class="xref">5</sup><sup>,</sup><sup class="xref">8</sup><sup>,</sup><sup class="xref">11</sup><sup>,</sup><sup class="xref">12</sup>. Både hæmmende og excitatoriske neuroner er opnået<sup class="xref">4</sup><sup>,</sup><sup class="xref">8</sup>, men den præcise fænotype eller funktionalitet af disse celler er endnu ikke blevet analyseret i detaljer.</p>
<p class="jove_content">I denne protokol beskriver vi en mere effektiv omprogrammering og celle specifik identifikation af in vivo-omprogrammerede neuroner. Vi leverer en protokol til funktionel vurdering af neuronal modning og fænotype karakterisering baseret på funktionalitet og immun histokemiske egenskaber.</p>
<p class="jove_content">Vi brugte en CRE-inducerbar AAV vektor og en GFP Reporter til at identificere in vivo reprogrammerede neuroner. Dette valg af virale vektorer har den fordel, at inficere både dividere og ikke-dividere celler i hjernen, øge antallet af målrettede celler, som et alternativ til brugen af retrovirus<sup class="xref">7</sup><sup>,</sup><sup class="xref">8</sup>. En neuron-specifik synapsin-driven FLEX reporter (GFP), gjorde det muligt for os specifikt at registrere de nyligt genererede neuroner. Tidligere undersøgelser har brugt subtype-specifikke initiativtagere til in vivo omprogrammering<sup class="xref">7</sup><sup>,</sup><sup class="xref">9</sup>, der også giver mulighed for ekspressions genprogrammering gener og journalister i specifikke celletyper. Denne metode kræver imidlertid yderligere identifikation af omprogrammerede neuroner ved post mortem analyse af co-ekspression af reporter og neuronal markører. Brugen af en neuron-specifik reporter, som den, der er beskrevet heri, giver mulighed for en direkte identifikation. Dette giver et direkte bevis på en vellykket konvertering og tillader en levende celle identifikation, der er nødvendig for patch-clamp Elektrofysiologi.</p>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CA-FLEX</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>38042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>67291</td>
			<td>NM_008553.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lmx1a</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>33013</td>
			<td>NM_0033652.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nurr1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>35000</td>
			<td>NM_013613.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-syn</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>30456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoxP (FLEX) sequence 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac<br/>gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc<br/>accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg<br/>acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa<br/>gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga<br/>agaggctctaga</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoxP (FLEX) sequences 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tactagtataacttcgtataggatactttatac<br/>gaagttatcattgggattcttcctattttgatc<br/>caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct<br/>caccatcgacccataacttcgtatagcatacat<br/>tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa<br/>ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDP5</td>
			<td>Plasmid Factory</td>
			<td>PF435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDP6</td>
			<td>Plasmid Factory</td>
			<td>PF436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)+ Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85120602-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>10078780</td>
			<td>175 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris H-CL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td>
			<div>
			<div>For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>EDTA: Invitrogen</td>
			<td>EDTA: AM9260G</td>
			<td>
			<div>
			<div>For TE buffer use 1 mM EDTA</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>see Ultrapure water system</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>2.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>
			<div>
			<div>FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>
			<div>
			<div>For lysis Buffer: 1 mM</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge sealing tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Quick-Seal&#174;&#160;Polypropylene Tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep&#8482;&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-mL syringe-18G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>?</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anion exchange filter</td>
			<td>PALL laboratory</td>
			<td>MSTG25Q6</td>
			<td>
			<div>
			<div>Acrodisc unit with Mustang Q membrane</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z740210-24EA</td>
			<td>
			<div>
			<div>Amicon Ultra-4 device</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A33073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Novatech</td>
			<td>30209-1232</td>
			<td>
			<div>
			<div>CGGCCTCAGFGAGCGA</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#180;FAM / 3&#180;BHQ1 probe</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millex-GV filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -20 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge +4 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV viral room</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Water system</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Milli-Q&#174; IQ 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>2540 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase Chain Reaction (PCR)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative PCR (qPCR)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler&#174; 480 System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>ANIMAL MODEL</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2-Cre mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>NG2-CrexB6129, Stock #008533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolfurane</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>Dilute to 1% solution with warm water.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Viroderm</td>
			<td>7511&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td>P0500000</td>
			<td>
			<div>
			<div>i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blu</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrobeads</td>
			<td>Lumafluor</td>
			<td>R170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>From RSG Solingen.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-1552</td>
			<td>From Biochem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>232-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>232-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RSGA106.621</td>
			<td>Number 20.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RSGA106.200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting Europe</td>
			<td>51500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ear bars</td>
			<td>Stoelting Europe</td>
			<td>51648</td>
			<td>5 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with Removable needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>65</td>
			<td>
			<div>
			<div>0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capilaries</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary puller</td>
			<td>Sutter company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>1464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>GT420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Chamber and pump</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>8323101</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z118400-30EA</td>
			<td>25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z192414&#160;Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Braintree scientific, inc</td>
			<td>53800M</td>
			<td>
			<div>
			<div>From Covidien 2187.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton gauze</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Elfa Distrelec</td>
			<td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-366-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>-H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl<sub>2</sub>-6 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl<sub>2</sub>-6 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO<sub>3</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>
			<div>
			<div>see Ultrapure Water system</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1 or 2M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-D-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#8217;-2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1675&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C239&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass pipette</td>
			<td>Sutter Company</td>
			<td>B150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary puller</td>
			<td>Sutter company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WaterBath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>Use at a concentration of 4%.&#160;CAUTION:&#160;PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td>
			<div>
			<div>Use at a concentration of 0.1%.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10254640</td>
			<td>
			<div>
			<div>Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td>
			<div>
			<div>Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20&#176;C,&#160;light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>
			<div>
			<div>1: 600 in KPBS-T.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin- Cy3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434315</td>
			<td>1:5000, rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD65/67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
			<td>1:2000, mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:200, goat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chat</td>
			<td>Merk</td>
			<td>AB143</td>
			<td>1:5000, rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NPY</td>
			<td>Immunostar</td>
			<td>22940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NIST200B</td>
			<td>1:1000, chicken.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10981</td>
			<td>
			<div>
			<div>Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO&#174;, antifading</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-freeze solution</td>
			<td>Tissue Pro Technology</td>
			<td>AFS05-1000N, 1000 mL/ea.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8 laser scanning confocal microscope.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo direct reprogramming of resident glial cells into interneurons by intracerebral injection of viral vectors

<p class="jove_content">Konvertering Resident glia i hjernen til funktionelle og subtype-specifikke neuroner in vivo giver et skridt fremad mod udviklingen af alternative celle udskiftning terapier samtidig skabe værktøjer til at studere celle skæbne in situ. Til dato har det været muligt at opnå neuroner via in vivo omprogrammering, men den præcise fænotype af disse neuroner eller hvordan de modne er ikke blevet analyseret i detaljer. I denne protokol beskriver vi en mere effektiv konvertering og celle specifik identifikation af in vivo-omprogrammerede neuroner ved hjælp af et AAV-baseret viral vektorsystem. Vi tilbyder også en protokol til funktionel vurdering af de omprogrammerede cellernes neuronal modning. Ved at injicere flip-excision (FLEX) vektorer, der indeholder omprogrammering og synapsin-driven reporter gener til specifikke celletyper i hjernen, der tjener som mål for celle omprogrammering. Denne teknik giver mulighed for nem identifikation af nyligt omprogrammerede neuroner. Resultaterne viser, at de opnåede reprogrammerede neuroner funktionelt modne over tid, modtage synaptiske kontakter og vise elektrofysiologiske egenskaber af forskellige typer af interneuroner. Ved hjælp af transkriptionsfaktorerne Ascl1, Lmx1a og Nurr1, de fleste af de omprogrammerede celler har egenskaber af hurtigtspiking, parvalbumin-holdige interneuroner.</p>

<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">Injektion af AAV-vektorer bruges til at omprogrammere residente NG2 glia-celler til neuroner i NG2-CRE-muse striatum (<strong class="xfig">figur 1a</strong>). For specifikt at målrette NG2 glia, er FLEX vektorer med omprogrammering/reporter gener indsat i en antisense retning og flankeret af to par anti parallelle, Heterotypiske loxP sites (<strong class="xfig">figur 1b</strong>). Hver af de tre omprogrammerings gener (Ascl1, Lmx1a og Nurr1) er placeret under kontrol af den allestedsnærværende CBA-promotor på individuelle vektorer. For at sikre, at GFP-udtrykket er begrænset til omprogrammerede neuroner, der stammer fra en CRE-ekspressig celle, er GFP placeret under kontrol af den neuron-specifikke synapsin-promotor (også i en FLEX-vektor).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">Brugen af kombinationen af omprogrammering og reporter konstruktioner giver mulighed for generering af GFP-positive neuroner i musens striatum (<strong class="xfig">figur 1c</strong><strong>, C '</strong>). Brugen af reporter konstruere uden tilstedeværelsen af omprogrammering gener ikke giver GFP-positive neuroner (<strong class="xfig">figur 1d</strong>).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">De omprogrammerede neuroner, der er biocytinfyldte, er synlige efter post mortem-immuno-farvning (<strong class="xfig">figur 2a</strong>). Hvis konvertering er vellykket, bør der være omfattende neuronal morfologi. De elektrofysiologiske optagelser af omprogrammerede neuroner viser tilstedeværelsen af postsynaptiske funktionelle forbindelser med spontane aktivitets foranstaltninger (<strong class="xfig">figur 2b</strong><strong>, C</strong>). Dette kan blokeres med enten ionotropic GABAergic eller glutamatergic blokker (picrotoxin eller cnqx), tyder både excitatoriske og hæmmende synaptisk input til de omprogrammerede neuroner. Forekomsten af spontan aktivitet stiger med tiden efter viral injektion (<strong class="xfig">figur 2D</strong>), hvilket indikerer en gradvis modning.</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">Nuværende-induceret action potentialer er til stede i funktionelle neuroner. Aktions potentialerne øges i antal over tid efter omregning (<strong class="xfig">figur 2E</strong>). Dette indikerer yderligere modning i neuronal funktion. I en umoden Neuron, vil strømmen fremkalde enten ingen eller meget få aktionspotentialer (<strong class="xfig">figur 2F</strong>).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">De fyring mønstre af en neuron er celletype specifik, da det afhænger af faktorer såsom morfologi af cellerne og kanal udtryk<sup class="xref">15</sup>. De registrerede mønstre i in vivo-omprogrammerede neuroner kan opdeles i grupper og sammenlignes med endogene neuronal subtypes, fx hurtigtspiking interneuroner (celle type B, <strong class="xfig">figur 3b</strong>) eller andre celletyper (<strong class="xfig">figur 3a</strong><strong>, C, D </strong>). De observerede elektrofysiologiske forskelle kan bekræftes ved tilstedeværelsen af specifikke subtype markører og co-Expression med GFP (<strong class="xfig">figur 3E</strong><strong>-H</strong>). Tilsammen indikerer disse data, at de omprogrammerede neuroner i striatum har egenskaber af forskellige typer af interneuroner, såsom Parvalbumin-, ChAt-og NPY-ekspanderende interneuroner, samt striatal medium spiny neuron identitet (DARPP32 +) ( <strong class="xfig">Figur 3E</strong> <strong>-H</strong>).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"><br><strong>Figur 1: in vivo omprogrammering af Resident NG2 glia til neuroner.</strong> <strong>A</strong>) skematisk gengivelse af AAV-virusmedieret in vivo-omprogrammering af STRIATAL NG2 glia. <strong>B</strong>) skematisk gengivelse af AAV5-Flex-konstruktioner, der anvendes til in vivo-omprogrammering, hvor genekspression reguleres af CRE-udtryk i målcellerne. (<strong>C</strong> og <strong>c '</strong>) in vivo omprogrammerede neuroner, som følge af syn-GFP + ALN injektion i striatum. <strong>D</strong>) fravær af omprogrammerede neuroner, når der ikke tilsættes omprogrammerings faktorer til viral cocktail, og kun reporter-konstruktionen injiceres in vivo. Skala stænger = 100 mm (C), 25 mm (C '), 25 mm (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a></p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"><br><strong>Figur 2: in vivo omprogrammerede neuroner er funktionelle og viser modning over tid.</strong> (<strong>A</strong>) biocytinfyldt omprogrammeret Neuron, viser moden neuronal morfologi, herunder dendritiske spines. Traces viser (<strong>B</strong>) inhiberende (gabaerge) aktivitet, der er blokeret med picrotoxin, en GABA<sub>en</sub> receptor antagonist og (<strong>C</strong>) excitatoriske aktivitet, der er blokeret med cnqx, en AMPA-receptor antagonist. (<strong>D</strong>) antallet af neuroner med postsynaptisk aktivitet stiger over tid. (<strong>E</strong>) lappet neuroner vise gentagne fyring allerede på 5 uger efter injektion (w.p.i.) og fortsætte med at vise, at ved 8 og 12 w.p.i. (<strong>F</strong>) nuværende-induceret virknings potentiale og postsynaptisk aktivitet af en umoden Neuron, viser få synaptisk begivenheder og få aktionspotentialer sammenlignet med B og D. Scale bar = 25 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a></p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"><br><strong>Figur 3: in vivo omprogrammerede neuroner udviser immun histokemiske og elektrofysiologiske egenskaber af striatal interneuroner.</strong> (<strong>A-D</strong>) Fyring mønstre af in vivo omprogrammerede neuroner kan være af forskellige typer: (<strong>a</strong>) type A svarer til endogene medium spiny neuron (DARPP32 +); (<strong>B</strong>) svarende til hurtigtspiking (PV +) interneuroner; (<strong>C</strong>) ligner lavtærskel spiking neuroner med fremtrædende sag (npy +); <strong>D</strong>) neuroner, som fyres med stor efter-hyperpolarisering (chat +). (<strong>E-H</strong>) Konfokale billeder, der viser samlokalisering af GFP og interneuron-markører PV (<strong>E</strong>), ChAT (<strong>F</strong>), npy (<strong>G</strong>) og Projection neuron Marker DARPP32 (<strong>H</strong>). Alle skala stænger = 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a></p>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors at JoVE.com

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In vivo direkte omprogrammering af residente Gliale celler til Interneuroner ved intracerebral injektion af virale vektorer

<p class="jove_content">Denne protokol har til formål at generere direkte omprogrammeret interneuroner in vivo, ved hjælp af et AAV-baseret viral system i hjernen og en FLEX synapsin-drevet GFP reporter, som giver mulighed for celle identifikation og yderligere analyse in vivo.</p>

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

<p>Denne protokol viser, at det er muligt at generere nye neuroner direkte i hjernen fra hjemmehørende glia, og at disse omprogrammerede celler modnes til subtype-specifikke neuroner. Den største fordel er den cre-afhængige AAV-virus, der muliggør specifik målretning af NG2-glia og GFP reporter, der mærker omprogrammerede neuroner til analyse. Generering af nye neuroner i hjernen kan føre til fremtidig udvikling for celleerstatningsbehandlinger i hjernen.</p><p>I vores protokol genererer vi parvalbumin-positive interneuroner, der har konsekvenser for psykiatriske lidelser. In vivo omprogrammering kan anvendes på andre hjerneområder og kredsløb afhængigt af, hvad neuronal fænotype og neurologisk tilstand, du ønsker at målrette. Demonstration af proceduren vil være Jenny Johansson: en tekniker, Maria Pereira: en tidligere ph.d.-studerende, og Marcella Birtele: en ph.d.-studerende i vores laboratorium.</p><p>For at producere AAV5 viral vektor, frø HEK293T celler med standard kultur medium i fem T175 kolber. Når cellerne når op på 50 til 70% sammenløb, forberedes følgende blanding til transvection. I en 50 milliliter centrifuge rør, tilsæt lige kindtand mængder af vektor plasmid, og pDG serie hjælper plasmid.</p><p>Tilføj Tris-EDTA buffer til et endeligt volumen på 144 mikroliter derefter tilføje ultrapure vand til at resultere i et samlet volumen på 1296 mikroliter og mix. Dernæst tilsættes 144 mikroliter af 2,5 molar calciumchlorid og bland. Derefter tilsættes 1,92 milliliter HBS til DNA-opløsningen og vortex med det samme.</p><p>Inkuber ved stuetemperatur i præcis 60 sekunder. Derefter overføres opløsningen til 28 milliliter frisk cellekulturmedium og blandes. Mediet i kolben erstattes med det medium, der indeholder transvection-blandingen.</p><p>Vent i tre dage, og overfør medierne til spilde. Der tilsættes fem milliliter høstbuffer til hver kolbe, hvortil der tilsættes yderligere fire milliliter DPBS til hver kolbe for at skylle de resterende celler og samle med celleopløsningen. Centrifuge de høstede celler ved 1, 000 x g i fem minutter ved fire grader Celsius.</p><p>Efter centrifugering fjernes supernatanten og pelleten opløses i 15 milliliter lysisbuffer. Fryse 50 milliliter centrifugerør på tøris i 15 minutter og opbevares i et minus 20 grader Celsius fryser. Før brug optø den høstede celle lysat i et vandbad ved 37 grader Celsius.</p><p>I denne procedure udføres AAV-rensning ved iodixanol gradient ultracentrifugering, og der anvendes ultracentrifugeloftrør med centrifugering ved 350, 000 x g i en time og 45 minutter ved stuetemperatur. For at udtrække AAV-holdstoffasen indsættes en 10 millilitersprøjte med en 18 gauge-nål på omkring to millimeter under 40 til 60%-fasegrænsen med facetten opad og trækkes tilbage. Sørg for at stoppe, før du når proteinbåndet efter fem til seks milliliter af den virale vektor er blevet ekstraheret.</p><p>Derefter rense og koncentrere den fortyndede iodixanol gradient gennem en anion udveksling filter, ved at skubbe den igennem med en hastighed ikke hurtigere end en dråbe per sekund. Tryk derefter tre milliliter IE-buffer langsomt gennem filteret for at vaske det. Dernæst eluter blandingen i en centrifugalfilterenhed med en til to milliliter elueringsbuffer.</p><p>Tilføj DPBS til enheden til et endeligt volumen på fire milliliter. Centrifuge ved 2,000 x g ved stuetemperatur, indtil der er mindre end 0,5 milliliter DPBS tilbage i filteret. Derefter fjernes væsken fra bunden af røret, genopfyldes med fire milliliter DPBS og centrifuge igen.</p><p>Gentag dette trin to gange mere, skal du sørge for, at mængden af koncentreret vektor på filteret er omkring 200 mikroliter efter den sidste centrifugering. Fjern den 200 mikroliter koncentrerede vektor ved hjælp af en pipette, og skub den gennem et 0,22 mikrometerfilter for at sterilisere. Dernæst aliquot 200 mikroliter i et glas hætteglas med låst indsætte.</p><p>For at indsprøjte omprogrammeringsfaktorer skal du placere en bedøvet mus i den stereoaksiske ramme. Administrere passende analgesi i begyndelsen af operationen, derefter bringe spidsen af glas kapillær af injektion nålen lige over bregma. Sørg for, at kapillærspidsen er helt lige i både A-P- og M-L-fly.</p><p>Nulstil både M-L- og A-P-værdierne til 0,0 på den digitale koordinattæller. For at sikre, at dyrets hoved er i en helt flad position, skal du bruge den digitale koordinattæller til at måle D-V-koordinatværdien, når A-P-armen er på plus 2,0 og minus 2,0, samt når M-L-armen er på plus 2,0 og minus 2,0. Juster højden af tandbjælken og ørestængerne i overensstemmelse hermed.</p><p>Derefter hæves sprøjten en smule og bores et hul ved hjælp af en tandboremaskine ved injektionskoordinaterne. Begynd at bore på stedet og arbejde på en cirkulær og skånsom måde. Derefter placere et stykke bomuld gaze over det åbne snit og skyl sprøjten med saltvand opløsning.</p><p>Efter skylning, udarbejde en luftboble og derefter en mikroliter af opløsning, der indeholder den virale vektor. Sørg for, at den virale opløsning let kan visualiseres under luftboblen. Sænk derefter sprøjten, og skrider langsomt til den ønskede dybde, og sørg for, at bane er fri for knoglefragmenter.</p><p>Derefter injiceres en mikroliter af den virale opløsning med en hastighed på 0,4 mikroliter pr. minut. Når injektionen er færdig, skal der gå to minutter til diffusion, før sprøjten trækkes tilbage. Efter diffusion, langsomt trække sprøjten, indtil spidsen af kapillær er helt trukket ud af hjernen, derefter forsigtigt sutur snittet og fjerne dyret fra stereotaxic ramme.</p><p>Overvåg dyret på en postoperativ station, indtil bevidstheden er genvundet. Dyrene holdes i op til 12 uger efter virusinjektion for at give hjemmehørende glia mulighed for at omprogrammere sig til modne neuroner. For at forberede hjerne skiver til elektrofysiologi ved hjælp af en vibratome, afsnit hjernen fra den mest rostrale del ned til striatal niveau ved høj hastighed.</p><p>Derefter afsnit striatum koronal på 275 mikrometer på 0,1 millimeter per sekund. Efter hver sektion fjernes den ikke-injicerede striatalside forsigtigt og den injicerede side overføres til et hætteglas med et bundnet og iltet CREB-sans i vandbadet ved stuetemperatur. Hold hætteglasset ved stuetemperatur, indtil alle sektionerne er skåret over.</p><p>Derefter langsomt øge temperaturen i vandbadet til 37 grader Celsius og lad det i 30 minutter, derefter slukke for varmelegeme og lad det køle ned til stuetemperatur. Når en vævssektion er overført til et optagelseskammer til elektrofysiologi, monteres glaspipetten på optageelektroden, og den sænkes ned i opløsningen. Dobbelttjek elektrodens modstand.</p><p>Derefter langsomt nærmer den omprogrammerede celle med pipetten, holde et lille positivt tryk i elektroden for at undgå at tilslutte spidsen, og kontrollere, at cellen er GFP positiv, før lappe. Når cellen er lappet, skal cellen i strømklemmen opretholdes fra minus 60 til minus 70 millivolt, og der injiceres 500 millisekundstrømninger fra minus 20 til plus 90 picoampere med 10 picoampere intervaller for at fremkalde handlingspotentialer. Dette er tegn på en neuronal modning og vellykket omprogrammering.</p><p>Skift derefter til spændingsklemme og mål det indadgående natrium og forsinkede udbedring af kaliumstrømterne ved afpoleringstrin på 10 millivolt. Her er et indlæg registreret biocytin fyldt omprogrammeret neuron, som viser modne neuronal morfologi og dendritiske pigge. Her viser elektrofysiologiske optagelser af de omprogrammerede neuroner tilstedeværelsen af postsynaptiske funktionelle forbindelser med spontane aktivitetsforanstaltninger.</p><p>Spor viser den hæmmende aktivitet, der er blokeret med picrotoxin, en GABAA receptor antagonist og excitatoriske aktivitet, der er blokeret med CNQX, en AMPA receptor antagonist. De lappede neuroner viser allerede postsynaptisk aktivitet efter fem uger efter injektionen og fortsætter ved otte og 12 uger efter injektionen. Antallet af neuroner med nuværende inducerede handling potentialer også stiger over tid.</p><p>En mere detaljeret analyse afslørede flere forskellige fyring mønstre, hvor de fleste celler viser hurtig spiking aktivitet svarende til parvalbumin interneurons. Immunhistokemisk analyse efter 12 uger viste yderligere co-ekspression af journalisten GFP og parvalbumin. Efter denne procedure kan du undersøge genekspressionen med patch søge teknik eller vurdere den tre-dimensionelle synaptiske forbindelse med monosynaptisk sporing og iDISCO.</p><p>Nu, hvor det er muligt at omprogrammere hjemmehørende glia i parvalbumin udtrykke interneurons, har vi begyndt at undersøge, om disse er autentiske og kan bruges som et terapeutisk redskab. Husk at følge de etablerede protokoller og retningslinjer, når du håndterer dyr og bruger AAV-virus.</p>

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by <em>in vivo</em> Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by <em>In Utero</em> Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Ekspansion af embryoniske og voksne neurale stamceller ved<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporering eller viral stereotaktisk injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering af pericyt-afledte Celler af Voksen Menneskelige hjerne til Inducerede Neuroner

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Limbal Approach-subretinal Injektion af virale vektorer til genterapi i mus retinale pigmentepitel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Intracerebroventrikulær og intravaskulær injektion af viruspartikler og fluorescerende Microbeads ind i Neonatal Brain

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Kanyle implantering i Cisterna Magna af gnavere

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Rottemodel af udbredt cerebral kortikal demyelinering induceret af en intracerebral injektion af proinflammatoriske cytokiner

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...