Name: in vivo direct reprogramming of resident glial cells into interneurons by intracerebral injection of viral vectors
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors at JoVE.com

<p class="jove_content">מרקלה בירטלה ממומנת על ידי האיחוד האירופי אופק 2020 תוכנית (H2020-MSCA-ITN-2015) תחת מארי Skłodowska-קירי רשתות הדרכה חדשנית וגרנט הסכם מס ' 676408. דניאלה רילנדר אוטקסון ממומנת על ידי מועצת המחקר השבדית (2017-01234).</p>

<ol>
	<li>Barker, R. A., Parmar, M., Studer, L., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Trials+of+Stem+Cell-Derived+Dopamine+Neurons+for+Parkinson&#39;s+Disease:+Dawn+of+a+New+Era.">Human Trials of Stem Cell-Derived Dopamine Neurons for Parkinson&#39;s Disease: Dawn of a New Era.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Stem Cell</em>. <b>21</b> (5), 569-573 (2017).</li><li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy.">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> <em style='font-style: italic'>Science</em>. <b>344</b> (6180), 1240622 (2014).</li><li>Parmar, M., Torper, O., Drouin-Ouellet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+therapy+for+Parkinson&#39;s+disease:+A+journey+through+decades+toward+the+light+side+of+the+Force.">Cell-based therapy for Parkinson&#39;s disease: A journey through decades toward the light side of the Force.</a> <em style='font-style: italic'>European Journal of Neuroscience</em>. , (2018).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Reports</em>. <b>12</b> (3), 474-481 (2015).</li><li>Su, Z., Niu, W., Liu, M. L., Zou, Y., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+conversion+of+astrocytes+to+neurons+in+the+injured+adult+spinal+cord.">In vivo conversion of astrocytes to neurons in the injured adult spinal cord.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Communication</em>. <b>5</b>, 3338 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascl1+Converts+Dorsal+Midbrain+Astrocytes+into+Functional+Neurons+In+Vivo.">Ascl1 Converts Dorsal Midbrain Astrocytes into Functional Neurons In Vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neuroscience</em>. <b>35</b> (25), 9336-9355 (2015).</li><li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+Alzheimer&#39;s+disease+model.">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer&#39;s disease model.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Stem Cell</em>. <b>14</b> (2), 188-202 (2014).</li><li>Grande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+impact+on+direct+neuronal+reprogramming+in+vivo+in+the+adult+brain.">Environmental impact on direct neuronal reprogramming in vivo in the adult brain.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Communication</em>. <b>4</b>, 2373 (2013).</li><li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+astrocytes+to+neuroblasts+in+the+adult+brain.">In vivo reprogramming of astrocytes to neuroblasts in the adult brain.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Cell Biology</em>. <b>15</b> (10), 1164-1175 (2013).</li><li>Weinberg, M. S., Criswell, H. E., Powell, S. K., Bhatt, A. P., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vector+Reprogramming+of+Adult+Resident+Striatal+Oligodendrocytes+into+Functional+Neurons.">Viral Vector Reprogramming of Adult Resident Striatal Oligodendrocytes into Functional Neurons.</a> <em style='font-style: italic'>Molecular Therapy</em>. <b>25</b> (4), 928-934 (2017).</li><li>Pereira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Resident+NG2+Glia+into+Neurons+with+Properties+of+Fast-Spiking+Parvalbumin-Containing+Interneurons.">Direct Reprogramming of Resident NG2 Glia into Neurons with Properties of Fast-Spiking Parvalbumin-Containing Interneurons.</a> <em style='font-style: italic'>Stem Cell Reports</em>. <b>9</b> (3), 742-751 (2017).</li><li>Rivetti di Val Cervo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+functional+dopamine+neurons+from+human+astrocytes+in+vitro+and+mouse+astrocytes+in+a+Parkinson&#39;s+disease+model.">Induction of functional dopamine neurons from human astrocytes in vitro and mouse astrocytes in a Parkinson&#39;s disease model.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Biotechnology</em>. <b>35</b> (5), 444-452 (2017).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation.">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> <em style='font-style: italic'>Molecular Therapy Methods &#38; Clinial Development</em>. <b>10</b>, 1-7 (2018).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+neurons+via+direct+conversion+in+vivo.">Generation of induced neurons via direct conversion in vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America</em>. <b>110</b> (17), 7038-7043 (2013).</li><li>Kawaguchi, Y., Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+physiological+subgroupings+of+nonpyramidal+cells+with+parvalbumin-+and+calbindinD28k-immunoreactive+neurons+in+layer+V+of+rat+frontal+cortex.">Correlation of physiological subgroupings of nonpyramidal cells with parvalbumin- and calbindinD28k-immunoreactive neurons in layer V of rat frontal cortex.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neurophysiology</em>. <b>70</b> (1), 387-396 (1993).</li><li>Grealish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A9+dopamine+neuron+component+in+grafts+of+ventral+mesencephalon+is+an+important+determinant+for+recovery+of+motor+function+in+a+rat+model+of+Parkinson&#39;s+disease.">The A9 dopamine neuron component in grafts of ventral mesencephalon is an important determinant for recovery of motor function in a rat model of Parkinson&#39;s disease.</a> <em style='font-style: italic'>Brain</em>. <b>133</b> (Pt 2), 482-495 (2010).</li><li>Thompson, L., Barraud, P., Andersson, E., Kirik, D., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dopaminergic+neurons+of+nigral+and+ventral+tegmental+area+subtypes+in+grafts+of+fetal+ventral+mesencephalon+based+on+cell+morphology,+protein+expression,+and+efferent+projections.">Identification of dopaminergic neurons of nigral and ventral tegmental area subtypes in grafts of fetal ventral mesencephalon based on cell morphology, protein expression, and efferent projections.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neuroscience</em>. <b>25</b> (27), 6467-6477 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content">. למחברים אין מה לגלות</p>

<p class="jove_content">ב vivo ישיר מתיכנות ניתן להשיג באמצעות וקטורים FLEX AAV ביצור-המבטא זנים של העכבר. חשוב לציין כי הבדלים בין זני העכבר לגבי יעילות תכנות משנה נצפו. עבור ב vivo מתיכנות משני בסטריאטום, קו העכבר NG2-יצורים הוכיחה להיות יעיל יותר בהשוואה זנים אחרים. לפני שמתחילים להשתמש זן חדש של בעלי חיים, חשוב לבדוק את הקווים המנחים של ספק העכבר לגבי ביטוי היצור לאורך זמן, כמו גיל של בעלי חיים לעיתים קרובות משפיע על הספציפיות של הביטוי הזה חלבון. במחקרים שלנו, בעלי חיים שגילם עולה על 12 שבועות לא שימשו בvivo תכנות כפי שהיה סיכון לביטוי היצור בתאים שאינם NG2 glia. הנוכחות הקבועה וניטור של בעלי חיים בקרה מוזרק רק עם סינפסין-FLEX-GFP המבנה מומלץ. זה מאפשר ניטור של בעלי החיים עבור תאים GFP-חיוביים כי לא צריך להיות נוכח אם אין גנים מתיכנות מראש (מאשר) משמשים.</p>
<p class="jove_content">כדי לזהות את הנוירונים החדשים שעוצבו מחדש, שיטת זיהוי ספציפית לנוירונים, כמו זו המתוארת בפרוטוקול זה, היא בעלת חשיבות עליונה. זה מאפשר זיהוי והבחנה נכונה של הנוירונים מתוכנת התכנות מתוך התאים האנדוגניים המקיפים כי הוא מאוד רלוונטיות כאשר תכנות מחודש באזור הומונושא.</p>
<p class="jove_content">חשוב גם למקד את המבנה הנכון עבור הזרקה ויראלי. לכן, הניתוח הסטרטקאני להזרקה ויראלי חשוב וצריך להתקרב אליו בדיוק, במיוחד כאשר מסמנים את המבנים הקטנים יותר של המוח.</p>
<p class="jove_content">בעבר הצגנו<sup class="xref">11</sup> כי זה לא אמין כדי לחזות את התוצאה של vivo תכנות מבוסס על ניסויים באמצעות התכנות מחוץ גופית באמצעות אותם גורמים תכנות משנה. לכן יש לבחון את כל גורמי העניין בvivo. בידינו, שילובים רבים גורמים שונים לתת את אותו סוג של נוירונים (כלומר, interneurons<sup class="xref">11</sup> ב vivo) למרות העובדה כי גנים אלה היו מעורבים בפיתוח של נוירונים אחרים.</p>
<p class="jove_content">כל תא מהדק תיקון עבור נוירונים מתוכנת מתכנתו היא טכניקה עדינה עיבוד רקמות חשוב לתוצאה טובה. Perfusion עם פתרון קרבס קר משפר את איכות הרקמה. גם, נוירונים שתוקנה צריך להיות מטופלים בזהירות. גם אם התבגרות וזהות פנוטימית של נוירונים מתוכנת שניתן להעריך במידת מה באמצעות מהדק טלאי תא שלם, תאים אלה אינם מקבילים באופן מלא לעמיתיהם האנדוגניים שלהם. סוגים נוספים של ניתוח, כגון רצף הגנום (למשל, רצפי RNA) יש להשתמש כדי לאשר עוד זהות תא מתוכנת.</p>
<p class="jove_content">הטכניקה המתוארת במסמך זה יכולה להיחשב לפיתוח טיפולים עתידיים שבהם נדרש תחליף עצבי במוח. למרות שvivo תכנות עדיין בשלבים המוקדמים שלה ואת התרגום לבני אדם עדיין לא מראש, טכניקה זו יכולה לספק שיטה כדי להעריך את התפקוד הגנטי האקסוגני במוח וללמוד תא התבגרות בvivo.</p>

<p class="jove_content">המטרה הכוללת של שיטה זו היא להמיר ביעילות את המוח תושב glia ב vivo לתוך הנוירונים פונקציונלי מסוג אחד ספציפיים כגון parvalbumin-הביע interneurons. זה מספק צעד קדימה לקראת הפיתוח של טיפול חלופי החלפת התא עבור מחלות המוח ללא צורך מקור תא אקסוסוגני. זה גם יוצר כלי לחקור את מתגי הגורל התא באתרו.</p>
<p class="jove_content">המוח יש רק קיבולת מוגבלת ליצירת נוירונים חדשים. לכן, במחלות נוירולוגיות, יש צורך של מקורות תא אקסוגני לתיקון המוח. בשביל זה, מקורות שונים של תאים נחשפו למחקר אינטנסיבי במהלך השנים, כולל תאים מרקמות ראשוני, תאי גזע הנגזרים תאים ותאים מתוכנת מחדש<sup class="xref">1</sup><sup>,</sup><sup class="xref">2</sup><sup>,</sup><sup class="xref">3</sup>. מחדש ישירות של תאי המוח תושב לתוך הנוירונים היא גישה האחרונות שיכול לספק שיטה אטרקטיבית לתיקון המוח כפי שהוא משתמש בתאים של החולה ליצירת נוירונים הרומן בתוך המוח. עד היום, מספר דיווחים הראו vivo תכנות מחדש באמצעות משלוח וקטורי ויראלי במוח<sup class="xref">4</sup><sup>,</sup><sup class="xref">5</sup><sup>,</sup><sup class="xref">6</sup><sup>,</sup><sup class="xref">7</sup><sup class="xref">8</sup><sup>,</sup><sup class="xref">9</sup> באזורי מוח שונים כגון הקליפה, חוט השדרה, סטריאטום והמוח המאמצע<sup class="xref">5</sup><sup>,</sup><sup class="xref">10,</sup><sup></sup><sup class="xref">11</sup>, כמו גם במוח השלם ולגירסה<sup class="xref">5</sup><sup>,</sup><sup class="xref">8</sup><sup>,</sup><sup class="xref">11</sup><sup>,</sup><sup class="xref">12</sup>. הן נוירונים מעכבות ומרגש הושגו<sup class="xref">4</sup><sup>,</sup><sup class="xref">8</sup>, אבל הפנוטיפ מדויק או פונקציונליות של תאים אלה עדיין לא נותחו בפרוטרוט.</p>
<p class="jove_content">בפרוטוקול זה, אנו מתארים התכנות יעיל יותר וזיהוי תא ספציפי של vivo נוירונים מתוכנת. אנו מספקים פרוטוקול להערכה תפקודית של ההבשלה העצבית והאפיון הפנוטיפ המבוסס על פונקציונליות ותכונות אימונוהיסטוכימיה.</p>
<p class="jove_content">השתמשנו inducible וקטור AAV של היצורים וכתבת GFP כדי לזהות את הנוירונים vivo מתוכנת. בחירה זו של וקטורים ויראלי יש את היתרון של הדבקה הן חלוקת תאים בלתי מפרידים של המוח, הגדלת מספר תאים ייעודיים, כחלופה לשימוש של רטרו וירוס<sup class="xref">7</sup><sup>,</sup><sup class="xref">8</sup>. כתבת FLEX (GFP) ספציפית לעצב-מסינפסין, אפשרה לנו לזהות במיוחד את הנוירונים שנוצרו לאחרונה. מחקרים קודמים השתמשו היזמים ספציפיים למשנה עבור ב vivo תכנות<sup class="xref">7</sup><sup>,</sup><sup class="xref">9</sup>, כי גם לאפשר את הביטוי של גנים התיכנות מראש וכתבים בסוגי תאים ספציפיים. עם זאת, שיטה זו מחייבת זיהוי נוסף של נוירונים מתוכנת על ידי ניתוח לאחר המוות של הביטוי המשותף של כתב וסמנים עצביים. השימוש בכתב מסוים בעצב, כגון האחד המתואר לעיל, מאפשר זיהוי ישיר. זה מספק הוכחה ישירה של המרה מוצלחת ומאפשר זיהוי תא חי הנדרש עבור מהדק-מלחציים הפיזיולוגיה.</p>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CA-FLEX</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>38042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>67291</td>
			<td>NM_008553.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lmx1a</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>33013</td>
			<td>NM_0033652.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nurr1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>35000</td>
			<td>NM_013613.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-syn</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>30456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoxP (FLEX) sequence 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac<br/>gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc<br/>accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg<br/>acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa<br/>gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga<br/>agaggctctaga</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoxP (FLEX) sequences 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tactagtataacttcgtataggatactttatac<br/>gaagttatcattgggattcttcctattttgatc<br/>caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct<br/>caccatcgacccataacttcgtatagcatacat<br/>tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa<br/>ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDP5</td>
			<td>Plasmid Factory</td>
			<td>PF435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDP6</td>
			<td>Plasmid Factory</td>
			<td>PF436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)+ Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85120602-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>10078780</td>
			<td>175 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris H-CL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td>
			<div>
			<div>For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>EDTA: Invitrogen</td>
			<td>EDTA: AM9260G</td>
			<td>
			<div>
			<div>For TE buffer use 1 mM EDTA</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>see Ultrapure water system</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>2.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>
			<div>
			<div>FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>
			<div>
			<div>For lysis Buffer: 1 mM</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge sealing tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Quick-Seal&#174;&#160;Polypropylene Tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep&#8482;&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-mL syringe-18G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>?</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anion exchange filter</td>
			<td>PALL laboratory</td>
			<td>MSTG25Q6</td>
			<td>
			<div>
			<div>Acrodisc unit with Mustang Q membrane</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z740210-24EA</td>
			<td>
			<div>
			<div>Amicon Ultra-4 device</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A33073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Novatech</td>
			<td>30209-1232</td>
			<td>
			<div>
			<div>CGGCCTCAGFGAGCGA</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#180;FAM / 3&#180;BHQ1 probe</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millex-GV filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -20 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge +4 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV viral room</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Water system</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Milli-Q&#174; IQ 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>2540 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase Chain Reaction (PCR)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative PCR (qPCR)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler&#174; 480 System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>ANIMAL MODEL</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2-Cre mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>NG2-CrexB6129, Stock #008533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolfurane</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>Dilute to 1% solution with warm water.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Viroderm</td>
			<td>7511&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td>P0500000</td>
			<td>
			<div>
			<div>i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blu</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrobeads</td>
			<td>Lumafluor</td>
			<td>R170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>From RSG Solingen.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-1552</td>
			<td>From Biochem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>232-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>232-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RSGA106.621</td>
			<td>Number 20.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RSGA106.200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting Europe</td>
			<td>51500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ear bars</td>
			<td>Stoelting Europe</td>
			<td>51648</td>
			<td>5 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with Removable needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>65</td>
			<td>
			<div>
			<div>0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capilaries</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary puller</td>
			<td>Sutter company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>1464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>GT420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Chamber and pump</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>8323101</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z118400-30EA</td>
			<td>25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z192414&#160;Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Braintree scientific, inc</td>
			<td>53800M</td>
			<td>
			<div>
			<div>From Covidien 2187.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton gauze</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Elfa Distrelec</td>
			<td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-366-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>-H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl<sub>2</sub>-6 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl<sub>2</sub>-6 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO<sub>3</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>
			<div>
			<div>see Ultrapure Water system</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1 or 2M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-D-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#8217;-2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1675&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C239&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass pipette</td>
			<td>Sutter Company</td>
			<td>B150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary puller</td>
			<td>Sutter company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WaterBath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>Use at a concentration of 4%.&#160;CAUTION:&#160;PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td>
			<div>
			<div>Use at a concentration of 0.1%.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10254640</td>
			<td>
			<div>
			<div>Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td>
			<div>
			<div>Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20&#176;C,&#160;light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>
			<div>
			<div>1: 600 in KPBS-T.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin- Cy3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434315</td>
			<td>1:5000, rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD65/67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
			<td>1:2000, mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:200, goat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chat</td>
			<td>Merk</td>
			<td>AB143</td>
			<td>1:5000, rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NPY</td>
			<td>Immunostar</td>
			<td>22940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NIST200B</td>
			<td>1:1000, chicken.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10981</td>
			<td>
			<div>
			<div>Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO&#174;, antifading</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-freeze solution</td>
			<td>Tissue Pro Technology</td>
			<td>AFS05-1000N, 1000 mL/ea.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8 laser scanning confocal microscope.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo direct reprogramming of resident glial cells into interneurons by intracerebral injection of viral vectors

<p class="jove_content">המרת התושב גליה במוח לתוך הנוירונים פונקציונלי מסוג אחד ספציפי ב vivo מספק צעד קדימה לקראת התפתחות של טיפולים חלופיים החלפת תאים תוך יצירת כלים גם לחקור את גורל התא באתרו. עד כה, ניתן היה להשיג נוירונים באמצעות vivo תכנות מדויק, אבל הפנוטיפ המדויק של נוירונים אלה או איך הם בוגרים לא נותחו בפרוטרוט. בפרוטוקול זה, אנו מתארים המרה יעילה יותר הזיהוי הספציפי לתא של vivo מתוכנת נוירונים, באמצעות מערכת וקטורים מבוססי AAV ויראלי. אנו מספקים גם פרוטוקול להערכה תפקודית של ההבשלה העצבית של התאים שתיכנתו. על-ידי הזרקת וקטורים מסוג ' היפוך כריתה ' (FLEX), המכיל את גנים הכתב המתיכנות מראש והסינפסין לסוגי תאים ספציפיים במוח המשמשים כיעד לתיכנות מדויק של התא. טכניקה זו מאפשרת זיהוי קל של הנוירונים החדשים שעוצבו מחדש. התוצאות מראות כי הנוירונים שהתקבלו מתוכנת מחדש פונקציונלית בוגרת לאורך זמן, לקבל אנשי קשר סינפטית ולהציג מאפיינים אלקטרולוגיים של סוגים שונים של האינטרנוירונים. באמצעות שעתוק הגורמים Ascl1, Lmx1a ו Nurr1, רוב התאים התיכנתו יש מאפיינים של מהיר העולה, parvalbumin המכיל באינטרנוירונים.</p>

<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">ההזרקה של וקטורים AAV משמש בהצלחה תכנות מחודש NG2 glia התאים לתוך נוירונים בתוך NG2-העכבר סטריאטום (<strong class="xfig">איור 1A</strong>). כדי במיוחד היעד NG2 glia, FLEX וקטורים עם התכנות מתיכנות/כתבת גנים, מוכנסים לכיוון antisense ומוקף על ידי שני זוגות של מקבילים, הטרוטיפקס אתרים loxP (<strong class="xfig">איור 1B</strong>). כל אחד משלושת הגנים מתיכנות מראש (Ascl1, Lmx1a ו Nurr1) ממוקם תחת השליטה של היזם לונים בכל מקום על וקטורים בודדים. על מנת להבטיח ביטוי GFP מוגבל הנוירונים מתוכנת מראש ממקור התא ביטוי, GFP הוא ממוקם תחת השליטה של תא העצב-סינפסין יזם ספציפי, (גם וקטור FLEX).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">השימוש בשילוב של התכנות מראש ובנייה עיתונאי מאפשר את הדור של נוירונים GFP-חיוביים בסטריאטום העכבר (<strong class="xfig">איור 1C</strong><strong>, C '</strong>). השימוש של העיתונאי לבנות ללא נוכחות של גנים מתיכנות מראש לא להניב נוירונים GFP-חיוביים (<strong class="xfig">איור 1D</strong>).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">הנוירונים שאינם מתוכנת על-ידי הביוציטוטין מתמלאים לאחר שלאחר המוות מכתימה (<strong class="xfig">איור 2 א</strong>). אם ההמרה תצליח, צריכה להיות. מורפולוגיה נרחבת במבנה העצבי ההקלטות האלקטרופיזיולוגיות של הנוירונים מתוכנת להראות נוכחות של קשרים פונקציונליים פוסט-סינפטית עם צעדי פעילות ספונטנית (<strong class="xfig">איור 2B</strong><strong>, C</strong>). זה יכול להיות חסום עם GABAergic גאבה או glutamatergic חוסם (Picrotoxin או CNQX), מציע הן מרגש ומעכבות קלט סינפטית לנוירונים מתוכנת. התרחשות של פעילות ספונטנית עולה עם הזרקת הזמן ויראלי הזרקה (<strong class="xfig">איור 2D</strong>), המציין התבגרות הדרגתית.</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">פוטנציאל הפעולה המושרה קיים בנוירונים פונקציונליים. פוטנציאל הפעולה יגדל במספר לאורך זמן לאחר ההמרה (<strong class="xfig">איור 2E</strong>). זה מעיד על התבגרות. בתפקוד עצבי בתוך תא עצב בלתי מפותח, הזרם יגרום ליותר או לא מעט מאוד פוטנציאל פעולה (<strong class="xfig">איור 2F</strong>).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">דפוסי הירי של תא העצב הוא סוג תא ספציפי כפי שהוא תלוי בגורמים כגון המבנה של התאים וביטוי הערוץ<sup class="xref">15</sup>. את דפוסי מוקלט ב vivo הנוירונים הניתנים לדפוס ניתן להבדיל לקבוצות ולעומת זה של תת-סוגי נוירוגניים עצביים, למשל מהיר המבהנוירונים (תא סוג B, <strong class="xfig">איור 3B</strong>) או סוגי תאים אחרים (<strong class="xfig">איור 3b</strong><strong>, C, D </strong>). הבדלים אלקטרופיסיולוגיים שנצפו ניתן לאשר על ידי נוכחות של סמנים ספציפיים לסוג וביטוי משותף עם GFP (<strong class="xfig">איור 3E</strong><strong>-H</strong>). בסך הכל, מידע זה מציין כי הנוירונים המתוכנת מחדש המצויים בסטריאטום יש תכונות של סוגים שונים של אינטרנוירונים, כגון Parvalbumin-, צ'אט-ו-NPY-ביטוי interneurons, כמו גם שלאטאת זהות תא העצב המדיום קוצני (DARPP32 +) ( <strong class="xfig">איור 3E</strong> <strong>-H</strong>).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"><br><strong>איור 1: ב vivo תכנות של תושב NG2 glia לתוך נוירונים.</strong> (<strong>A</strong>) ייצוג סכמטי של וירוס aav בתיווך בvivo תכנות מחודש של סטריאטNG2 glia. (<strong>ב</strong>) ייצוג סכימטי של AAV5 FLEX בנייה המשמשים בvivo תכנות, שבו ביטוי הגנים מוסדר על ידי ביטוי היצור בתאי ממוקדות. (<strong>C</strong> ו- <strong>c</strong>) בvivo הנוירונים שעברו תוכנת העצב, כתוצאה מ-Syn-gfp + הזרקה לתוך הסטריאטום. (<strong>ד</strong>) העדר נוירונים מתוכנת תכנות כאשר לא מוסיפים לתוך הקוקטייל הנגיפי, ורק מבנה העיתונאי מוזרק בvivo. סולם ברים = 100 מ"מ (C), 25 מ"מ (ג), 25 מ"מ (ד). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a></p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"><br><strong>איור 2: ב vivo מתוכנת נוירונים הם פונקציונליים ולהראות התבגרות לאורך זמן.</strong> (<strong>א</strong>) מראה מורפולוגיה עצבית בוגרת, כולל שיוט דנדריטי. רשמים מראה (<strong>ב</strong>) פעילות מעכבות (GABAergic) כי הוא נחסם עם PICROTOXIN, נגבה<sub>היריב</sub> קולטן (<strong>ג</strong>) פעילות מרגש נחסם עם CNQX, היריב קולטן אמפא. (<strong>ד</strong>) מספר הנוירונים עם הפעילות הפוסט-סינפטית גדל לאורך זמן. (<strong>ה</strong>) נוירונים שתוקנו להראות ירי חוזרות כבר ב 5 שבועות לאחר ההזרקה (w.p.i.) ולהמשיך להראות כי ב 8 ו 12 W.p.i. (<strong>F</strong>) המושרה התוצאה פעולה פוטנציאל ו-postsynaptic של תא עצב בוגר, מראה מעטים הסינפטיות אירועים ובעלי פוטנציאל פעולה מועטים בהשוואה ל-B ו-D בסרגל קנה מידה = 25 מ"מ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.</a></p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"><br><strong>איור 3: ב Vivo הנוירונים מתוכנת להראות אימונוהיסטוכימיה ו אלקטרופיזיולוגיה תכונות של סטריאטאל interneurons.</strong> (<strong>A-D</strong>) דפוסי ירי של vivo מתוכנת הנוירונים יכול להיות מסוגים שונים: (<strong>א</strong>) סוג דומה לעצב בינוני אנסוגני קוצני (DARPP32 +); (<strong>ב</strong>) דומה מהיר העולה (PV +) interneurons; (<strong>ג</strong>) בדומה להנוירונים בולטים בעלי הסף הנמוך (npy +); (<strong>ד</strong>) נוירונים יורים עם היפרפולריזציה גדולה (צ'אט +). (<strong>E-ח</strong>) תמונות confocal וקד מראה שיתוף לוקליזציה של GFP ו-סמנים הביננוירונים PV (<strong>E</strong>), צ'אט (<strong>F</strong>), npy (<strong>G</strong>), ו תא ההקרנה סמן DARPP32 (<strong>H</strong>). כל ברים בקנה מידה = 50 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a></p>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors at JoVE.com

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

בתוך Vivo ישיר של תאים Glial תושב לתוך Interneurons על ידי הזרקת גרם של וקטורים ויראלי

<p class="jove_content">פרוטוקול זה מתכוון לייצר האינטרנוירונים מתוכנת באופן ישיר ב-vivo, באמצעות מערכת ויראלי מבוססי AAV במוח וכתבת ה-GFP FLEX סינפסין, המאפשרת זיהוי תאים וניתוח נוסף בvivo.</p>

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

<p>פרוטוקול זה מראה כי ניתן ליצור נוירונים חדשים ישירות במוח מן גליה תושב, כי אלה תאים מתוכנתים מחדש להתבגר לתוך נוירונים תת-סוג ספציפי. היתרון העיקרי הוא וירוס AAV תלוי cre המאפשר מיקוד ספציפי של NG2-גליה ואת כתב GFP כי תוויות נוירונים מתוכנתים מחדש לניתוח. יצירת נוירונים חדשניים במוח עלולה להוביל להתפתחות עתידית לטיפולים בהחלפת תאים במוח.</p><p>בפרוטוקול שלנו אנו מייצרים את האינטראורונים החיוביים של פרבלבומין שיש להם השלכות על הפרעות פסיכיאטריות. תכנות מחדש של Vivo יכול להיות מיושם על אזורים ומעגלים אחרים במוח תלוי מה פנוטיפ עצבי ומצב נוירולוגי אתה רוצה למקד. הדגמת ההליך תהיה ג'ני ג'והנסון: טכנאית, מריה פריירה: סטודנטית לשעבר לדוקטורט, ומרסלה בירטלה: סטודנטית לדוקטורט במעבדה שלנו.</p><p>כדי לייצר וקטור ויראלי AAV5, זרע HEK293T תאים עם בינוני תרבות סטנדרטית בחמישה בקבוקונים T175. כאשר התאים מגיעים ל-50 עד 70%, הכן את התמהיל הבא להתהוות. בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר, להוסיף כמויות טוחנת שווה של פלסמיד וקטור, ו pDG סדרת עוזר plasmid.</p><p>הוסף מאגר Tris-EDTA לנפח סופי של 144 מיקרוליטר ולאחר מכן הוסף מים אולטרה-חמים כדי לגרום לנפח כולל של 1296 מיקרוליטרים ולערבב. לאחר מכן, מוסיפים 144 מיקרוליטרים של 2.5 כלוריד סידן טוחן ומערבבים. לאחר מכן, להוסיף 1.92 מיליליטר של HBS לפתרון DNA ומערבולת מיד.</p><p>דגירה בטמפרטורת החדר בדיוק 60 שניות. לאחר מכן, להעביר את הפתרון 28 מיליליטר של תאים טריים תרבות בינוני ומערבבים. החלף את המדיום בבקבוקים עם המדיום המכיל תערובת transvection.</p><p>חכה שלושה ימים, ותעביר את התקשורת לבזבוז. הוסף חמישה מיליליטר של חיץ קציר לכל בקבוקון, ולאחר מכן להוסיף עוד ארבעה מיליליטר של DPBS לכל בקבוק כדי לשטוף את התאים הנותרים ואת הבריכה עם פתרון התא. צנטריפוגה התאים שנקטפו ב 1, 000 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.</p><p>לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant ולהמיס את גלולה ב 15 מיליליטר של חיץ תמוגה. להקפיא את צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר על קרח יבש במשך 15 דקות ולאחסן במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, להפשיר את התא שנקטף lysate באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.</p><p>בהליך זה, לבצע טיהור AAV על ידי אולטרהצנטריפוגה שיפוע יוד ולהשתמש צינורות תקרה אולטרהצנטריפוגה עם צנטריפוגה ב 350, 000 x g במשך שעה אחת ו 45 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לחלץ את AAV המכיל שלב, להכניס מזרק 10 מיליליטר עם מחט מד 18 בערך שני מילימטרים מתחת לגבול 40 עד 60% פאזה עם השיקוע פונה כלפי מעלה לסגת. הקפד לעצור לפני שהגיע רצועת החלבון לאחר חמישה עד שישה מיליליטר של וקטור ויראלי כבר מופק.</p><p>לאחר מכן, לטהר ולרכז את שיפוע יודיקסנול מדולל באמצעות מסנן חילופי אניון, על ידי דחיפת אותו דרך בקצב לא מהר יותר מאשר טיפה אחת לשנייה. לאחר מכן, לדחוף שלושה מיליליטר של מאגר IE לאט דרך המסנן כדי לשטוף אותו. לאחר מכן, החלק את התערובת ליחידת סינון צנטריפוגלית עם אחד עד שני מיליליטר של מאגר אלוטיון.</p><p>הוסף DPBS להתקן לנפח סופי של ארבעה מיליליטר. צנטריפוגה ב 2, 000 x גרם בטמפרטורת החדר עד פחות מ 0.5 מיליליטר של DPBS נשאר במסנן. לאחר מכן, להסיר נוזל מתחתית הצינור, מילוי מחדש עם ארבעה מיליליטר של DPBS, צנטריפוגה שוב.</p><p>חזור על שלב זה פעמיים נוספות, ודא כי נפח וקטור מרוכז על המסנן הוא כ 200 microliters לאחר הצנטריפוגה האחרונה. הסר את 200 וקטור מרוכז מיקרוליטר באמצעות פיפטה, ולדחוף אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר כדי לעקר. לאחר מכן, aliquot 200 microliters לתוך בקבוקון זכוכית עם הכנס שלובים.</p><p>להזרקת גורמי תכנות מחדש, הצב עכבר הרדמה במסגרת הסטריאוטוקסית. לנהל משככי כאבים מתאימים בתחילת הניתוח, ואז להביא את קצה נימי הזכוכית של מחט ההזרקה ממש מעל bregma. ודאו שהטיפ נימי ישר לחלוטין בשני מטוסי ה-A-P וה-M-L.</p><p>אפס הן את ערכי M-L והן את ערכי ה- A-P ל- 0.0 ב מונה הקואורדינטות הדיגיטליות. כדי לוודא שראש החיה נמצא במצב שטוח לחלוטין, השתמש ב מונה הקואורדינטות הדיגיטליות כדי למדוד את ערך הקואורדינטות D-V כאשר זרוע ה- A-P נמצאת בפלוס 2.0 ומינוס 2.0 וכן כאשר זרוע ה- M-L נמצאת בפלוס 2.0 ומינוס 2.0. התאימו את גובה השן ואת האוזן בהתאם.</p><p>לאחר מכן, הרם מעט את המזרק וקדח חור באמצעות תרגיל שיניים בנקודות הציון של ההזרקה. התחל לקדוח באתר, עובד בצורה מעגלית ועדינה. לאחר מכן, מניחים חתיכת גזה כותנה על החתך הפתוח לשטוף את המזרק עם תמיסת מלח.</p><p>לאחר שטיפה, לצייר בועת אוויר ולאחר מכן microliter אחד של פתרון המכיל את הווקטור ויראלי. ודא כי הפתרון הוויראלי ניתן לדמיין בקלות מתחת לבועת האוויר. לאחר מכן, מנמיך את המזרק, מתקדם לאט לעומק הרצוי, וודא שהמסלול נקי ממשברי עצם.</p><p>לאחר מכן, להזריק מיקרוליטר אחד של הפתרון הנגיפי בקצב של 0.4 microliters לדקה. כאשר ההזרקה נעשית, לאפשר שתי דקות עבור דיפוזיה לפני נסיגת מזרק. לאחר דיפוזיה, לאט לסגת המזרק עד קצה נימי הוא נסוג לחלוטין מהמוח, ואז בזהירות לתפור את החתך ולהסיר את החיה מן המסגרת stereotaxic.</p><p>לפקח על החיה בתחנה לאחר הניתוח עד ההכרה היא חזרה. בעלי חיים נשמרים עד 12 שבועות לאחר הזרקת וירוס כדי לאפשר גליה תושב לתכנת מחדש לתוך נוירונים בוגרים. כדי להכין פרוסות מוח לאלקטרופיזיולוגיה באמצעות רטט, חותכים את המוח מהחלק הסטראלי ביותר עד לרמה הסטריאטית במהירות גבוהה.</p><p>לאחר מכן חתך את הסטריאטום ב-275 מיקרומטר ב-0.1 מילימטרים לשנייה. לאחר כל קטע, להסיר בזהירות את הצד striatal לא מוזרק ולהעביר את הצד מוזרק לתוך בקבוקון עם רשת תחתונה מחומצן CREB להחליק באמבט המים בטמפרטורת החדר. שמור את הבקבוקון בטמפרטורת החדר עד שכל החלקים נחתכים.</p><p>לאחר מכן, לאט להגדיל את הטמפרטורה של אמבט המים ל 37 מעלות צלזיוס ולהשאיר אותו במשך 30 דקות, ולאחר מכן לכבות את התנור ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר העברת קטע רקמה אחד לתא הקלטה לאלקטרופיזיולוגיה, הר את פיפטה הזכוכית על האלקטרודה המתעדת והורד אותה לתוך הפתרון. בדוק שוב את ההתנגדות של האלקטרודה.</p><p>לאחר מכן, לאט להתקרב לתא מתוכנת מחדש עם פיפטה, שמירה על לחץ חיובי קל באלקטרודה, כדי למנוע חיבור הקצה, ולבדוק כי התא הוא GFP חיובי לפני תיקון. כאשר התא תוקן, לשמור על התא מהדק הנוכחי ממינוס 60 עד מינוס 70 מילי-וולט, ולהזריק 500 זרמי אלפיות שנייה ממינוס 20 פלוס 90 picoamperes עם 10 מרווחים picoampere כדי לגרום פוטנציאל פעולה. זה מעיד על התבגרות עצבית ותכנות מחדש מוצלח.</p><p>לאחר מכן, לעבור מלחצי מתח ולמדוד את הנתרן פנימה ועיכוב תיקון זרמי אשלגן בשלבים depolarizing של 10 מיליבולטים. הנה פוסט נרשם ביוצטין מלא נוירון מתוכנת מחדש אשר מראה מורפולוגיה עצבית בוגרת ואת קוצים דנדריטי. כאן, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של הנוירונים מתוכנתים מחדש להראות את נוכחותם של קשרים תפקודיים postsynaptic עם אמצעי פעילות ספונטניים.</p><p>עקבות להראות את הפעילות מעכבות כי הוא חסום עם picrotoxin, אנטגוניסט קולטן GABAA ואת פעילות סינפלורציה כי הוא חסום עם CNQX, אנטגוניסט קולטן אמפא. הנוירונים המדבקים כבר מראים פעילות פוסט-סינפטית בחמישה שבועות לאחר ההזרקה, וממשיכים בשמונה ו-12 שבועות לאחר ההזרקה. מספר הנוירונים עם פוטנציאל הפעולה המושרה הנוכחי גם עולה עם הזמן.</p><p>ניתוח מפורט יותר חשף מספר דפוסי ירי ברורים שבהם רוב התאים מראים פעילות ספינג מהירה הדומה ל- parvalbumin interneurons. ניתוח אימונוהיסטוכימי ב 12 שבועות נוספים הראה ביטוי שותף של הכתב GFP ואת parvalbumin. בעקבות הליך זה ניתן לבחון את ביטוי הגן עם טכניקת מחפש טלאי או להעריך את הקישוריות הסינפטית התלת מימדית עם מעקב חד-סינפטי ו- iDISCO.</p><p>כעת, לאחר שניתן לתכנת מחדש את גליה תושבת לפרבלבומין המבטאת אינטרפרונים, התחלנו לחקור אם אלה אותנטיים וניתן להשתמש בהם ככלי טיפולי. זכור לפעול לפי הפרוטוקולים וההנחיות שנקבעו בעת טיפול בבעלי חיים ושימוש בנגיף AAV.</p>

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

הזרקת דם עצמיים על דגם דימום intracerebral ספונטנית עכברים

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by <em>in vivo</em> Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי<em> In vivo</em> Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by <em>In Utero</em> Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

הזרקת intracerebroventricular ו intravascular של חלקיקים נגיפיים ו פלורסנט microbeads לתוך המוח בילוד

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

השרשה בצינורית לתוך המלון Cisterna של מכרסמים

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

מודל חולדה של דמיאלינציה קליפת המוח הנרחבת הנגרמת על ידי הזרקה תוך מוחית של ציטוקינים פרו דלקתיים

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...