Name: in vivo direct reprogramming of resident glial cells into interneurons by intracerebral injection of viral vectors
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors at JoVE.com

<p class="jove_content">Marcella Birtele har blitt finansiert av European Union Horizon 2020 program (H2020-MSCA-ITN-2015) under Marie Skłodowska-Curie nyskapende trening nettverk og Grant Agreement no. 676408. Daniella Rylander Ottosson har blitt finansiert av Swedish Research Council (2017-01234).</p>

<ol>
	<li>Barker, R. A., Parmar, M., Studer, L., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Trials+of+Stem+Cell-Derived+Dopamine+Neurons+for+Parkinson&#39;s+Disease:+Dawn+of+a+New+Era.">Human Trials of Stem Cell-Derived Dopamine Neurons for Parkinson&#39;s Disease: Dawn of a New Era.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Stem Cell</em>. <b>21</b> (5), 569-573 (2017).</li><li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy.">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> <em style='font-style: italic'>Science</em>. <b>344</b> (6180), 1240622 (2014).</li><li>Parmar, M., Torper, O., Drouin-Ouellet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+therapy+for+Parkinson&#39;s+disease:+A+journey+through+decades+toward+the+light+side+of+the+Force.">Cell-based therapy for Parkinson&#39;s disease: A journey through decades toward the light side of the Force.</a> <em style='font-style: italic'>European Journal of Neuroscience</em>. , (2018).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Reports</em>. <b>12</b> (3), 474-481 (2015).</li><li>Su, Z., Niu, W., Liu, M. L., Zou, Y., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+conversion+of+astrocytes+to+neurons+in+the+injured+adult+spinal+cord.">In vivo conversion of astrocytes to neurons in the injured adult spinal cord.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Communication</em>. <b>5</b>, 3338 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascl1+Converts+Dorsal+Midbrain+Astrocytes+into+Functional+Neurons+In+Vivo.">Ascl1 Converts Dorsal Midbrain Astrocytes into Functional Neurons In Vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neuroscience</em>. <b>35</b> (25), 9336-9355 (2015).</li><li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+Alzheimer&#39;s+disease+model.">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer&#39;s disease model.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Stem Cell</em>. <b>14</b> (2), 188-202 (2014).</li><li>Grande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+impact+on+direct+neuronal+reprogramming+in+vivo+in+the+adult+brain.">Environmental impact on direct neuronal reprogramming in vivo in the adult brain.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Communication</em>. <b>4</b>, 2373 (2013).</li><li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+astrocytes+to+neuroblasts+in+the+adult+brain.">In vivo reprogramming of astrocytes to neuroblasts in the adult brain.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Cell Biology</em>. <b>15</b> (10), 1164-1175 (2013).</li><li>Weinberg, M. S., Criswell, H. E., Powell, S. K., Bhatt, A. P., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vector+Reprogramming+of+Adult+Resident+Striatal+Oligodendrocytes+into+Functional+Neurons.">Viral Vector Reprogramming of Adult Resident Striatal Oligodendrocytes into Functional Neurons.</a> <em style='font-style: italic'>Molecular Therapy</em>. <b>25</b> (4), 928-934 (2017).</li><li>Pereira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Resident+NG2+Glia+into+Neurons+with+Properties+of+Fast-Spiking+Parvalbumin-Containing+Interneurons.">Direct Reprogramming of Resident NG2 Glia into Neurons with Properties of Fast-Spiking Parvalbumin-Containing Interneurons.</a> <em style='font-style: italic'>Stem Cell Reports</em>. <b>9</b> (3), 742-751 (2017).</li><li>Rivetti di Val Cervo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+functional+dopamine+neurons+from+human+astrocytes+in+vitro+and+mouse+astrocytes+in+a+Parkinson&#39;s+disease+model.">Induction of functional dopamine neurons from human astrocytes in vitro and mouse astrocytes in a Parkinson&#39;s disease model.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Biotechnology</em>. <b>35</b> (5), 444-452 (2017).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation.">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> <em style='font-style: italic'>Molecular Therapy Methods &#38; Clinial Development</em>. <b>10</b>, 1-7 (2018).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+neurons+via+direct+conversion+in+vivo.">Generation of induced neurons via direct conversion in vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America</em>. <b>110</b> (17), 7038-7043 (2013).</li><li>Kawaguchi, Y., Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+physiological+subgroupings+of+nonpyramidal+cells+with+parvalbumin-+and+calbindinD28k-immunoreactive+neurons+in+layer+V+of+rat+frontal+cortex.">Correlation of physiological subgroupings of nonpyramidal cells with parvalbumin- and calbindinD28k-immunoreactive neurons in layer V of rat frontal cortex.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neurophysiology</em>. <b>70</b> (1), 387-396 (1993).</li><li>Grealish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A9+dopamine+neuron+component+in+grafts+of+ventral+mesencephalon+is+an+important+determinant+for+recovery+of+motor+function+in+a+rat+model+of+Parkinson&#39;s+disease.">The A9 dopamine neuron component in grafts of ventral mesencephalon is an important determinant for recovery of motor function in a rat model of Parkinson&#39;s disease.</a> <em style='font-style: italic'>Brain</em>. <b>133</b> (Pt 2), 482-495 (2010).</li><li>Thompson, L., Barraud, P., Andersson, E., Kirik, D., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dopaminergic+neurons+of+nigral+and+ventral+tegmental+area+subtypes+in+grafts+of+fetal+ventral+mesencephalon+based+on+cell+morphology,+protein+expression,+and+efferent+projections.">Identification of dopaminergic neurons of nigral and ventral tegmental area subtypes in grafts of fetal ventral mesencephalon based on cell morphology, protein expression, and efferent projections.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neuroscience</em>. <b>25</b> (27), 6467-6477 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content">Forfatterne har ingenting å avsløre.</p>

<p class="jove_content">In vivo direkte omprogrammering kan oppnås ved hjelp av AAV FLEX vektorer i grobunn-uttrykker musen stammer. Det er viktig å merke seg at forskjellene mellom mus stammer med hensyn til omprogrammering effekt er observert. For in vivo-omprogrammering i striatum har NG2-grobunn vist seg å være mer effektiv sammenlignet med andre stammer. Før du begynner å bruke en ny dyr belastning, er det viktig å sjekke musen leverandøren retningslinjer angående grobunn uttrykk over tid, som en alder av dyr ofte påvirker spesifisitet av dette proteinet uttrykket. I våre studier, dyr eldre enn 12 uker ble ikke brukt til in vivo omprogrammering som det var en risiko for grobunn uttrykk i celler enn NG2 glia. Den konstante tilstedeværelsen og overvåking av kontroll dyr injiseres bare med Synapsin-FLEX-GFP konstruere anbefales. Dette gjør det mulig å overvåke dyrene for GFP-positive celler som ikke skal være til stede hvis ingen omprogrammering gener (ALN) brukes.</p>
<p class="jove_content">For å identifisere de nylig omprogrammeres neurons, en Nevron-spesifikk identifisering metode som beskrevet i denne protokollen er av største betydning. Dette gir en riktig identifisering og forskjellsbehandling av omprogrammeres neurons fra endogene omkringliggende celler som er av særlig relevans når omprogrammering i en homotopic region.</p>
<p class="jove_content">Det er også viktig å målrette riktig struktur for viral injeksjon. Derfor er stereotaxic kirurgi for viral injeksjon viktig og må nærmet med nøyaktighet, spesielt når målretting mindre strukturer i hjernen.</p>
<p class="jove_content">Vi har tidligere vist<sup class="xref">11</sup> at det ikke er pålitelig å forutsi utfallet av in vivo-omprogrammering basert på in vitro omprogrammering eksperimenter ved bruk av de samme omprogrammering faktorene. Alle faktorer av interesse må derfor testes in vivo. I våre hender gir mange forskjellige faktor kombinasjoner den samme under typen av neurons (dvs. interneurons<sup class="xref">11</sup> in vivo) til tross for at disse genene har vært innblandet i utviklingen av andre neurons.</p>
<p class="jove_content">Hel celle patch klemme for omprogrammeres neurons er en delikat teknikk og vev behandling er viktig for et godt utfall. Med iskald Krebs-oppløsning forbedres vevs kvaliteten. Også lappet neurons må behandles nøye. Selv om modning og fenotypiske identiteten til omprogrammeres neurons kan bli noe vurdert ved hjelp av hele cellen patch klemme, disse cellene er ikke helt sammenlignbare med sine endogene kolleger. Flere typer analyser, for eksempel sekvens sekvenser (for eksempel RNA-sekvenser), bør brukes for å bekrefte omprogrammeres celle identitet ytterligere.</p>
<p class="jove_content">Teknikken beskrevet her er kan vurderes for utvikling av fremtidige terapier der neuronal utskifting er nødvendig i hjernen. Selv om in vivo omprogrammering fortsatt er på et tidlig stadium og oversettelsen til mennesker ennå ikke er forutsett, kan denne teknikken gi en metode for å vurdere eksogene gen funksjon i hjernen og studere celle modning i vivo.</p>

<p class="jove_content">Det overordnede målet med denne metoden er å effektivt konvertere hjernen bosatt glia in vivo i funksjonell og under type-spesifikke neurons som parvalbumin-uttrykker interneurons. Dette gir et skritt fremover mot utviklingen av en alternativ celle erstatning terapi for hjernesykdommer uten behov for en eksogene celle kilde. Det skaper også et verktøy for å studere celle skjebne brytere in situ.</p>
<p class="jove_content">Hjernen har bare en begrenset kapasitet for å generere nye neurons. Derfor, i nevrologiske sykdommer, er det behov for eksogene celle kilder for hjernen reparasjon. For dette har ulike kilder til celler blitt utsatt for intens forskning gjennom årene, inkludert celler fra primær vev, stilk cellen-avledet celler og omprogrammeres celler<sup class="xref">1</sup><sup>,</sup><sup class="xref">2</sup><sup>,</sup><sup class="xref">3</sup>. Direkte omprogrammering av fastboende hjerneceller i neurons er en nylig tilnærming som kan gi en attraktiv metode for hjernen reparasjon som den bruker pasientens egne celler for å generere romanen neurons inne i hjernen. Hittil har flere rapporter vist i vivo omprogrammering gjennom viral vektor levering i hjernen<sup class="xref">4</sup><sup>,</sup><sup class="xref">5</sup><sup>,</sup><sup class="xref">6</sup><sup>,</sup><sup class="xref">7</sup><sup class="xref">8</sup><sup>,</sup><sup class="xref">9</sup> i ulike hjerneregioner som cortex, ryggmargen, striatum og mellomhjernen<sup class="xref">5</sup><sup>,</sup><sup class="xref">10</sup><sup>,</sup><sup class="xref">11</sup>, så vel som i intakt og lesioned Brain<sup class="xref">5</sup><sup>,</sup><sup class="xref">8</sup><sup>,</sup><sup class="xref">11</sup><sup>,</sup><sup class="xref">12</sup>. Både hemmende og eksitatoriske neurons har blitt oppnådd<sup class="xref">4</sup><sup>,</sup><sup class="xref">8</sup>, men den presise fenotype eller funksjonaliteten til disse cellene har ennå ikke blitt analysert i detalj.</p>
<p class="jove_content">I denne protokollen beskriver vi en mer effektiv omprogrammering og celle spesifikk identifisering av in vivo omprogrammeres neurons. Vi tilbyr en protokoll for funksjonell vurdering av neuronal modning og fenotype karakterisering basert på funksjonalitet og immunhistokjemiske egenskaper.</p>
<p class="jove_content">Vi brukte en grobunn-induserbart AAV vektor og en GFP reporter å identifisere in vivo omprogrammeres neurons. Dette valget av viral vektorer har fordelen av å infisere både dele og ikke-splitte celler i hjernen, øke antall målrettede celler, som et alternativ til bruk av retrovirus.<sup class="xref"></sup><sup></sup><sup class="xref"></sup> En Nevron-spesifikk synapsin-drevet FLEX reporter (GFP), gjorde oss i stand til å spesifikt oppdage den nylig genererte neurons. Tidligere studier har brukt under type-spesifikke arrangører for in vivo<sup class="xref"></sup><sup></sup><sup class="xref"></sup>omprogrammering, som også tillater uttrykk for omprogrammering gener og journalister i bestemte celletyper. Imidlertid krever at metoden ytterligere identifisering av omprogrammeres neurons av postmortem analyse av co-uttrykk for reporter og neuronal markører. Bruken av en Nevron-spesifikk reporter, slik som den som er beskrevet her, åpner for en direkte identifisering. Dette gir en direkte bevis på en vellykket konvertering og tillater en live celle identifikasjon som er nødvendig for patch-Clamp elektrofysiologi.</p>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CA-FLEX</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>38042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>67291</td>
			<td>NM_008553.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lmx1a</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>33013</td>
			<td>NM_0033652.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nurr1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>35000</td>
			<td>NM_013613.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-syn</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>30456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoxP (FLEX) sequence 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac<br/>gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc<br/>accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg<br/>acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa<br/>gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga<br/>agaggctctaga</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoxP (FLEX) sequences 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tactagtataacttcgtataggatactttatac<br/>gaagttatcattgggattcttcctattttgatc<br/>caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct<br/>caccatcgacccataacttcgtatagcatacat<br/>tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa<br/>ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDP5</td>
			<td>Plasmid Factory</td>
			<td>PF435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDP6</td>
			<td>Plasmid Factory</td>
			<td>PF436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)+ Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85120602-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>10078780</td>
			<td>175 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris H-CL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td>
			<div>
			<div>For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>EDTA: Invitrogen</td>
			<td>EDTA: AM9260G</td>
			<td>
			<div>
			<div>For TE buffer use 1 mM EDTA</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>see Ultrapure water system</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>2.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>
			<div>
			<div>FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>
			<div>
			<div>For lysis Buffer: 1 mM</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge sealing tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Quick-Seal&#174;&#160;Polypropylene Tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep&#8482;&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-mL syringe-18G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>?</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anion exchange filter</td>
			<td>PALL laboratory</td>
			<td>MSTG25Q6</td>
			<td>
			<div>
			<div>Acrodisc unit with Mustang Q membrane</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z740210-24EA</td>
			<td>
			<div>
			<div>Amicon Ultra-4 device</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A33073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Novatech</td>
			<td>30209-1232</td>
			<td>
			<div>
			<div>CGGCCTCAGFGAGCGA</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#180;FAM / 3&#180;BHQ1 probe</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millex-GV filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -20 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge +4 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV viral room</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Water system</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Milli-Q&#174; IQ 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>2540 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase Chain Reaction (PCR)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative PCR (qPCR)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler&#174; 480 System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>ANIMAL MODEL</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2-Cre mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>NG2-CrexB6129, Stock #008533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolfurane</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>Dilute to 1% solution with warm water.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Viroderm</td>
			<td>7511&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td>P0500000</td>
			<td>
			<div>
			<div>i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blu</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrobeads</td>
			<td>Lumafluor</td>
			<td>R170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>From RSG Solingen.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-1552</td>
			<td>From Biochem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>232-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>232-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RSGA106.621</td>
			<td>Number 20.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RSGA106.200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting Europe</td>
			<td>51500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ear bars</td>
			<td>Stoelting Europe</td>
			<td>51648</td>
			<td>5 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with Removable needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>65</td>
			<td>
			<div>
			<div>0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capilaries</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary puller</td>
			<td>Sutter company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>1464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>GT420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Chamber and pump</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>8323101</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z118400-30EA</td>
			<td>25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z192414&#160;Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Braintree scientific, inc</td>
			<td>53800M</td>
			<td>
			<div>
			<div>From Covidien 2187.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton gauze</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Elfa Distrelec</td>
			<td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-366-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>-H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl<sub>2</sub>-6 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl<sub>2</sub>-6 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO<sub>3</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>
			<div>
			<div>see Ultrapure Water system</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1 or 2M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-D-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#8217;-2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1675&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C239&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass pipette</td>
			<td>Sutter Company</td>
			<td>B150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary puller</td>
			<td>Sutter company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WaterBath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>Use at a concentration of 4%.&#160;CAUTION:&#160;PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td>
			<div>
			<div>Use at a concentration of 0.1%.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10254640</td>
			<td>
			<div>
			<div>Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td>
			<div>
			<div>Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20&#176;C,&#160;light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>
			<div>
			<div>1: 600 in KPBS-T.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin- Cy3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434315</td>
			<td>1:5000, rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD65/67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
			<td>1:2000, mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:200, goat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chat</td>
			<td>Merk</td>
			<td>AB143</td>
			<td>1:5000, rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NPY</td>
			<td>Immunostar</td>
			<td>22940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NIST200B</td>
			<td>1:1000, chicken.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10981</td>
			<td>
			<div>
			<div>Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO&#174;, antifading</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-freeze solution</td>
			<td>Tissue Pro Technology</td>
			<td>AFS05-1000N, 1000 mL/ea.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8 laser scanning confocal microscope.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo direct reprogramming of resident glial cells into interneurons by intracerebral injection of viral vectors

<p class="jove_content">Konvertering bosatt glia i hjernen til funksjonelle og under type-spesifikke neurons in vivo gir et skritt fremover mot utvikling av alternative celle erstatning terapier samtidig skape verktøy for å studere celle skjebne in situ. Hittil har det vært mulig å få neurons via in vivo omprogrammering, men den presise fenotype av disse neurons eller hvordan de modne ikke har blitt analysert i detalj. I denne protokollen, beskriver vi en mer effektiv konvertering og celle-spesifikk identifisering av in vivo omprogrammeres neurons, ved hjelp av en AAV-basert viral vektor system. Vi tilbyr også en protokoll for funksjonell vurdering av omprogrammeres cellenes neuronal modning. Ved å injisere flip-forbruker (FLEX) vektorer, som inneholder omprogrammering og synapsin-drevet reporter gener til bestemte celletyper i hjernen som fungerer som mål for celle omprogrammering. Denne teknikken gjør det mulig for enkel identifisering av nylig omprogrammeres neurons. Resultatene viser at de oppnådde omprogrammeres neurons funksjonelt modne over tid, motta Synaptic kontakter og vise elektrofysiologisk egenskaper av ulike typer interneurons. Ved hjelp av transkripsjon faktorer Ascl1, Lmx1a og Nurr1, de fleste av de omprogrammeres cellene har egenskaper av fast-skyter, parvalbumin-inneholdende interneurons.</p>

<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">Injeksjon av AAV vektorer brukes for å kunne programmere bosatt NG2 glia celler i neurons i NG2-grobunn-mus striatum (<strong class="xfig">figur 1a</strong>). For spesifikt å målrette mot NG2-glia, blir FLEX-vektorer med omprogrammering/reporter-gener satt inn i en antisens retning og flankert av to par med antiparallel, heterotypic loxP-områder (<strong class="xfig">figur 1B</strong>). Hver av de tre omprogrammering gener (Ascl1, Lmx1a og Nurr1) er plassert under kontroll av allestedsnærværende CBA promoter på individuelle vektorer. For å sikre at GFP uttrykk er begrenset til omprogrammeres neurons som stammer fra en grobunn-uttrykker celle, er GFP plassert under kontroll av Nevron-spesifikke synapsin promoter, (også i en FLEX vektor).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">Bruken av kombinasjonen av omprogrammering og reporter konstruerer tillater generering av GFP-positive neurons i musen striatum (<strong class="xfig">figur 1C</strong><strong>, C '</strong>). Bruken av reporteren konstruere uten tilstedeværelse av omprogrammering gener gir ikke GFP-positive neurons (<strong class="xfig">figur 1d</strong>).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">De omprogrammeres neurons som er biocytin er synlige etter obduksjon Immuno-farging (<strong class="xfig">figur 2a</strong>). Hvis konverteringen er vellykket, bør det være omfattende neuronal morfologi. Elektrofysiologisk innspillinger av omprogrammeres neurons viser tilstedeværelsen av postsynaptic funksjonelle forbindelser med spontane aktivitets tiltak (<strong class="xfig">fig. 2b</strong><strong>, C</strong>). Dette kan blokkeres med enten ionotrope GABAergic eller glutamatergic blocker (Pikrotoksin eller CNQX), noe som tyder både eksitatoriske og hemmende Synaptic innspill til omprogrammeres neurons. Forekomsten av spontan aktivitet øker med tiden etter viral injeksjon (<strong class="xfig">figur 2D</strong>), noe som indikerer en gradvis modning.</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">Current-indusert handling potensialer er til stede i funksjonelle neurons. Handlingen potensialer økning i antall over tid etter konvertering (<strong class="xfig">figur 2e</strong>). Dette indikerer ytterligere modning i neuronal funksjon. I en umoden Nevron, gjeldende vil indusere enten ingen eller svært få handling potensialer (<strong class="xfig">figur 2F</strong>).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">Avfyring mønstre av en Nevron er celle type bestemt som det avhenger av faktorer som morfologi av cellene og kanal uttrykket<sup class="xref">15</sup>. De innspilte mønstrene i in vivo omprogrammeres neurons kan skilles i grupper og i forhold til endogene neuronal under typer, f. eks fast-skyter interneurons (Cell type B, <strong class="xfig">figur 3b</strong>) eller andre celletyper (<strong class="xfig">figur 3a</strong><strong>, C, D </strong>). De observerte elektrofysiologisk forskjellene kan bekreftes ved tilstedeværelsen av spesifikke under type markører og co-uttrykk med GFP (<strong class="xfig">figur 3e</strong><strong>-H</strong>). I alt tyder disse dataene på at de omprogrammeres neurons som finnes i striatum har egenskaper av ulike typer interneurons, slik som Parvalbumin-, ChAt-og NPY-uttrykker interneurons, så vel som stria tale medium spiny Nevron identitet (DARPP32 +) ( <strong class="xfig">Figur 3e</strong> <strong>-H</strong>).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"><br><strong>Figur 1: in vivo omprogrammering av bosatt NG2 glia inn neurons.</strong> (<strong>A</strong>) skjematisk fremstilling av AAV virus-mediert in vivo omprogrammering av stria tale NG2 glia. (<strong>B</strong>) skjematisk fremstilling av AAV5 Flex konstruerer brukt for in vivo omprogrammering, der genuttrykk er regulert av grobunn uttrykk i målrettede celler. (<strong>C</strong> og <strong>C '</strong>) in vivo omprogrammeres neurons, som følge av syn-GFP + ALN-injeksjon i striatum. (<strong>D</strong>) fravær av omprogrammeres neurons når ingen omprogrammering faktorer er lagt inn i viral cocktail, og bare reporter konstruere injiseres in vivo. Vektstenger = 100 mm (C), 25 mm (C '), 25 mm (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a></p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"><br><strong>Figur 2: in vivo omprogrammeres neurons er funksjonell og viser modning over tid.</strong> (<strong>A</strong>) Biocytin-fylt omprogrammeres Nevron, viser eldre neuronal morfologi, inkludert dendrittiske pigger. Spor viser (<strong>B</strong>) hemmende (GABAergic) aktivitet som er blokkert med pikrotoksin, en GABA<sub>en</sub> reseptor motstander og (<strong>C</strong>) EKSITATORISKE aktivitet som er blokkert med CNQX, en AMPA reseptor motstander. (<strong>D</strong>) antall neurons med postsynaptic aktivitet øker over tid. (<strong>E</strong>) lappet neurons Vis repeterende avfyring allerede på 5 uker etter injeksjon (w.p.i.) og fortsette å vise at ved 8 og 12 W.p.i. (<strong>F</strong>) Current-indusert handling potensial og postsynaptic aktivitet av en umoden Nevron, viser få Synaptic hendelser og få handling potensialer i forhold til B og D. Scale bar = 25 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a></p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"><br><strong>Figur 3: in vivo omprogrammeres neurons viser immunhistokjemiske og elektrofysiologisk egenskaper stria tale interneurons.</strong> (<strong>A-D</strong>) Avfyring mønstre av in vivo omprogrammeres neurons kan være av forskjellige typer: (<strong>A</strong>) type A er lik endogene medium spiny NEVRON (DARPP32 +); (<strong>B</strong>) ligner på hurtig SKYTER (PV +) interneurons; (<strong>C</strong>) lik lav terskel skyter neurons med fremtredende sag (NPY +); (<strong>D</strong>) neurons avfyring med store etter-hyperpolarization (chat +). (<strong>E-H</strong>) Konfokalmikroskopi bilder som viser co-lokalisering av GFP og interneuron markører PV (<strong>E</strong>), ChAT (<strong>F</strong>), NPY (<strong>G</strong>), og projeksjon Nevron markør DARPP32 (<strong>H</strong>). Alle skala bars = 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a></p>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors at JoVE.com

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In vivo Direct omprogrammering av Resident gliacellene Cells til Interneurons av Intracerebrale injeksjon av viral vektorer

<p class="jove_content">Denne protokollen tar sikte på å generere direkte omprogrammeres interneurons in vivo, ved hjelp av et AAV-basert virus system i hjernen og en FLEX synapsin-drevet GFP reporter, som gjør det mulig for celle identifisering og videre analyse in vivo.</p>

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

<p>Denne protokollen viser at det er mulig å generere nye nevroner direkte i hjernen fra resident glia og at disse omprogrammerte cellene modnes til subtypespesifikke nevroner. Den største fordelen er det cre-avhengige AAV-viruset som muliggjør spesifikk målretting av NG2-glia og GFP-reporteren som merker de omprogrammerte nevronene for analyse. Generering av nye nevroner i hjernen kan føre til fremtidig utvikling for celleerstatningsterapi i hjernen.</p><p>I vår protokoll genererer vi parvalbumin-positive interneurons som har implikasjoner for psykiatriske lidelser. In vivo reprogrammering kan brukes på andre hjerneområder og kretser avhengig av hvilken nevronal fenotype og nevrologisk tilstand du vil målrette. Demonstrere prosedyren vil være Jenny Johansson:en tekniker, Maria Pereira:en tidligere ph.d.-student, og Marcella Birtele:a PhD student i vår lab.</p><p>For å produsere AAV5 viral vektor, frø HEK293T celler med standard kultur medium i fem T175 kolbe. Når cellene når 50 til 70% samløpet, klargjør følgende blanding for transveksjon. I et 50 milliliter sentrifugerør, legg til like molarmengder vektor plasmid, og pDG-serien hjelper plasmid.</p><p>Tilsett Tris-EDTA-bufferen i et endelig volum på 144 mikroliter, og tilsett deretter ultrarent vann for å resultere i et totalt volum på 1296 mikroliter og bland. Deretter legger du til 144 mikroliter med 2,5 molarkalsiumklorid og bland. Deretter legger du til 1,92 milliliter HBS til DNA-løsningen og virvelen umiddelbart.</p><p>Inkuber ved romtemperatur i nøyaktig 60 sekunder. Deretter overfører du løsningen til 28 milliliter frisk cellekulturmedium og bland. Erstatt mediet i kolben med mediet som inneholder transveksjonsblanding.</p><p>Vent i tre dager, og overfør media til avfall. Tilsett fem milliliter av høstbuffer til hver kolbe, og legg deretter til ytterligere fire milliliter DPBS til hver kolbe for å skylle de gjenværende cellene og basseng med celleløsningen. Sentrifuger de høstede cellene ved 1000 x g i fem minutter ved fire grader Celsius.</p><p>Etter sentrifugering fjerner du supernatanten og oppløser pelleten i 15 milliliter lysisbuffer. Frys 50 milliliter sentrifugerør på tørris i 15 minutter og oppbevar i en minus 20 grader Celsius fryser. Før bruk, tine den høstede cellen lysate i et vannbad på 37 grader Celsius.</p><p>I denne prosedyren, utføre AAV rensing av iodixanol gradient ultracentrifugation og bruke ultracentrifuge takrør med sentrifugering på 350, 000 x g i en time og 45 minutter ved romtemperatur. For å trekke ut AAV-innegående fase, sett inn en 10 ml sprøyte med en 18 gauge nål på omtrent to millimeter under 40 til 60% fasekanten med skråkanten vendt oppover og trekk ut. Sørg for å stoppe før du når proteinbåndet etter at fem til seks milliliter av virusvektoren er ekstrahert.</p><p>Deretter renser og konsentrerer du den fortynnede iodixanol-gradienten gjennom et anionutvekslingsfilter, ved å skyve den gjennom med en hastighet som ikke er raskere enn ett fall per sekund. Deretter skyver du tre milliliter IE-buffer sakte gjennom filteret for å vaske det. Deretter elute blandingen inn i en sentrifugal filterenhet med en til to milliliter elution buffer.</p><p>Legg DPBS til enheten til et endelig volum på fire milliliter. Sentrifuge ved 2, 000 x g ved romtemperatur til mindre enn 0,5 milliliter DPBS er igjen i filteret. Etterpå fjerner du væske fra bunnen av røret, fyller på med fire milliliter DPBS og sentrifuge igjen.</p><p>Gjenta dette trinnet to ganger til, sørg for at volumet av konsentrert vektor på filteret er ca 200 mikroliter etter siste sentrifugering. Fjern den konsentrerte vektoren på 200 mikroliter ved hjelp av en pipette, og skyv den gjennom et 0,22 mikrometerfilter for å sterilisere. Deretter aliquot 200 mikroliter inn i et hetteglass med sammenlåst innsats.</p><p>Hvis du vil injisere omprogrammeringsfaktorer, plasserer du en bedøvet mus i den stereotoksiske rammen. Administrer passende analgesi i begynnelsen av operasjonen, og ta deretter spissen av glasskapillæren på injeksjonsnålen like over bregma. Pass på at kapillærspissen er helt rett i både A-P- og M-L-plan.</p><p>Tilbakestill både M-L- og A-P-verdiene til 0,0 på den digitale koordinattskranken. For å sikre at dyrets hode er i en helt flat posisjon, bruk den digitale koordinattstelleren til å måle D-V-koordinatverdien når A-P-armen er på pluss 2,0 og minus 2,0, samt når M-L-armen er på pluss 2,0 og minus 2,0. Juster høyden på tannstangen og ørestangene tilsvarende.</p><p>Etterpå hev sprøyten litt og bor et hull ved hjelp av en tannbor ved injeksjonskoordinatene. Begynn å bore på stedet, arbeider på en sirkulær og skånsom måte. Deretter legger du et stykke bomullsgasbind over det åpne snittet og skyller sprøyten med saltoppløsning.</p><p>Etter spyling, trekk opp en luftboble og deretter en mikroliter oppløsning som inneholder den virale vektoren. Sørg for at virusløsningen enkelt kan visualiseres under luftboblen. Deretter senker du sprøyten, går sakte til ønsket dybde, og pass på at banen er klar av beinfragmenter.</p><p>Deretter injiserer du en mikroliter av virusoppløsningen med en hastighet på 0,4 mikroliter per minutt. Når injeksjonen er ferdig, la det være to minutter til diffusjon før sprøyten trekkes ut. Etter diffusjon, trekk langsomt sprøyten tilbake til spissen av kapillæren er helt trukket tilbake fra hjernen, og sutur deretter forsiktig snittet og fjern dyret fra den stereotoksiske rammen.</p><p>Overvåk dyret i en postoperativ stasjon til bevisstheten gjenvinnes. Dyr holdes i opptil 12 uker etter virusinjeksjon for å tillate bosatt glia å omprogrammere til modne nevroner. For å forberede hjerneskiver for elektrofysiologi ved hjelp av en vibratom, del hjernen fra den mest rostrale delen ned til striatalnivå ved høy hastighet.</p><p>Deretter seksjon striatum coronally på 275 mikrometer på 0,1 millimeter per sekund. Etter hver seksjon, fjern forsiktig den ikke-injiserte striatalsiden og overfør den injiserte siden til et hetteglass med et bunnnett og oksygenisert CREB-følelsessklie i vannbadet ved romtemperatur. Hold hetteglasset ved romtemperatur til alle seksjonene er kuttet.</p><p>Etterpå øker du temperaturen på vannbadet sakte til 37 grader Celsius og la det stå i 30 minutter, slå deretter av varmeren og la den avkjøles til romtemperatur. Etter å ha overført en vevseksjon til et opptakskammer for elektrofysiologi, monter glasspipetten på opptakselektroden og senk den ned i løsningen. Dobbeltsjekk elektrodens motstand.</p><p>Deretter nærmer du deg sakte den omprogrammerte cellen med pipetten, holder et lite positivt trykk i elektroden for å unngå å koble spissen, og kontroller at cellen er GFP positiv før patching. Når cellen er lappet, opprettholde cellen i gjeldende klemme fra minus 60 til minus 70 millivolts, og injisere 500 millisekund strømmer fra minus 20 til pluss 90 picoamperes med 10 picoampere trinn for å indusere handlingspotensialer. Dette indikerer en nevronal modning og vellykket omprogrammering.</p><p>Deretter bytter du til spenningsklemme og måler det indre natriumet og forsinket utbedring av kaliumstrømmene ved depolariserende trinn på 10 millivolt. Her er et innlegg registrert biocytin fylt omprogrammert neuron som viser modne nevronal morfologi og dendrittiske spines. Her viser elektrofysiologiske opptak av de omprogrammerte nevronene tilstedeværelsen av postsynaptiske funksjonelle forbindelser med spontane aktivitetstiltak.</p><p>Spor viser den hemmende aktiviteten som er blokkert med picrotoxin, en GABAA reseptorantagonist og den eksikulerende aktiviteten som er blokkert med CNQX, en AMPA-reseptorantagonist. De lappede nevronene viser allerede postsynaptisk aktivitet ved fem uker etter injeksjon, og fortsetter på åtte og 12 uker etter injeksjon. Antall nevroner med nåværende induserte handlingspotensialer øker også over tid.</p><p>En mer detaljert analyse viste flere distinkte avfyringsmønstre der de fleste cellene viser rask spiking aktivitet som ligner på parvalbumin interneurons. Immunohistokjemisk analyse ved 12 uker viste videre co-uttrykk for reporteren GFP og parvalbumin. Etter denne prosedyren kan du undersøke genuttrykket med patch søke teknikk eller vurdere tredimensjonal synaptisk tilkobling med monosynaptisk sporing og iDISCO.</p><p>Nå som det er mulig å omprogrammere bosatt glia til parvalbumin som uttrykker interneurons, har vi begynt å undersøke om disse er autentiske og kan brukes som et terapeutisk verktøy. Husk å følge de etablerte protokollene og retningslinjene ved håndtering av dyr og bruk av AAV-virus.</p>

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by <em>in vivo</em> Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by <em>In Utero</em> Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Utvidelse av embryonale og voksne nevrale stamceller ved<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation eller Viral stereotaksiske Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-deriverte celler av den voksne Human Brain inn Utførte Nerveceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducing Plasticity av astrocytic Reseptorer av Manipulering av nevronal utløsning priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Limbale Approach-subretinal Injeksjon av virale vektorer for genterapi i Mus retinal pigment epitelet

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Intracerebroventrikulær og intravaskulær injeksjon av viruspartikler og Fluorescent mikroperler inn i Neonatal Brain

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Kanyle implantasjon i Cisterna Magna av gnagere

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Rottemodell av utbredt cerebral kortikale demyelinering indusert av en intracerebral injeksjon av proinflammatoriske cytokiner

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...