Name: in vivo direct reprogramming of resident glial cells into interneurons by intracerebral injection of viral vectors
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors at JoVE.com

<p class="jove_content">Marcella Birtele har finansierats av Europeiska unionens Horizon 2020-program (Horisont 2020-MSCA-ITN-2015) inom ramen för Marie Skłodowska-Curie innovativa utbildningsnätverk och bidragsavtal nr 676408. Daniella Rylander Ottosson har finansierats av Vetenskapsrådet (2017-01234).</p>

<ol>
	<li>Barker, R. A., Parmar, M., Studer, L., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Trials+of+Stem+Cell-Derived+Dopamine+Neurons+for+Parkinson&#39;s+Disease:+Dawn+of+a+New+Era.">Human Trials of Stem Cell-Derived Dopamine Neurons for Parkinson&#39;s Disease: Dawn of a New Era.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Stem Cell</em>. <b>21</b> (5), 569-573 (2017).</li><li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy.">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> <em style='font-style: italic'>Science</em>. <b>344</b> (6180), 1240622 (2014).</li><li>Parmar, M., Torper, O., Drouin-Ouellet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+therapy+for+Parkinson&#39;s+disease:+A+journey+through+decades+toward+the+light+side+of+the+Force.">Cell-based therapy for Parkinson&#39;s disease: A journey through decades toward the light side of the Force.</a> <em style='font-style: italic'>European Journal of Neuroscience</em>. , (2018).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry.">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Reports</em>. <b>12</b> (3), 474-481 (2015).</li><li>Su, Z., Niu, W., Liu, M. L., Zou, Y., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+conversion+of+astrocytes+to+neurons+in+the+injured+adult+spinal+cord.">In vivo conversion of astrocytes to neurons in the injured adult spinal cord.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Communication</em>. <b>5</b>, 3338 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascl1+Converts+Dorsal+Midbrain+Astrocytes+into+Functional+Neurons+In+Vivo.">Ascl1 Converts Dorsal Midbrain Astrocytes into Functional Neurons In Vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neuroscience</em>. <b>35</b> (25), 9336-9355 (2015).</li><li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+Alzheimer&#39;s+disease+model.">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer&#39;s disease model.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Stem Cell</em>. <b>14</b> (2), 188-202 (2014).</li><li>Grande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+impact+on+direct+neuronal+reprogramming+in+vivo+in+the+adult+brain.">Environmental impact on direct neuronal reprogramming in vivo in the adult brain.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Communication</em>. <b>4</b>, 2373 (2013).</li><li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+astrocytes+to+neuroblasts+in+the+adult+brain.">In vivo reprogramming of astrocytes to neuroblasts in the adult brain.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Cell Biology</em>. <b>15</b> (10), 1164-1175 (2013).</li><li>Weinberg, M. S., Criswell, H. E., Powell, S. K., Bhatt, A. P., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vector+Reprogramming+of+Adult+Resident+Striatal+Oligodendrocytes+into+Functional+Neurons.">Viral Vector Reprogramming of Adult Resident Striatal Oligodendrocytes into Functional Neurons.</a> <em style='font-style: italic'>Molecular Therapy</em>. <b>25</b> (4), 928-934 (2017).</li><li>Pereira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Resident+NG2+Glia+into+Neurons+with+Properties+of+Fast-Spiking+Parvalbumin-Containing+Interneurons.">Direct Reprogramming of Resident NG2 Glia into Neurons with Properties of Fast-Spiking Parvalbumin-Containing Interneurons.</a> <em style='font-style: italic'>Stem Cell Reports</em>. <b>9</b> (3), 742-751 (2017).</li><li>Rivetti di Val Cervo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+functional+dopamine+neurons+from+human+astrocytes+in+vitro+and+mouse+astrocytes+in+a+Parkinson&#39;s+disease+model.">Induction of functional dopamine neurons from human astrocytes in vitro and mouse astrocytes in a Parkinson&#39;s disease model.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Biotechnology</em>. <b>35</b> (5), 444-452 (2017).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation.">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> <em style='font-style: italic'>Molecular Therapy Methods &#38; Clinial Development</em>. <b>10</b>, 1-7 (2018).</li><li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+neurons+via+direct+conversion+in+vivo.">Generation of induced neurons via direct conversion in vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America</em>. <b>110</b> (17), 7038-7043 (2013).</li><li>Kawaguchi, Y., Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+physiological+subgroupings+of+nonpyramidal+cells+with+parvalbumin-+and+calbindinD28k-immunoreactive+neurons+in+layer+V+of+rat+frontal+cortex.">Correlation of physiological subgroupings of nonpyramidal cells with parvalbumin- and calbindinD28k-immunoreactive neurons in layer V of rat frontal cortex.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neurophysiology</em>. <b>70</b> (1), 387-396 (1993).</li><li>Grealish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A9+dopamine+neuron+component+in+grafts+of+ventral+mesencephalon+is+an+important+determinant+for+recovery+of+motor+function+in+a+rat+model+of+Parkinson&#39;s+disease.">The A9 dopamine neuron component in grafts of ventral mesencephalon is an important determinant for recovery of motor function in a rat model of Parkinson&#39;s disease.</a> <em style='font-style: italic'>Brain</em>. <b>133</b> (Pt 2), 482-495 (2010).</li><li>Thompson, L., Barraud, P., Andersson, E., Kirik, D., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dopaminergic+neurons+of+nigral+and+ventral+tegmental+area+subtypes+in+grafts+of+fetal+ventral+mesencephalon+based+on+cell+morphology,+protein+expression,+and+efferent+projections.">Identification of dopaminergic neurons of nigral and ventral tegmental area subtypes in grafts of fetal ventral mesencephalon based on cell morphology, protein expression, and efferent projections.</a> <em style='font-style: italic'>Journal of Neuroscience</em>. <b>25</b> (27), 6467-6477 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content">Författarna har inget att avslöja.</p>

<p class="jove_content">In vivo direkt omprogrammering kan uppnås med hjälp av AAV FLEX vektorer i CRE-uttrycker mus stammar. Det är viktigt att notera att skillnader mellan mus stammar när det gäller omprogrammering effekt har observerats. För in vivo-omprogrammering i striatum har NG2-CRE-muslinjen visat sig vara mer effektiv jämfört med andra stammar. Innan du börjar använda en ny djur stam, är det viktigt att kontrollera mus leverantörens riktlinjer om CRE uttryck över tiden, som ålder av djur ofta påverkar specificiteten av detta proteinuttryck. I våra studier användes inte djur som var äldre än 12 veckor för in vivo-omprogrammering eftersom det fanns en risk för CRE-uttryck i andra celler än NG2 glia. Konstant närvaro och övervakning av kontrolldjur injiceras endast med Synapsin-FLEX-GFP konstruera rekommenderas. Detta möjliggör övervakning av djuren för GFP-positiva celler som inte bör förekomma om inga omprogrammering gener (ALN) används.</p>
<p class="jove_content">För att identifiera de nyligen omprogrammerade neuronerna är en neuron-specifik identifieringsmetod som den som beskrivs i detta protokoll av yttersta vikt. Detta möjliggör en korrekt identifiering och åtskillnad av omprogrammerade neuroner från endogena omgivande celler som är av särskild relevans när omprogrammering i en homotopiska region.</p>
<p class="jove_content">Det är också viktigt att rikta den korrekta strukturen för viral injektion. Därför är stereotaxic kirurgi för viral injektion viktigt och måste kontaktas med noggrannhet, särskilt när man riktar mindre strukturer i hjärnan.</p>
<p class="jove_content">Vi har tidigare visat<sup class="xref">11</sup> att det inte är tillförlitligt att förutsäga resultatet av in vivo omprogrammering baserat på in vitro-omprogrammering experiment med samma omprogrammering faktorer. Alla faktorer av intresse måste därför testas in vivo. I våra händer, många olika faktor kombinationer ger samma subtyp av nervceller (dvs, Interneuron<sup class="xref">11</sup> in vivo) trots att dessa gener har varit inblandade i utvecklingen av andra nervceller.</p>
<p class="jove_content">Hela-cell patch klämma för omprogrammerade nervceller är en känslig teknik och vävnad bearbetning är viktigt för ett bra resultat. Perfusion med iskall Krebs lösning förbättrar vävnads kvaliteten. Också, lappade nervceller måste behandlas noggrant. Även om mognad och fenotypisk identitet omprogrammerade neuroner kan bedömas något med hjälp av hela cell patch Clamp, dessa celler är inte helt jämförbar med deras endogena motsvarigheter. Ytterligare typer av analyser, såsom Genomsekvensering (t. ex. RNA-sekvensering), bör användas för att ytterligare bekräfta omprogrammerad cell identitet.</p>
<p class="jove_content">Den teknik som beskrivs häri kan övervägas för utveckling av framtida terapier där neuronala ersättning behövs i hjärnan. Även om in vivo omprogrammering är fortfarande i ett tidigt skede och översättningen till människor är ännu inte förutses, denna teknik kan ge en metod för att bedöma exogena genfunktion i hjärnan och studera cell mognad in vivo.</p>

<p class="jove_content">Det övergripande målet med denna metod är att effektivt omvandla hjärnans hemvist glia in vivo till funktionella och subtypspecifika nervceller som parvalbumin-uttrycker interneuroner. Detta ger ett steg framåt mot utvecklingen av en alternativ cell substitutionsterapi för hjärnsjukdomar utan behov av en exogen cell källa. Det skapar också ett verktyg för att studera cell omvandling växlar in situ.</p>
<p class="jove_content">Hjärnan har endast en begränsad kapacitet för att generera nya nervceller. Därför, i neurologiska sjukdomar, det finns ett behov av exogena cell källor för hjärn reparation. För detta har olika källor av celler utsatts för intensiv forskning genom åren, inklusive celler från primär vävnad, stamceller-härledda celler och omprogrammerade celler<sup class="xref">1</sup><sup>,</sup><sup class="xref">2</sup><sup>,</sup><sup class="xref">3</sup>. Direkt omprogrammering av inhemska hjärnceller till nervceller är en ny metod som kan ge en attraktiv metod för hjärn reparation som den använder patientens egna celler för att generera nya nervceller inne i hjärnan. Hittills har flera rapporter visat in vivo omprogrammering genom viral vektor leverans i hjärnan<sup class="xref">4</sup><sup>,</sup><sup class="xref">5</sup><sup>,</sup><sup class="xref">6</sup><sup>,</sup><sup class="xref">7</sup><sup class="xref">8</sup><sup>,</sup><sup class="xref">9</sup> i olika hjärnregioner såsom hjärnbarken, ryggmärgen, striatum och mellanhjärnan<sup class="xref">5</sup><sup>,</sup><sup class="xref">10</sup><sup>,</sup><sup class="xref">11</sup>, samt i intakt och bort hjärna<sup class="xref">5</sup><sup>,</sup><sup class="xref">8</sup><sup>,</sup><sup class="xref">11</sup><sup>,</sup><sup class="xref">12</sup>. Både hämmande och excitatoriska nervceller har erhållits<sup class="xref">4</sup><sup>,</sup><sup class="xref">8</sup>, men den exakta fenotyp eller funktionalitet av dessa celler har ännu inte analyserats i detalj.</p>
<p class="jove_content">I detta protokoll beskriver vi en effektivare omprogrammering och cellspecifik identifiering av in vivo omprogrammerade neuroner. Vi tillhandahåller ett protokoll för funktionell bedömning av neuronala mognad och fenotyp karakterisering baserat på funktionalitet och immunohistokemiska drag.</p>
<p class="jove_content">Vi använde en CRE-inducible AAV vektor och en GFP reporter för att identifiera in vivo omprogrammerade neuroner. Detta val av virala vektorer har fördelen att infektera både dividera och icke-skiljande celler i hjärnan, öka antalet riktade celler, som ett alternativ till användning av retrovirus<sup class="xref">7</sup><sup>,</sup><sup class="xref">8</sup>. En neuron-specifika synapsin-driven FLEX reporter (GFP), gjorde det möjligt för oss att specifikt upptäcka den nyligen genererade nervceller. Tidigare studier har använt subtypspecifika initiativtagare för in vivo omprogrammering<sup class="xref">7</sup><sup>,</sup><sup class="xref">9</sup>, som också tillåter uttrycket av omprogrammering gener och reportrar i specifika celltyper. Emellertid, denna metod kräver ytterligare identifiering av omprogrammerade neuroner genom efter döden analys av co-uttryck av reporter och neuronala markörer. Användningen av en neuron-specifik reporter, såsom den som beskrivs häri, möjliggör en direkt identifiering. Detta ger ett direkt bevis på en lyckad omvandling och tillåter en levande cell identifiering som krävs för patch-Clamp elektrofysiologi.</p>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CA-FLEX</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>38042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>67291</td>
			<td>NM_008553.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lmx1a</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>33013</td>
			<td>NM_0033652.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nurr1</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>35000</td>
			<td>NM_013613.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-syn</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>30456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoxP (FLEX) sequence 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac<br/>gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc<br/>accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg<br/>acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa<br/>gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga<br/>agaggctctaga</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoxP (FLEX) sequences 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tactagtataacttcgtataggatactttatac<br/>gaagttatcattgggattcttcctattttgatc<br/>caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct<br/>caccatcgacccataacttcgtatagcatacat<br/>tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa<br/>ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDP5</td>
			<td>Plasmid Factory</td>
			<td>PF435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDP6</td>
			<td>Plasmid Factory</td>
			<td>PF436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)+ Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85120602-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>10078780</td>
			<td>175 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris H-CL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td>
			<div>
			<div>For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>EDTA: Invitrogen</td>
			<td>EDTA: AM9260G</td>
			<td>
			<div>
			<div>For TE buffer use 1 mM EDTA</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>see Ultrapure water system</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>2.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>
			<div>
			<div>FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>
			<div>
			<div>For lysis Buffer: 1 mM</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge sealing tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Quick-Seal&#174;&#160;Polypropylene Tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep&#8482;&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-mL syringe-18G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>?</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anion exchange filter</td>
			<td>PALL laboratory</td>
			<td>MSTG25Q6</td>
			<td>
			<div>
			<div>Acrodisc unit with Mustang Q membrane</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter unit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z740210-24EA</td>
			<td>
			<div>
			<div>Amicon Ultra-4 device</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A33073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Novatech</td>
			<td>30209-1232</td>
			<td>
			<div>
			<div>CGGCCTCAGFGAGCGA</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#180;FAM / 3&#180;BHQ1 probe</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>Millex-GV filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -20 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fridge +4 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV viral room</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Water system</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Milli-Q&#174; IQ 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>2540 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase Chain Reaction (PCR)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative PCR (qPCR)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler&#174; 480 System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>ANIMAL MODEL</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2-Cre mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>NG2-CrexB6129, Stock #008533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolfurane</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>Dilute to 1% solution with warm water.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Viroderm</td>
			<td>7511&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td>P0500000</td>
			<td>
			<div>
			<div>i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blu</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrobeads</td>
			<td>Lumafluor</td>
			<td>R170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Apoteket AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>From RSG Solingen.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-1552</td>
			<td>From Biochem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>232-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>232-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RSGA106.621</td>
			<td>Number 20.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RSGA106.200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting Europe</td>
			<td>51500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ear bars</td>
			<td>Stoelting Europe</td>
			<td>51648</td>
			<td>5 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with Removable needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>65</td>
			<td>
			<div>
			<div>0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capilaries</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary puller</td>
			<td>Sutter company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>1464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>GT420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Chamber and pump</td>
			<td>Agnthos AB</td>
			<td>8323101</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z118400-30EA</td>
			<td>25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z192414&#160;Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Braintree scientific, inc</td>
			<td>53800M</td>
			<td>
			<div>
			<div>From Covidien 2187.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton gauze</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Elfa Distrelec</td>
			<td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-366-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>-H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl<sub>2</sub>-6 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl<sub>2</sub>-6 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7 H<sub>2</sub>O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO<sub>3</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>
			<div>
			<div>see Ultrapure Water system</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1 or 2M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-D-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#8217;-2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrotoxin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1675&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C239&#160;Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass pipette</td>
			<td>Sutter Company</td>
			<td>B150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary puller</td>
			<td>Sutter company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WaterBath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<div>
			<div>Use at a concentration of 4%.&#160;CAUTION:&#160;PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td>
			<div>
			<div>Use at a concentration of 0.1%.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10254640</td>
			<td>
			<div>
			<div>Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td>
			<div>
			<div>Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20&#176;C,&#160;light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>
			<div>
			<div>1: 600 in KPBS-T.</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin- Cy3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434315</td>
			<td>1:5000, rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD65/67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
			<td>1:2000, mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:200, goat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Chat</td>
			<td>Merk</td>
			<td>AB143</td>
			<td>1:5000, rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NPY</td>
			<td>Immunostar</td>
			<td>22940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub></td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NIST200B</td>
			<td>1:1000, chicken.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10981</td>
			<td>
			<div>
			<div>Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO&#174;, antifading</div>
			</div>
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-freeze solution</td>
			<td>Tissue Pro Technology</td>
			<td>AFS05-1000N, 1000 mL/ea.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><strong>EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</strong></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8 laser scanning confocal microscope.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo direct reprogramming of resident glial cells into interneurons by intracerebral injection of viral vectors

<p class="jove_content">Omvandla Resident glia i hjärnan till funktionella och subtypspecifika nervceller in vivo ger ett steg framåt mot utvecklingen av alternativa cell Replacement terapier samtidigt skapa verktyg för att studera cell öde på plats. Hittills har det varit möjligt att få nervceller via in vivo omprogrammering, men den exakta fenotyp av dessa nervceller eller hur de mogna har inte analyserats i detalj. I detta protokoll beskriver vi en effektivare omvandling och cellspecifik identifiering av in vivo omprogrammerade neuroner, med hjälp av ett AAV-baserat virusvektor system. Vi tillhandahåller också ett protokoll för funktionell bedömning av de omprogrammerade cellernas neuronala mognad. Genom att injicera flip-excision (FLEX) vektorer, som innehåller omprogrammering och synapsin-driven reporter gener till specifika celltyper i hjärnan som fungerar som mål för cell omprogrammering. Denna teknik möjliggör enkel identifiering av nyligen omprogrammerade neuroner. Resultaten visar att de erhållna omprogrammeras nervceller funktionellt mogna över tid, ta emot synaptiska kontakter och Visa elektrofysiologiska egenskaper hos olika typer av interneuroner. Med hjälp av transkriptionsfaktorerna Ascl1, Lmx1a och Nurr1 har majoriteten av de omprogrammerade cellerna egenskaper snabb-spiking, parvalbumin-innehållande interneuroner.</p>

<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">Injektionen av AAV-vektorer används för att framgångsrikt omprogrammera Resident NG2 glia-celler till neuroner i NG2-CRE-musstriatum (<strong class="xfig">figur 1a</strong>). För att specifikt rikta NG2 glia, är FLEX vektorer med omprogrammering/reporter gener, infogas i en antisense riktning och flankerad av två par antiparallel, heterotypic loxP platser (<strong class="xfig">figur 1b</strong>). Var och en av de tre omprogrammeringgener (Ascl1, Lmx1a och Nurr1) placeras under kontroll av den allestädes närvarande CBA promotorn på enskilda vektorer. För att se till att GFP-uttrycket är begränsat till omprogrammerade neuroner från en CRE-uttrycker cell, är GFP placerad under kontroll av neuron-specifika synapsin promotor, (även i en FLEX vektor).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">Användningen av kombinationen av omprogrammering och reporter konstruktioner möjliggör generering av GFP-positiva nervceller i mus striatum (<strong class="xfig">figur 1c</strong><strong>, C '</strong>). Användningen av reportern konstruera utan förekomst av omprogrammering gener ger inte GFP-positiva neuroner (<strong class="xfig">figur 1d</strong>).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">De omprogrammerade nervceller som är biocytin fyllda är synliga efter obduktion Immuno-färgning (<strong class="xfig">figur 2A</strong>). Om omvandlingen är framgångsrik, bör det finnas omfattande neuronala morfologi. De elektrofysiologiska inspelningar av omprogrammerade neuroner visar förekomst av postsynaptiska funktionella anslutningar med spontana aktivitetsåtgärder (<strong class="xfig">figur 2b</strong><strong>, C</strong>). Detta kan blockeras med antingen jonotropa GABAergic eller glutamatergic blockerare (picrotoxin eller cnqx), vilket tyder på både excitatoriska och hämmande synaptisk input till omprogrammerade nervceller. Förekomsten av spontan aktivitet ökar med tiden efter viral injektion (<strong class="xfig">figur 2D</strong>), indikerar en gradvis mognad.</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">Ström-inducerad åtgärd potentialer finns i funktionella nervceller. Åtgärden potentialer öka i antal över tiden efter konvertering (<strong class="xfig">figur 2e</strong>). Detta indikerar ytterligare mogningen i neuronala funktion. I en omogen neuron, nuvarande kommer att inducera antingen ingen eller mycket få åtgärder potentialer (<strong class="xfig">figur 2F</strong>).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1">Den bränning mönster av en neuron är celltyp specifika eftersom det beror på faktorer som morfologin av cellerna och kanal uttrycket<sup class="xref">15</sup>. De inspelade mönstren i de in vivo omprogrammerade neuronerna kan särskiljas i grupper och jämföras med den hos endogena neuronala subtyper, t ex snabbspiking interneuroner (celltyp B, <strong class="xfig">figur 3b</strong>) eller andra celltyper (<strong class="xfig">figur 3a</strong><strong>, C, D </strong>). De observerade elektrofysiologiska skillnaderna kan bekräftas av närvaron av specifika subtypmarkörer och samuttryck med GFP (<strong class="xfig">figur 3E</strong><strong>-H</strong>). Sammantaget visar dessa data att de omprogrammerade neuronerna som finns i striatum har egenskaper hos olika typer av interneuroner, såsom parvalbumin-, ChAt-och NPY-uttryckande interneuroner, liksom striatala medium taggig neuron identitet (DARPP32 +) ( <strong class="xfig">Figur 3E</strong> <strong>-H</strong>).</p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"><br><strong>Figur 1: in vivo omprogrammering av Resident NG2 glia till neuroner.</strong> (<strong>A</strong>) schematisk representation av AAV-virumedierad in vivo-omprogrammering av striatala NG2 glia. (<strong>B</strong>) schematisk representation av AAV5 Flex konstruktioner som används för in vivo omprogrammering, där genuttryck regleras av CRE uttryck i de riktade cellerna. (<strong>C</strong> och <strong>c</strong>) in vivo omprogrammerade neuroner, till följd av syn-GFP + ALN-injektion i striatum. (<strong>D</strong>) avsaknad av omprogrammerade neuroner när inga omprogrammering faktorer läggs in i viral cocktail, och endast reporter konstruera injiceras in vivo. Skalstreck = 100 mm (C), 25 mm (C '), 25 mm (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a></p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"><br><strong>Figur 2: in vivo omprogrammerade neuroner är funktionella och visar mognad över tid.</strong> (<strong>A</strong>) biocytin-fyllda omprogrammerade neuron, visar mogen neuronala morfologi, inklusive dendritiska taggar. Spår visar (<strong>B</strong>) hämmande (GABAergic) aktivitet som är blockerad med picrotoxin, en GABA<sub>a</sub> -receptorantagonist och (<strong>C</strong>) excitatoriska aktivitet som är blockerad med cnqx, en AMPA-receptorantagonist. (<strong>D</strong>) antalet neuroner med postsynaptisk aktivitet ökar med tiden. (<strong>E</strong>) lappade nervceller visar repetitiva bränning redan vid 5 veckor efter injektion (w.p.i.) och fortsätter att visa att vid 8 och 12 W.p.i. (<strong>F</strong>) ström-inducerad åtgärd potential och postsynaptisk aktivitet av en omogen neuron, visar några synaptiska händelser och få actionpotentialer jämfört med B och D. Scale bar = 25 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a></p>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"><br><strong>Figur 3: in vivo omprogrammerade neuroner visar immunohistokemiska och elektrofysiologiska egenskaper av striatala interneuroner.</strong> (<strong>a-D</strong>) Den bränning mönster av in vivo omprogrammerade nervceller kan vara av olika typer: (<strong>a</strong>) typ A liknar endogena medium taggig neuron (DARPP32 +); (<strong>B</strong>) liknar snabb-spiking (PV +) interneuroner; (<strong>C</strong>) liknar låg tröskel tillsatta nervceller med framstående SAG (NPY +); (<strong>D</strong>) neuroner avfyras med stora efter hyperpolarisering (chat +). (<strong>E-H</strong>) Konfokala bilder som visar samlokalisering av GFP och euron markörer PV (<strong>E</strong>), Chat (<strong>F</strong>), NPY (<strong>G</strong>), och projektion neuron markör DARPP32 (<strong>H</strong>). Alla skalstreck = 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a></p>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors at JoVE.com

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In vivo direkt omprogrammering av bosatta gliaceller i interneuroner genom intracerebral injektion av virala vektorer

<p class="jove_content">Detta protokoll syftar till att generera direkt omprogrammeras interneuroner in vivo, med hjälp av en AAV-baserade virus system i hjärnan och en FLEX synapsin-driven GFP reporter, som möjliggör cell identifiering och ytterligare analys in vivo.</p>

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

<p>Detta protokoll visar att det är möjligt att generera nya nervceller direkt i hjärnan från bosatta glia och att dessa omprogrammerade celler mogna till subtyp-specifika nervceller. Den största fördelen är det cre-beroende AAV-virus som möjliggör specifik inriktning av NG2-glia och GFP-reportern som etiketterar de omprogrammerade nervcellerna för analys. Generera nya nervceller i hjärnan kan leda till framtida utveckling för cellersättning terapier i hjärnan.</p><p>I vårt protokoll genererar vi de parvalbumin-positiva interneurons som har konsekvenser för psykiatriska störningar. In vivo omprogrammering kan tillämpas på andra områden hjärnan och kretsar beroende på vad neuronal fenotyp och neurologiska tillstånd du vill rikta. Demonstrerar proceduren blir Jenny Johansson:a tekniker, Maria Pereira:a tidigare doktorand, och Marcella Birtele:a phd student i vårt lab.</p><p>För att producera AAV5 viral vektor, utsäde HEK293T celler med standard odlingsmedium i fem T175 kolvar. När cellerna når 50 till 70%konfluency, förbereda följande mix för transvection. I en 50 milliliter centrifuge rör, lägga till lika molar mängder av vektor plasmid, och pDG-serien helper plasmid.</p><p>Lägg tris-EDTA buffert till en slutlig volym av 144 mikroliter sedan lägga till ultrapure vatten för att resultera i en total volym av 1296 mikroliter och blanda. Därefter lägger du till 144 mikroliter av 2,5 molar kalciumklorid och blanda. Därefter lägger du till 1,92 milliliter HBS till DNA-lösningen och virvelen omedelbart.</p><p>Inkubera i rumstemperatur i exakt 60 sekunder. Därefter överför lösningen till 28 milliliter av färskt cellodlingsmedium och blanda. Byt ut mediet i kolvarna mot det medium som innehåller transvection mix.</p><p>Vänta i tre dagar, och överför media till avfall. Tillsätt fem milliliter skördebuffert till varje kolv, tillsätt sedan ytterligare fyra milliliter DPBS till varje kolv för att skölja de återstående cellerna och pool med celllösningen. Centrifugera de skördade cellerna vid 1, 000 x g i fem minuter vid fyra grader Celsius.</p><p>Efter centrifugeringen, avlägsna supernatanten och lös upp pelleten i 15 milliliter lysbuffert. Frys 50 milliliter centrifugeröret på torris i 15 minuter och förvara i en minus 20 grader Celsius frys. Före användning tina den skördade cellen lysate i ett vattenbad vid 37 grader Celsius.</p><p>I detta förfarande, utför AAV rening genom iodixanol gradient ultracentrifugation och använda ultracentrifug takrör med centrifugering vid 350, 000 x g i en timme och 45 minuter vid rumstemperatur. För att extrahera AAV-innehållande fas, sätt in en 10 milliliter spruta med en 18 gauge nål på cirka två millimeter under 40 till 60%fas gränsen med avfasningen uppåt och dra tillbaka. Se till att sluta innan du når proteinbandet efter fem till sex milliliter av viral vektor har extraherats.</p><p>Sedan, rena och koncentrera den utspädda iodixanol gradienten genom en anjon utbyte filter, genom att driva igenom den i en takt inte snabbare än en droppe per sekund. Därefter trycker du tre milliliter IE-buffert långsamt genom filtret för att tvätta det. Därefter elute blandningen i en centrifugalfilterenhet med en till två milliliter elueringsbuffert.</p><p>Lägg till DPBS till enheten till en slutlig volym på fyra milliliter. Centrifugera vid 2, 000 x g vid rumstemperatur tills mindre än 0,5 milliliter DPBS lämnas kvar i filtret. Efteråt, ta bort vätska från botten av röret, fylla på med fyra milliliter DPBS, och centrifug igen.</p><p>Upprepa detta steg ytterligare två gånger, se till att volymen koncentrerad vektor på filtret är ca 200 mikroliter efter den sista centrifugeringen. Ta bort den 200 mikroliter koncentrerade vektorn med hjälp av en pipetten, och tryck igenom en 0,22 mikrometer filter för att sterilisera. Därefter alikvot 200 mikroliter i en glasflaska med förreglade insats.</p><p>För att injicera omprogrammeringsfaktorer placerar du en sövd mus i stereotaxic-ramen. Administrera lämpliga analgesi i början av operationen, sedan ta med spetsen av glas kapillären av injektionsnålen strax ovanför bregma. Se till att kapillärspetsen är helt rak i både A-P- och M-L-plan.</p><p>Återställ både M-L- och A-P-värdena till 0,0 på den digitala koordinaträknaren. För att se till att djurets huvud är i ett helt plant läge, använd den digitala koordinaträknaren för att mäta D-V-koordinatvärdet när A-P-armen är på plus 2,0 och minus 2,0 samt när M-L-armen är på plus 2,0 och minus 2,0. Justera höjden på tandstången och öronstängerna i enlighet med detta.</p><p>Efteråt, höj sprutan något och borra ett hål med hjälp av en tandborr vid injektionskoordinaterna. Börja borra på platsen, arbeta i en cirkulär och skonsam sätt. Placera sedan en bit bomullsgasväv över det öppna snittet och spola sprutan med saltlösning.</p><p>Efter spolning, rita upp en luftbubbla och sedan en mikroliter lösning som innehåller viral vektor. Se till att viral lösning lätt kan visualiseras under luftbubblan. Därefter sänk sprutan, fortskrider långsamt till önskat djup, och var säker på att banan är fri från benfragment.</p><p>Därefter injicera en mikroliter av viruslösningen med en hastighet av 0,4 mikroliter per minut. När injektionen är klar, låt två minuter för diffusion före spruttillbakadragande. Efter diffusion, dra långsamt tillbaka sprutan tills toppen av kapillären är helt tillbaka från hjärnan, suturera sedan försiktigt snittet och ta bort djuret från den stereotaxiska ramen.</p><p>Övervaka djuret i en postoperativ station tills medvetandet återfås. Djur hålls i upp till 12 veckor efter virusinjicering för att tillåta bosatta glia att programmera om till mogna nervceller. För att förbereda hjärnan skivor för elektrofysiologi med hjälp av en vibratom, dela upp hjärnan från den mest rostrala delen ner till striatal nivå vid hög hastighet.</p><p>Dela sedan upp striatumkoronally vid 275 mikrometer på 0,1 millimeter per sekund. Efter varje avsnitt, ta försiktigt bort den icke-injicerade striatalsidan och överför den injicerade sidan i en injektionsflaska med ett bottennät och syresatt CREB-avkänningsrutschkana i vattenbadet vid rumstemperatur. Håll injektionsflaskan i rumstemperatur tills alla sektioner är avskurna.</p><p>Efteråt, långsamt öka temperaturen i vattenbadet till 37 grader Celsius och lämna den i 30 minuter, stäng sedan av värmaren och låt den svalna till rumstemperatur. Efter att ha överfört en vävnadssektion till en inspelningskammare för elektrofysiologi, montera glaspipetten på inspelningselektroden och sänk ner den i lösningen. Dubbelkolla elektrodens motstånd.</p><p>Sedan, långsamt närma sig omprogrammerad cell med pipetten, hålla ett lätt positivt tryck i elektroden för att undvika att plugga spetsen, och kontrollera att cellen är GFP positiv innan lappning. När cellen är lappad, behålla cellen i strömklämma från minus 60 till minus 70 millivolt, och injicera 500 millisekunders strömmar från minus 20 till plus 90 picoamperes med 10 picoampere-steg för att framkalla handlingspotentialer. Detta är ett tecken på en neuronal mognad och framgångsrik omprogrammering.</p><p>Därefter, växla till spänning klämma och mäta inåt natrium och fördröjd rättning av kaliumströmmar vid depolariserande steg på 10 millivolt. Här är ett inlägg inspelade biocytin fyllda omprogrammerade neuron som visar mogna neuronal morfologi och dendritiska ryggar. Här visar elektrofysiologiska inspelningar av de omprogrammerade nervcellerna förekomsten av postynaptic funktionella anslutningar med spontana aktivitetsåtgärder.</p><p>Spår visar den hämmande aktivitet som är blockerad med pikrotoxin, en GABAA-receptorantagonist och den excitatoriska aktivitet som är blockerad med CNQX, en AMPA-receptorantagonist. Den lappade nervceller visar redan postynaptic aktivitet på fem veckor efter injektion, och fortsätta på åtta och 12 veckor efter injektion. Antalet nervceller med nuvarande inducerad åtgärder potentialer ökar också över tiden.</p><p>En mer detaljerad analys visade flera distinkta bränning mönster där majoriteten av celler visar snabb spiking verksamhet som liknar parvalbumin interneurons. Immunohistochemical analys på 12 veckor visade ytterligare co-uttryck av reportern GFP och parvalbumin. Efter denna procedur kan du undersöka genen uttryck med patch söka teknik eller bedöma de tredimensionella synaptic anslutning med monosynaptic spårning och iDISCO.</p><p>Nu när det är möjligt att programmera om resident glia till parvalbumin som uttrycker interneurons, har vi börjat undersöka om dessa är autentiska och kan användas som ett terapeutiskt verktyg. Kom ihåg att följa de fastställda protokollen och riktlinjerna vid hantering av djur och användning av AAV-virus.</p>

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intrakraniell Injektion av Adeno-associerad virala vektorer

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

Autologt blod Injection till Model Spontan intracerebralt blödning i Möss

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by <em>in vivo</em> Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att<em> In vivo</em> Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by <em>In Utero</em> Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Utbyggnad av embryonala och vuxna neurala stamceller genom<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporering eller viral stereotaxisk injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-härledda celler i den vuxna mänskliga hjärnan i inducerade Nervceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion Plasticitet hos astrocytiska Receptorer genom manipulering av neuron priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Limbal Approach-subretinal Injektion av virala vektorer för genterapi hos möss retinal pigmentepitel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Intracerebroventrikulär och intravaskulär injektion av viruspartiklar och fluorescerande mikropärlorna i neonatal hjärna

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Kanyl Implantation i Cisterna Magna gnagare

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Råtta modell av utbredd cerebrala när demyelination framkallas av en intrakraniell injektion av proinflammatoriska cytokiner

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...