Name: an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes
Uploaded: 2019-04-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

نشكر Anke جوريتش ، ديانا Woellner ، الدكتور Kathrin ويت و كورنيليا هيكمان للحصول علي المساعدة في الإجراءات التجريبية وبنيامين تيكاتزي من Biolegend للحصول علي تعليقات مفيده علي استراتيجية النابضة. تم دعم J.S. من قبل المنحة هيلهولتز (ICEMED). وقد دعمت هذه الدراسة بمنح من وحده البحوث الاكلينيكيه التابعة لمعهد برلين للصحة ، و "منحه BCRT" التي قدمتها وزاره التعليم والبحوث الاتحادية المانيه ومؤسسه اينشتاين. K.S.-B. و D.V. مموله من قبل FOR2165.

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبرات التابعة للمعاهد الوطنية للصحة وقانون رعاية الماشية تحت اشراف لجنتنا المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها. وأجريت بروتوكولات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية الاخلاقيه المؤسسية لل Charité برلين ، ألمانيا ، وتمت الموافقة عليها من ق...

<ol>
	<li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis.</a> BMC Public Health. 9, 88 (2009).</li><li>Prentki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+&#946;+cell+failure+in+type.">Islet &#946; cell failure in type.</a> J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).</li><li>Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+insulin+resistance.">Inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444, 840 (2006).</li><li>Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+immune+system+and+adipose+tissue+in+obesity.">Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+fat,+and+the+emergence+of+immunometabolism.">Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).</li><li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies.">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610 (2011).</li><li>Onodera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+induce+PPAR&#947;-high+FOXP3(+)+regulatory+T+cells.">Adipose tissue macrophages induce PPAR&#947;-high FOXP3(+) regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system.">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).</li><li>Calle, E. E., Kaaks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overweight,+obesity+and+cancer:+epidemiological+evidence+and+proposed+mechanisms.">Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).</li><li>Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Nonalcoholic+Steatohepatitis:+Eat,+Delete,+and+Inflame.">Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame.</a> Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).</li><li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice+by+normalizing+environment.">Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment.</a> Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).</li><li>Sbierski-Kind, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Housing+Conditions+Reveal+a+Major+Impact+of+Adaptive+Immunity+on+the+Course+of+Obesity-Induced+Type+2+Diabetes.">Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes.</a> Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).</li><li>Japp, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+immunology+assessed+by+multidimensional+mass+cytometry.">Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).</li><li>Benedict, M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease:+An+expanded+review.">Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review.</a> World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).</li><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+Immunity,+and+Metabolic+Disease.">Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+Cells+in+Adipose+Tissue.">The Immune Cells in Adipose Tissue.</a> Diabetes, Obesity &amp; Metabolism. 15, 34-38 (2013).</li><li>Bertola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+expression+patterns+of+inflammatory+and+immune+response+genes+associated+with+obesity+and+NASH+in+morbidly+obese+patients.">Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients.</a> PloS One. 5 (10), e13577 (2010).</li><li>Turnbaugh, P. J., B&#228;ckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-Induced+Obesity+Is+Linked+to+Marked+but+Reversible+Alterations+in+the+Mouse+Distal+Gut+Microbiome.">Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome.</a> Cell Host &amp; Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).</li><li>Singh, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+diet+on+the+gut+microbiome+and+implications+for+human+health.">Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).</li><li>M&#252;ller, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+barrier+impairment+by+high-fat+diet+in+mice+depends+on+housing+conditions.">Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions.</a> Molecular Nutrition &amp; Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).</li></ol>

التهاب الكبد الدهني له علاقة قويه مع تشوات الأيض مثل السمنة ، ومقاومه الانسولين وعسر الدهون15. تشير الدراسات المتعددة إلى ان التهاب الانسجه الدهنية يمكن ان يدفع التسبب في مرض السكري من النوع 2 ، بما في ذلك مستويات الخلايا المتغيرة لكل من الجهاز المناعي الفطري والمتكيف<sup class="xref...

السمنة هي اضطراب متعدد العوامل وعامل خطر رئيسي للاصابه بامراض القلب ، والسكتة الدماغية ، والتهاب الكبد غير الكحولي (ناش) ، ومرض السكري من النوع 2 (T2D) وبعض أنواع السرطان. ويتزايد انتشار السمنة بسرعة علي الصعيد العالمي. واليوم ، 2,100,000,000 شخصا-اي ما يقارب 30% من سكان العالم-يعانون من السمنة المفرطة أو الوزن الزائد1. يمكن ان تؤدي مقاومه الانسولين المرتبطة بالسمنة إلى T2D ، عندما تفشل خلايا بيتا البنكرياس المستنفدة لتعويض الحاجة المتزايدة للانسولين للحفاظ علي التوازن الجلوكوز2.
تتكون الانسجه الدهنية من أنواع مختلفه من الخلايا بما في ذلك الخلايا الشحمية والبطانات الليفية والخلايا المناعية. اثناء تطور السمنة ، يمكن ان تؤدي التغيرات في عدد ونشاط الخلايا المناعية إلى التهاب منخفض الدرجة من الانسجه الدهنية التضخمية3،4. علي وجه التحديد, وقد وجد ان الإفراط في استهلاك الطاقة, يرافقه مستويات مرتفعه بشكل مزمن من الجلوكوز في الدم, الدهون الثلاثية والأحماض الدهنية الحرة, يؤدي إلى نقص الأكسجين الشحمي, الإجهاد الشبكي إندوبلازمي, ضعف وظيفة الميتوكوندريا إفراز السايسيسيني المعزز ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا المناعية الدهنية الموالية للالتهابات5،6. ركزت الأبحاث السابقة أساسا علي المناعة الفطرية ، ولكن الخلايا المناعية المتكيفة مؤخرا (خلايا T و B) برزت كمنظمين مهمين لتوازن الجلوكوز. انها تمتلك التهابات ( بما في ذلك خلايا CD8 + t ، Th1 ، والخلايا B) أو الوظائف التنظيمية في المقام الأول (بما في ذلك الخلايا t (treg) التنظيمية ، Th2 الخلايا) ويمكن ان تؤدي إلى تفاقم أو حماية ضد مقاومه الانسولين7،8 , 9-الآن
وعلاوة علي ذلك ، اقترحت عده أليات لشرح كيفيه زيادة السمنة التهاب الكبد ، بما في ذلك زيادة إنتاج السايتوكينات بالانسجه الدهنية10. ناش ، الشكل التقدمي لمرض الكبد الدهني غير الكحولية والعبء الصحي الرئيسي في البلدان المتقدمة ، ويتميز نسيجيا بخلايا الكبد المتضخمة ، وتراكم الدهون ، والتليف والتهاب بيريسيلولار وقد تقدم تليف الكبد ، والمرحلة الاخيره من مرض كبدي أو سرطان الخلايا الكبدية. نظام العديد من (علي سبيل المثال ميثيونين والكولين نقص النظام الغذائي11) ومن المعروف للحث علي الامراض الكبدية مثل ناش في نماذج الحيوانية غير البشرية, ولكن معظم هذه النهج لا تلخص الظروف البشرية ناش والايضيه لها العواقب لأنها اما تتطلب محدده الجينات الضربة القاضية, التلاعب الغذائية غير الفسيولوجية أو عدم وجود مقاومه الانسولين نموذجيه من ناش الإنسان. وعلاوة علي ذلك ، فان فهمنا للأليات الاساسيه للامراض الايضيه يقوم حاليا علي التجارب التي أجريت مع فئران المختبرات الموجودة تحت ظروف المرض الخاصة الخالية من العوامل الممرضة (SPF). ان عائقه تسهيلات بشكل غير طبيعي صحية ولا يعتبر التنوع جرثوميه أناس سوفت تلاقيت, اي يمكن سببت صعوبات في الترجمة عمليه من دراسات حيوانيه إلى مقاربه سريريه12,13 , أربعه عشر
للتحقيق في مختلف الخلايا المناعية الفرعية في الانسجه الدهنية والكبد خلال تطوير مقاومه الانسولين و ناش في نموذج الماوس المتقدمة استنساخ الظروف المناعية البشرية ، وكانت الفئران التي تقع في أقفاص الفردية في شبه معقمه ظروف دون حاجز. الفئران التي تقع تحت مستضد الظروف المعرضة وضعت ناش مثل علم الامراض الكبد بالفعل بعد 15 أسابيع من الحمية الغذائية عاليه الدسم (HFD) التغذية13. بالمقارنة مع الفئران المتطابقة مع العمر SPF انها وضعت steatosis فوق الترقوة ، تسلل الكبد وتنشيط الخلايا المناعية.
تصف هذه المخطوطة تحليلا قويا لقياس التدفق الخلوي لتحديد وحساب مجموعات الخلايا المناعية من الانسجه الدهنية للماوس والكبد في نموذج من ناش. تحليل تدفق الخلوي يسمح الكشف عن المعلمات متعددة من الخلايا الفردية في وقت واحد علي النقيض من RT-PCR أو مناعي النهج.
وباختصار ، تقدم دراستنا نموذج الماوس لفتره قصيرة HFD للتحقيق في تطور مقاومه الانسولين و ناش واليات الكامنة التي تظهر أيضا الإخلاص للحالة البشرية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1025px;" width="1025">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">100&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">1ml syringe&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">26G x 5/8 needles&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">35mm Petri Dishes&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">40&#181;m cell strainers&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ACK lysis buffer&#160;</td>
			<td style="width:169px;">GIBCO</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103127</td>
			<td>AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Analysis software&#160;</td>
			<td>FlowJo 10.0.8 software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse CD11c Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">117309</td>
			<td>AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">138411</td>
			<td>AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse CD127 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135023</td>
			<td>AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV421 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">123131</td>
			<td>AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135219</td>
			<td>AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108739</td>
			<td>AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101239</td>
			<td>AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV711 anti-mouse/human B220 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103255</td>
			<td>AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">BV785 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100749</td>
			<td>AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:351px;">C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Forschungseinrichtungen f&#252;r experimentelle Medizin (FEM)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CaCl2&#160;</td>
			<td>Charit&#233; - Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td style="width:119px;">A119.1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Collagenase NB 4G Proved Grade&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SERVA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11427513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:351px;">Collagenase Typ I&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:119px;">LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 15ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Conical centrifuge tube 50ml&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DNAse&#160;&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Filter 30&#181;m&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Celltrics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">400422316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FITC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100203</td>
			<td>AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td style="width:169px;">BD-LSR Fortessa&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Bioanalytic GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">085021-0500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">High-fat diet&#160;</td>
			<td style="width:169px;">SSNIF</td>
			<td>E15741&#8211;34&#160;</td>
			<td>60 kJ% from fat, 19&#8201;kJ% from proteins, and 21&#8201;kJ% from carbohydrates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">micro dissecting scissors&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S3146</td>
			<td>used for dissection purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE anti-mouse CD25 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101903</td>
			<td>AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">104417</td>
			<td>AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">107629</td>
			<td>AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td>AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Percoll solution&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">103031</td>
			<td>AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">108427</td>
			<td>AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Round-Bottom Tubes with cell strainer cap</td>
			<td style="width:169px;">STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">38030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TruStain fcX anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">101301</td>
			<td>AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td style="width:169px;">Biolegend&#160;</td>
			<td style="width:119px;">423105</td>
			<td>viablity stain&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an advanced murine model for nonalcoholic steatohepatitis in association with type 2 diabetes

ترتبط السمنة بالتهابات المزمنة منخفضه الدرجة ومقاومه الانسولين ، مما يساهم في زيادة انتشار الامراض الايضيه المزمنة ، مثل مرض السكري من النوع 2 والتهاب الكبد غير الكحولي (ناش). وقد إنشات الأبحاث الاخيره ان الخلايا المناعية الموالية للالتهابات التسلل السمنة المفرطة الانسجه الدهنية والكبد. النظر إلى الاهميه الناشئة للخلايا المناعية في سياق التوازن الأيضي ، هناك حاجه ماسه لقياس وتوصيف تعديلاتها اثناء تطور مرض السكري من النوع 2 و ناش. ومع ذلك ، النماذج الحيوانية التي تحفز الميزات الفسيولوجية نموذجيه من ناش الإنسان متناثرة.
في هذه المقالة ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا لتحديد مجموعات الخلايا المناعية المعزولة من الكبد والانسجه الدهنية في نموذج الماوس موثوق بها من ناش ، التي انشاتها السكن حمية عاليه الدسم (HFD) الفئران تحت ظروف غير محدده خاليه من العوامل الممرضة (SPF) دون حاجز لمده سبعه أسابيع علي الأقل. ونحن نظهر التعامل مع الفئران في ظروف غير SPF ، والهضم من الانسجه وتحديد الضامة ، القاتل الطبيعي (NK) الخلايا ، الخلايا الجذعية ، B و T الخلايا الفرعية من خلال تدفق الخلوية. يتم توفير مخططات التدفق الخلوي التمثيلي من الفئران SPF HFD والفئران غير SPF. للحصول علي بيانات موثوقه والتفسيره ، فان استخدام الأجسام المضادة ، والطرق الدقيقة والدقيقة لهضم الانسجه والنابضة السليمة في تجارب قياس التدفق الخلوي هي عناصر حاسمه.
التدخل لاستعاده التعرض مستضد الفسيولوجية في الفئران عن طريق السكن لهم في ظروف غير SPF والتعرض غير محدده للمستضدات الميكروبية يمكن ان توفر أداه ذات صله للتحقيق في الصلة بين التعديلات المناعية ، التي يسببها النظام الغذائي السمنة والمضاعفات ذات الصلة علي المدى الطويل.

البروتوكول الموصوف يسمح بتوصيف علامات السطح للخلايا المناعية الفطرية والمتكيفة المعزولة عن الانسجه الدهنية بيريجونادال الmurine والكبد في نموذج من ناش الناجم عن النظام الغذائي. في هذا النموذج, وقد حفزت ناش من قبل أداره HFD بالاضافه إلى السكروز (6 ٪) في مياه الشرب لمده 7 إلى 15 أسبوعا في الفئران C...

Watch this Scientific Journal Video about An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes at JoVE.com

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

ويوصف نموذج الحيوانية القوارض التي يسببها النظام الغذائي بسيطه وموثوق بها للتهاب الكبد غير الكحولية (ناش) ، يتحقق من خلال الإسكان غير SPF من الماشية وأداره نظام غذائي محدد عاليه الدسم. ونحن نوضح تحديد الخلايا المناعية الكبدية والدهنية لتلخيص الظروف المناعية البشرية من خلال تعريض الفئران للجراثيم البيئية.

نموذج Murine متقدم للتهاب الكبد غير الكحولية بالتعاون مع مرض السكري من النوع 2

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في مجال الاستقلاب المناعي حول مساهمة الخلايا المناعية في الالتهاب الناجم عن السمنة في الدهنية والتهاب الكبد في الأنسجة الكبدية. وقد تم تحسين هذه التقنيات لعزل الخلايا المناعية الدهنية والكبد في نموذج من النظام الغذائي الناجم عن التهاب الكبد الدهني غير الكحولية التي تحققت من خلال غير محددة غير مسببات الأمراض اسكن القوارض. هذه الأساليب يمكن أن تساعد على تعميق فهمنا للآليات المناعية المشاركة في الحفاظ على التوازن الأيضي.عموما، سوف الأفراد جديدة لهذه التقنية النضال مع تعظيم العائد من الخلايا المنفصلة قابلة للحياة وظيفيا وإعداد الغات السليم في تدفق cytometry. لتوليد تعليق الأنسجة الدهنية وحيدة الخلية، رش الصدر من الماوس القتل الرحيم مع 70٪ الإيثانول، وجعل بعناية شق مركزي من خمسة إلى ستة سنتيمترات من خلال شق البطن وجدار البطن على طول القفص الصدري لفضح تجويف الجنبي والقلب. باستخدام إبرة قياس 26، حقن ما لا يقل عن 10 ملليلتر من محلول ملحي 0.9٪في قمة البطين الأيسر، واستخدام مقص لفتح تجويف البريتوني.ثم، تشريح الأنسجة الدهنية epigonadal، ووزنها. تفكيك الأنسجة الدهنية ميكانيكيا إلى قطع غرامة في طبق بيتري في أربع درجات مئوية قبل نقل شظايا الأنسجة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. شطف طبق بيتري مع ملليلتر واحد من 0.5٪ الألبومين مصل البقر، أو BSA، في برنامج تلفزيوني، وإضافة ثلاثة ملليلتر من محلول هضم الأنسجة الدهنية الطازجة المعدة في غرام من الأنسجة الدهنية إلى الأنبوب.بعد 20 دقيقة في 37 درجة مئوية و 200 التناوب في الدقيقة الواحدة، إضافة خمسة ملليلتر من 0.5٪ BSA في برنامج تلفزيوني، ووضع هضم الدهنية على الجليد. قم بتكفير الحل عدة مرات باستخدام ماصة مصلية 10 ملليلتر، واستخدم المكبس لتمرير الحل من خلال مصفّط 100 ميكرومتر. فصل كسور الأنسجة عن طريق الطرد المركزي، واستخدام ماصة لتجاهل الكسر الدهني العائم.Resuspend خلية كسر الأوعية الدموية stromal بيليه في ملليلتر واحد من الأمونيوم- كلوريد البوتاسيوم، أو ACK، تحلل العازلة، ووقف تفاعل تحلل مع 10 ملليلتر من مصل عجل الجنين 2٪، أو FCS، في برنامج تلفزيوني بعد بضع ثوان. ثم، وجمع خلايا الدم البيضاء المعزولة عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في 250 ميكرولترات من 2٪ FCS في برنامج تلفزيوني للعد. حصاد الكبد في أنبوب مخروطي من برنامج تلفزيوني على الجليد قبل استخدام الطوابع حقنة لتكفير الأنسجة ميكانيكيا في طبق بيتري في أربع درجات مئوية.نقل شظايا أنسجة الكبد تشريح في أنبوب 50 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من محلول هضم الكبد الدافئ، وشطف طبق بيتري مع ثلاثة ملليلتر من محلول هضم الكبد الطازج. بعد 20 دقيقة في 37 درجة مئوية و 200 دوران في الدقيقة الواحدة، ووقف الهضم مع 20 ملليلتر من HBSS، triturate الطين الأنسجة عدة مرات مع ماصة المصلية 10 ملليلتر. استخدام المكبس لتمرير حل الأنسجة من خلال مصفاة 100 ميكرومتر، وجمع خلايا الكبد عن طريق الطرد المركزي.Resuspend بيليه في 20 ملليلتر من HBSS الطازجة، وإزالة مصفوفة الكبد عن طريق الطرد المركزي. جمع عظمى للطرد المركزي، resuspending بيليه في 10 ملليلتر من 33٪ منخفضة الكثافة اللزوجة حل متوسط التدرج في HBSS. فصل خلايا الكبد المناعية بالانفصال الانحداري الكثافة، وإعادة تعليق الكريات البيض في ملليلتر واحد من ACK العازلة.بعد أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة، ووقف التحلل مع 10 ملليلتر من HBSS، وتصفية الخلايا من خلال مصفاة المسام 30 ميكرومتر في أنبوب 15 ملليلتر للطرد المركزي. ثم، resuspend بيليه في 250 microliters من 2٪ FCS في برنامج تلفزيوني للعد. لتحليل تدفق الخلايا للخلايا من السكان الكريات البيض المعزولة، إضافة ما يصل إلى ثلاثة أضعاف 10 الخلايا الست في 100 ميكرولترات من 2٪ FCS في PBS من الأنسجة ذات الاهتمام في فرز الخلايا الفلورية المنشطة البوليسترين الفردية، أو FACS، أنابيب.إضافة 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة CD16/CD32 إلى كل أنبوب لمنع أي ربط غير محددة لمدة 10 دقائق على الجليد، تليها تلطيخ مع حجم مناسب من خليط الأجسام المضادة وميكر واحد من صبغة قابلة للحياة لكل عينة للسماح التمييز الخلايا الحية والمميتة. بعد 20 دقيقة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء، وغسل العينات مرتين مع ملليلتر اثنين من 2٪ FCS بالإضافة إلى برنامج تلفزيوني لكل غسل، والطرد المركزي في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. ثم، resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى FCS.لتحليل الخلايا بواسطة عملية استئصال الخلايا المتدفقة، استخدم عينة تحكم سالبة غير ملوثة لتعيين التشتت الجانبي والواقع للأمام، وضبط الفولتية لمقياس التدفق للكشف عن مجموعة الكريات البيض القابلة للحياة واستبعاد الحطام. المقبل، تشغيل عينات واحدة التحكم الملون للتعويض متعدد الألوان قبل تشغيل العينات التجريبية، وجمع ما لا يقل عن خمس مرات 10 إلى الأحداث الأربعة لكل أنبوب. ثم، تصدير ملفات البيانات FCS للتحليل، وتعيين استراتيجية الغات لC45-إيجابية الكريات البيض للسماح بتحديد مجموعات الخلايا المناعية اللاحقة من الفائدة.هنا، تظهر استراتيجية تمثيلية لغايات البوابات الفرعية للخلايا T بما في ذلك التمييز المزدوج وتلطيخ الجدوى في دهون المورين بيريغو نادال. CD45-إيجابية الكريات البيض هي الأولى بوابات لD4 و CD8 وبعد ذلك لD44 و CD62 ليغاند للتمييز بين السذاجة والذاكرة المركزية، والذاكرة effector، والخلايا T effector. ثم تتميز الخلايا إيجابية CD44 كذلك مع CD127, القاتل lectin الخلية مستقبلات G1, ومبرمج الموت-1.هنا ، يتم عرض استراتيجية البوابات لتحليل الخلايا B ، الحبيبات ، والخلايا القاتلة الطبيعية ، الضامة ، والخلايا التشعبية. يمكن الكشف عن نسبة أعلى من ذاكرة التأثير CD4 إيجابية وCD8 إيجابية الخلايا في الفئران النظام الغذائي عالية الدهون الموجودة في ظروف غير SPF، في حين أن الخلايا التائية CD4 إيجابية وD8-إيجابية CD8 وجدت أن تكون أقل بكثير في هذه الحيوانات مقارنة بفئران النظام الغذائي SPF عالية الدهون في الأسبوع السابع. steatosis شديدة، بما في ذلك زيادة قطرات الدهون الكبيرة مما أدى إلى الستيراتوس الماكروبير، التهاب فيلي، بالونات الكبدية، وتدمير بنية الفصية وجدت في الفئران المكشوفة النظام الغذائي عالية الدهون في حين أن بعض الفئران SPF فقط عرض تراكم الدهون خفيفة في الكبد.بالإضافة إلى ذلك ، فإن النسبة المئوية للخلايا القاتلة الطبيعية أعلى في الأنسجة الدهنية في النظام الغذائي عالي الدهون التي تتعرض للفئران ، في حين أظهرت الفئران SPF ذات النظام الغذائي عالي الدهون نسبًا أعلى من الخلايا التشعبية. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم للحفاظ على الخلايا على الجليد وفي الظلام ما لم يذكر خلاف ذلك. يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية إعداد التعليقات خلية واحدة بشكل صحيح وكيفية عزل مورين الدهنية والأنسجة الكبدية لتجارب تدفق الخلايا.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

المسلكة الفأرية العدوى : نموذج من الحصانة من النوع 2 والتهاب في القناة الهضمية

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

المعجل نوع 1 الحث السكري في الفئران عن طريق نقل بالتبني من CD4 + T خلايا سكري

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

استخدام الخلوي على الصورة لعرض الكمي من الفطريات الممرضة في جمعية مع الخلايا المضيفة

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

مضان المجهري طرق لتحديد الجدوى من البكتيريا في جمعية مع خلايا الثدييات

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

العدوى فيفو السابقين الفئران البشرة مع فيروس الهربس البسيط من النوع 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

تطبيق اضطرابات متناسقة تشبه التدليك على عجول الماوس ومراقبة التغيرات الناتجة عن الضغط العضلي العضلي

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

توليد عالي الكفاءة من الخلايا T السامة للماوس الأولية الخاصة بالمستضد للاختبار الوظيفي في نموذج مرض السكري المناعي الذاتي

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...